Name: توجه طريقة تطور في خميرة الخباز: المسخ مكتبة الخلق والفرز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: اكتشف بروتوكولاً موثوقاً لبناء وفرز مكتبات الطفرات في Saccharomyces cerevisiae باستخدام خوارزميات حاسوبية لتحديد مناطق الهدف. هذه الطريقة البسيطة تُمكّن الباحثين من تطوير بروتينات ذات صفات مرغوبة بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع المفوضية الأوروبية Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; التحفيز الحيوي لأنظمة CM1303; والمشاريع الوطنية Dewry [BIO201343407-R] و Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. المسخ مكتبة البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مناطق يتعرضون لتتحول مع مساعدة من خوارزميات حسابية على أساس المتاحة التركيب البلوري أو التماثل نماذج 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استهداف منطقتين من AAO من محاري ايرنغي عن الطفرات العشوائية وإعادة التركيب (الأرصاد [α1] -Val109، Phe392-Gln566)، في حين أن تضخيم ما تبقى من الجينات (844 بي بي) عن ارتفاع الدقة PCR (الشكل 1). ملاحظة: عدة قطاعات يمكن دراستها عن طريق تتحول بطريقة مستقلة أو مجتمعة 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المناطق المستهدفة من قبل مطفرة PCR. إنشاء المناطق الواقعة بين شرائح (~ 50 نقطة لكل منهما) متداخلة عن طريق إضافة ردود الفعل PCR في مناطق محددة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مطفرة PCR من شرائح المستهدفة في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر التي تحتوي على قالب الحمض النووي (0.92 نانوغرام / ميكرولتر)، و 90 نانومتر بنسبة ضئيلة معنى (RMLN لقطاع MI وAAO-BP لشريحة M-II)، و 90 نانومتر لntisense التمهيدي (AAO-92C لقطاع MI وRMLC لشريحة M-II)، 0.3 ملي dNTPs (0.075 مم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 1.5 ملي MgCl 2، 0.05 ملي MnCl 2 و 0.05 U / ميكرولتر طق الحمض النووي بوليميريز. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، 74 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 74 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المناطق غير مطفرة مع فائق البلمرة الإخلاص وتشمل المناطق المقابلة تداخل القطاعات تسبب الطفرات الوراثية و / أو يتدلى ناقلات خطي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مخاليط رد فعل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر تحتوي على قالب الحمض النووي (0.2 نانوغرام / ميكرولتر)، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة الشعور HFF، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة العقاقير HFR، 0.8 ملي dNTPs (0.2 ملم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) و 0.02 U / ميكرولتر iproof البلمرة DNA. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في &lt;قوي&gt; الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (1 دورة)؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة). ملاحظة: مع الشروط الموضحة في 1.2 و 1.3 التداخل من 43 سنة مضت (المنطقة البلازميد-M1)؛ 46 سنة مضت (M1 المنطقة منطقة HF)؛ 47 سنة مضت (HF المنطقة-M2 المنطقة) و61 سنة مضت (M2 البلازميد كل إقليم) مصممة (الشكل 1) لصالح في الربط المجراة في الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية كافة شظايا PCR (مطفرة وغير مطفرة) مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي ناقلات بحيث مناطق ما يقرب من 50 نقطة المرافقة يتم إنشاؤها التي هي مثلي إلى 5&#39;- و3&#39;ينتهي من الجين المستهدف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط التفاعل الخطية التي تحتوي على 2 ميكروغرام الحمض النووي، 7.5 U بام مرحبا، 7.5 U Xho الأول، 20 ميكروغرام BSA و 2 ميكرولتر من الاحتياطي بام مرحبا 10X في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة و 40 دقيقة. بعد ذلك، انتقل مع تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية ناقلات خطي عن طريق استخراج هلام الاغاروز لتجنب التلوث مع