بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مكتبة متحولة عشوائية لتسلسل DNA مستهدف معين ، وتحديد وتوصيف الطفرات بسرعة باستخدام الاختيار الوظيفي شبه الكمي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحويل البلازميد أولا مع القولونية ، وهو أحد أصل النسخ المتماثل الذي يحتوي على التسلسل المستهدف إلى سلالة الطفر. بعد طلاء الخلايا واحتضانها طوال الليل ، يتم حصادها وعزل البلازميد المستهدف للحصول على المكتبة الطافرة ، ثم يتم تحويل المكتبة الطافرة إلى سلالة قراءة لتوصيف الطفرات في الجزء الثاني من البروتوكول ، ويتم إنشاء لوحة نمو متدرجة ويتم تحميل الثقافات البكتيرية لسلالة القراءة في طبق بتري منفصل يحتوي على aer ناعم.

الخطوة الأخيرة من الإجراء هي ختم نقل هذه الثقافات البكتيرية إلى التدرج. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيرات في ملف تعريف النمط الظاهري لتسلسل مستهدف معين من خلال الاختلافات في النمو على تدرج الدواء. يقدم هذا الفيديو طريقة للتطور الموجه للبروتينات في الإشريكية القولونية.

تحاكي هذه العملية التطور الطبيعي في إنشاء مكتبات المغذيات العشوائية ، متبوعا باختيار يقيد هذا التنوع. وبالتالي ، فإنه يحسن قدرتنا على توليد أنشطة كيميائية حيوية جديدة للأغراض الصناعية أو الطبية الحيوية. يتكون هذا الإجراء من مكونين ، إنشاء مكتبة متحولة عشوائية والاختيار الوظيفي للحصول على اكتساب طفرات وظيفية توضح هذا الإجراء ستكون جينيفر ألين ، فنية من مختبري.

قبل بدء هذا البروتوكول ، اعتقد أن خلايا JS 200 ذات الكفاءة الكهربائية تعبر عن متغير منخفض الدقة لبوليميراز الحمض النووي واحد أو قطب منخفض الدقة ، وهو واحد تم إعداده مسبقا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ، تحتوي هذه الخلايا على أليل حساس لدرجة الحرارة من القطب الأول ، بحيث يسود نشاط واحد منخفض الدقة على 37 درجة مئوية ، بناء. البلازميد المستهدف الذي يحتوي على القولونية ، أصل واحد من النسخ المتماثل مع التسلسل المستهدف المستنسخ بجوار أصل النسخ المتماثل ، قطب منخفض الدقة يبدأ القولوني ، تكرار البلازميد الواحد. وبالتالي إدخال الطفرات لبدء الطفر.

اجمع بين 40 ميكرولترا من الخلايا المختصة بالكهرباء وما بين 30 إلى 250 نانوجراما من الحمض النووي للبلازما المستهدفة في فجوة ملليمترين. نبض البيطري للتثقيب الكهربائي ، الخليط الموجود في الكهرباء عند 1800 فولت. تحقق من ثابت الوقت أو TC لضمان ظروف موحدة لكل عينة.

من الناحية المثالية ، يساوي TC من خمسة إلى ستة مللي ثانية. اسمح لخليط الحمض النووي للخلية بالتعافي في ملليلتر واحد من مرق LB لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية تهتز عند 250 دورة في الدقيقة. احصل على طبق 100 ملم LV agro Petri المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية يحتوي على مضادات حيوية مناسبة لاختيار كل من البلازميدات لوحة الخلايا المستردة عند تخفيف مناسب للحصول على تركيز قريب من العشب ، والذي يتم تعريفه على أنه عدد مميز ولكن لا يحصى من المستعمرات كما هو موضح في هذا المثال.

بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، احصد المستعمرات البكتيرية لأطباق بتري مع مرق LB. عزل البلازميد والحمض النووي من الخلايا المحصودة والبلازميد الناتج. يشكل الحمض النووي مكتبة الطفرة العشوائية.

قم بإجراء ملخص تقييدي عن طريق قطع مكتبة البلازميد بإنزيم تقييد يخضع خطية لكل من البلازميد المستهدف والقطب. يقوم بلازميد واحد بتشغيل هلام آرو تحليلي على الحمض النووي البلازميد المعزول لتأكيد الجودة والكمية. بمجرد التحقق من البلازميدات ، قم بهضم ميكروغرام واحد من المكتبة بإنزيم تقييد يضفي خطية على القطب بلازميد واحد ، لكنه لا يقطع البلازميد المستهدف.

بعد اكتمال ملخص التقييد ، قم بتنظيف المكتبة باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي. أخيرا ، قم بتحويل المكتبة النظيفة إلى سلالة قراءة لتوصيف الطفرات. لبدء تحضير التدرج ، ضع علامة على 10 ممرات متباعدة بالتساوي عبر حافة واحدة من قاع طبق بتري المربع.

ضع الطبق على منحدر بحيث تكون الحافة السفلية المميزة مرتفعة بسبعة ملليمترات. صب 25 مل من أجار رطل دافئ ممزوج جيدا بتركيز مناسب من عامل الاختيار في الطبق المنحدر. هذه هي الطبقة السفلية من التدرج.