البلازميد دائري المتبقية (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مزيج رد فعل الهضم في ميجا جيدا من شبه إعدادي انخفاض درجة انصهار agarose هلام (0.75٪، ث: •)، فضلا عن قسامة (5 ميكرولتر) من مزيج رد فعل في المتاخمة كذلك المراسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الحمض النووي الكهربائي (5 فولت / سم بين الأقطاب، 4 ᵒC) وفصل agarose هلام الموافق الضخمة جيدا وتخزينها في 4 ᵒC في 1X تاي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على حارة مع سلم الوزن الجزيئي والصحفي. تصور العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. نيك الموقف حيث متجه الأماكن خطي. ملاحظة: كما أن نوعية ناقلات خطي تنقيته هو critiعامل كال لإعادة التركيب الناجح والتجمع في الخميرة، وتجنب تلطيخ هلام لالكهربي الحمض النووي شبه إعدادي. استخدام الأصباغ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لاستخراج الهلام قد تؤثر على استقرار ناقلات الحمض النووي، والمساس في الجسم الحي كفاءة إعادة التركيب. كبديل لالأصباغ EtBr السامة، يتم استخدام جل الأحمر والأصباغ SYBR عادة لتلطيخ هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة عدم وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد ناقلات خطي في جزء الضخمة جيدا باستخدام بتوجيه من النكات في حارة مراسل الملون بحيث يمكن أن تكون معزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج ناقلات خطي من الاغاروز وتطهيره مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: استخدام نسخة عالية-ناقلات المكوك episomal مع علامات المضادات الحيوية وauxotrophy: في هذا المثال قمنا باستخدام اليوراسيل مستقل والأمبيسلين المقاومة pJRoC30 ناقلات تحت سيطرة المروج الخميرة GAL1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ميل متساوي الموليةxture من شظايا PCR ومزجها مع ناقلات خطي في نسبة 2: 1، مع ما لا يقل عن 100 نانوغرام البلازميد خطي (اختبار نسب مختلفة من مكتبة متساوي المولية / ناقلات مفتوحة لتحقيق عوائد التحول جيدة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من شظايا PCR وناقلات خطي في 260 نانومتر و 280 نانومتر لتحديد تركيز والنقاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا المختصة الخميرة مع الخليط الحمض النووي باستخدام عدة خميرة التحول التجاري (أنظر الجدول لوازم) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استخدام البروتيني ناقصة وURA3 - S. تعتمد الخباز السلالة، BJ5465. تحويل الخلايا مع ناقلات circularized الوالدين كمعيار داخلي أثناء الفرز (أنظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، تحقق الخلفية من خلال تحويل ناقلات خطي في حالة عدم وجود شظايا PCR. ملاحظة: في حالة اكتشاف مستويات إفراز منخفضة الأولية، استخدم س.الخباز البروتيني سلالات ناقصة مثل BJ5465 لتعزيز تراكم البروتينات النشطة في supernatants الثقافة. إذا كان انزيم الهدف يخضع hyperglycosylation، واستخدام سلالات بالغليكوزيل ناقصة (على سبيل المثال، Δ kre2 التي هي قادرة على ربط الأوليغومرات المانوز أصغر فقط) يمكن أن يكون خيارا مناسبا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا تحولت على لوحات SC التسرب واحتضان لهم عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. لوحة (على SC التسرب لوحات تستكمل مع اليوراسيل) URA3 - S. خلايا خميرة تفتقر البلازميد كعنصر تحكم السلبية للفحص (أنظر أدناه). </li></ol> 2. عالية الإنتاجية الفحص الفحص (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء عدد مناسب من لوحات 96-جيدا العقيمة (23 وحات لتحليل مكتبة من 2000 استنساخ) مع 50 ميكرولتر الحد الأدنى من المتوسط ​​لكل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المستعمرات الفردية من SC التسرب لوحات وتحويلها إلى لوحات 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل لوحة، تطعيم العمود رقم 6 مع نوع الوالدين كمعيار داخلي وH1 بشكل جيد مع URA3 - S. خلايا خميرة (في المتوسط ​​SC تستكمل مع اليوراسيل) مع عدم وجود البلازميد كعنصر تحكم السلبية. ملاحظة: شغل حسنا H1 تحديدا مع وسائل الاعلام التسرب تستكمل مع اليوراسيل. وفارغة تحتوي كذلك وسائل الإعلام دون الخلايا يمكن أن تكون مستعدة أيضا كعنصر تحكم العقم إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحات مع أغطية والتفاف عليها في بارافيلم. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية، 225 دورة في الدقيقة والرطوبة النسبية 80٪ في شاكر رطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بارافيلم، إضافة 160 ميكرولتر من المتوسط ​​التعبير إلى كل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل، ختم لوحات واحتضان لهم لمدة 24 ساعة أخرى. ملاحظة: يتم إعداد المتوسطة الحد الأدنى والمتوسط ​​التعبير كما ذكرت في مكان آخر (19). قد تختلف مستويات إفراز اعتمادا على الجينات قيد الدراسة وفقا لذلك، رانه الحضانة يجب أن يكون الأمثل مرات في كل حالة لمزامنة نمو الخلايا في جميع الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات (لوحات رئيسية) في 2800 ز س لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من طاف من الآبار في لوحة الرئيسي إلى لوحة المتماثلة باستخدام السائل التعامل مع multistation الروبوتية. ملاحظة: لصالح إفراز انزيم فإنه من المستحسن أن تحل محل الببتيد إشارة الأصلي من البروتين الهدف من الببتيدات إشارة تستخدم عادة للتعبير مغاير في الخميرة (على سبيل المثال، فإن العامل α prepro زعيم، زعيم K 1 القاتل السم من س. الخباز، أو حتى إصدارات خيالية من كلا الببتيدات 13). بدلا من ذلك، إشارة الببتيد الأصلي ويمكن أن تتطور بشكل حصري لإفراز في الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من 2 مم ص -methoxybenzylalcohol في 100 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 6.0 بمساعدة الروبوت pipetting ل. تحريك لوحات لفترة وجيزة مع 96-نحنليرة لبنانية لوحة خلاط واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الروبوت pipetting ل، إضافة 160 ميكرولتر من كاشف FOX إلى كل لوحة نسخة ويقلب لفترة وجيزة مع الخلاط (تركيز النهائي من FOX الخليط في البئر: 100 ميكرومتر زايلينول البرتقال، و 250 ميكرومتر الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 و25 مم H 2 SO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عدة إضافات إلى كاشف لتعزيز حساسية، مثل العضوية المشارك المذيبات ([دمس، والإيثانول والميثانول) أو السوربيتول 17. هنا، تضخيم الاستجابة عن طريق إضافة السوربيتول إلى تركيز النهائي من 100 ملي (الشكل 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحات (وضع نقطة النهاية، ر 0) في 560 نانومتر على قارئ لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في RT حتى يتطور لون وقياس امتصاص مرة أخرى (ر 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النشاط النسبي من الفرق بين القيمة المطلقة بعد الحضانة، وأنه من القياس المبدئي تطبيع لحلجنوع ntal لكل لوحة (Δt 1 - ر 0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض يضرب أفضل متحولة إلى مرتين متتاليتين إعادة الفحوصات لاستبعاد ايجابيات كاذبة. ملاحظة: عادة، تتضمن إعادة الفحص والعزل البلازميد من الخميرة، والتضخيم والتنقية في كولاي، تليها التحول من خلايا الخميرة الطازجة مع البلازميد 19. يعاد فحص-كل استنساخ مختارة في pentaplicate. </li></ol>

<ol><li>Jäckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts+by+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li>
<li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li>
<li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+enzyme+universe%3A+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li>
<li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+selection+of+the+host+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).</li>
<li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering%3A+lessons+from+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution%3A+an+efficient+tool+to+improve+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li>