تأكد من أن أجار LB يغطي طبق بتري بحيث يحتوي الطرف المرتفع المميز للطبق على ما يقرب من ملليمتر واحد من أجار LB ، ويحتوي الجزء المنخفض على حوالي ثمانية ملليمترات. قم بتغطية اللوحة بالغطاء KU للتهوية واترك الزراعة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد أن تصلب الطبقة السفلية من LB أجار ، انقل الطبق إلى سطح مستو.

بعد ذلك ، صب 25 مل من رطل أجار دافئ بدون عامل الاختيار لتراكب السطح الزراعي الأول ، مع التأكد من تغطية الطبقة السفلية بأكملها. قم بتغطية اللوحة بالغطاء KU للتهوية ، ثم اترك الزراعة تثبت لمدة 10 إلى 15 دقيقة لإجراء نقل الطوابع للبكتيريا. أولا ، احصل على الثقافات البكتيرية لسلالة القراءة وتخفيفها ليكون لها كثافة خلايا متطابقة بكثافة بصرية عند 600 نانومتر أقل من 1.0.

بعد ذلك ، انقل ملليلترين من الأجار السائل الناعم المتوازن إلى 42 درجة مئوية إلى قاع طبق بتري دائري 100 ملم ، وقم بإخراج 40 ميكرولترا من المزرعة البكتيرية إلى النعومة ثم امزجها عن طريق هز اللوحة. قم بتغطية الحافة الطويلة للشريحة المجهرية الزجاجية بخليط أكثر ليونة. ثم قم بمحاذاة الحافة المطلية للشريحة مع العلامة السفلية على طبق التدرج.

المس الشريحة على سطح الأجار. لمسة ناعمة كافية لنقل شريط من الأجار الناعم إلى سطح التدرج. ثم يتم وضع الشريحة جانبا للتنظيف وإعادة الاستخدام.

كرر هذه العملية. يجب تضمين العينات المتبقية ، الضوابط التجريبية في كل طبق متدرج. إذا تم تشغيل تدرجات متعددة ، فقم باحتضان طبق التدرج من أعلى لأسفل طوال الليل عند 37 درجة مئوية مرة وقد تختلف درجات حرارة الحضانة باختلاف السلالات البكتيرية للقراءة ، ولكن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية عادة ما تكون كافية للنمو المرئي.

أخيرا ، قم بتصوير وتحليل نمو الخلية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تفعيلك. فيما يلي صور لسلالة قراءات تم تحويلها إما باستخدام P-G-F-U-V غير مكتومة أو مكتبة PG FPUV المتحولة التي تم نقلها. تشير أربع جولات من الطفرات المستعمرات المظلمة أو الخافتة إلى وجود طفرات معطلة GFP.

يمثل هذا الشكل تواتر الطفرات في جميع أنحاء التسلسل المحايد للبلازميد المستهدف على فترات 100 زوج أساسي. لاحظ أن الطفرات تحدث عبر تسلسل البلازميد بأكمله ، ولكن عند أعلى تردد أقرب إلى أصل النسخ المتماثل. هنا ، يظهر نمو الطفرات مقابل تدرج الدواء.

المسافة التي نمت باتجاه الجزء العلوي من التدرج إلى ملف تعريف مقاومة الأدوية التفاضلية بين الطفر. في هذا المثال ، تم فحص مكتبات البلازميد لديميثيلاز الأكسدة البشرية ABH الثانية بحثا عن الطفرات ذات المقاومة المتزايدة لسلفونات ميثيل ميثان باستخدام تدرجات اختيار الأدوية. اثنان. تظهر هذه المكتبات التي تمثل تكرارين وأربعة تكرارات لبروتوكول الطفرات مقارنة بالنوع البري الأبوي والمتجه الفارغ.

الخط الأبيض إلى العتبة التي تم عزل المستعمرات الطافرة الفردية فوقها. لمزيد من التحليل الظاهري ، يتم عرض طفرات بيتا لاكتاماز ، R 1 64 H و E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R التي تم تحديدها مسبقا باستخدام طفرات منخفضة الدقة P وطفرات واحدة واختيار astri و m على 0.4 ميكروغرام لكل مليلتر وأربعة ميكروغرام لكل مليلتر. تدل حماية التدرج السيفوتاكسيم ضد السيفوتاكسيم على نشاط بيتا لاكتاماز الممتد الطيف.

لاحظ أن إنزيم بيتا لاكتاماز من النوع البري لا يمنح أي حماية بالنسبة للخلايا التي تعبر عن ناقل فارغ. لذلك ، تمثل هذه الطفرات تكيفا أو تطور نشاط كيميائي حيوي جديد. لقد قدمنا هنا مزيجا قويا من الطفرات والاختيار الوظيفي لهذا الجيل من الأنشطة الكيميائية الحيوية الجديدة.

يمكن الحصول على الانتقاء الوظيفي إما من خلال اختيار الدواء أو من خلال التكامل الجيني ، ويستفيد من قدرتنا على توليد تنوع جيني كبير. قد يتعين تقييد التسبب في المرض على تسلسل معين من أجل تحسين أنشطة البروتين الموجودة مسبقا أو للتسبب في المرض الموجه للموقع. يمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق الاستنساخ.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فصل الطفرات عن الاختيار الوظيفي من أجل الحصول على هجمات التوقيع أو آثار الأقدام الطفرية.