<li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li>
<li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li>
<li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+assembler%2C+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li>
<li>Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Ruiz%2C+E+%22Cascade+Biocatalysis%3A+integrating+stereoselective+and+environmentally+friendly+reactions%22">Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions</a>. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).</li>
<li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aryl-alcohol+oxidase%3A+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+%28MORPHING%29+for+directed+enzyme+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919(2014).</li>
<li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li>
<li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+for+designing+smart+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li>
<li>Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pocket+manual+of+directed+evolution%3A+Tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+of+Microbial+Enzymes%3A+Production%2C+Biocatalysis+and+Industrial+Applications%22%5BJournal%5D)">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في هذه المقالة، نحن لخصت معظم النصائح والحيل المستخدمة في المختبر لدينا لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه في س. الخباز (باستخدام AAO كمثال) بحيث يمكن تكييفها للاستخدام مع العديد من أنظمة انزيم حقيقية النواة الأخرى ببساطة عن طريق اتباع النهج المشترك هو موضح هنا. من حيث إنشاء مكتبة، وتتحول بسرعة طريقة وعاء واحد لتقديم وتتحد الطفرات العشوائية في مساحات صغيرة من البروتين في حين ترك المناطق المتبقية م...

التطور الجزيئي الموجه هو وسيلة قوية وسريعة وموثوق بها لتصميم الإنزيمات 1، 2، ومن خلال جولات متكررة من الطفرات العشوائية، إعادة التركيب والفحص، إصدارات محسنة من الإنزيمات يمكن أن تتولد التي تعمل على ركائز جديدة، في تفاعلات جديدة، في غير طبيعي البيئات، أو حتى لمساعدة الخلية لتحقيق أهداف الأيض جديدة 3-5. بين المضيفين استخدامها في التطور الموجه، والبيرة خميرة الخباز يوفر ذخيرة من الحلول للتعبير الوظيفي للبروتينات حقيقية النواة المعقدة التي لا تتوفر إلا في نظرائهم بدائية النواة 6،7. تستخدم شاملة في دراسات بيولوجيا الخلايا، وهذا النموذج حقيقية النواة الصغيرة لديها العديد من المزايا من حيث التعديلات بعد متعدية، وسهولة التلاعب والتحول الكفاءة، وكلها صفات هامة لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه 8. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وتيرةإعادة التركيب الحمض النووي مثلي في س. الخباز بالإضافة إلى جهاز فعال في تصحيح التجارب المطبعية يفتح مجموعة واسعة من الاحتمالات لإنشاء مكتبة والتجمع الجينات في الجسم الحي، وتعزيز تطور أنظمة مختلفة من الانزيمات واحدة لمسارات صناعية معقدة 9-12. أنفقت مختبرنا العقد الماضي أدوات واستراتيجيات تصميم للتطور الجزيئي للligninases مختلفة في خميرة (إنزيم أكسدة-اختزال تشارك في تدهور اللجنين خلال تسوس الخشب) 13-14. في هذه الاتصالات، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لإعداد والمكتبات شاشة متحولة في س. الخباز لنموذج flavooxidase، أوكسيديز -aryl من الكحول (AAO 15) -، والتي يمكن ترجمتها بسهولة إلى العديد من الإنزيمات الأخرى. ويشمل البروتوكول طريقة التطور الموجه تركيزا (تحوير: الطفري المنظمة التوحد عملية كتبها مثلي في الجسم الحي التجمع) بمساعدة من جهاز خلية الخميرة 16، لدا حساس جدا الفحص الفحص بناء على رد فعل فنتون من أجل الكشف عن النشاط AAO تفرز في مرق الثقافة 17.

<table><tbody><tr><td><قوي>1. وسائط الاستزراع</قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>أمبيسلين ملح الصوديوم</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>A0166</td><td>CAS N & ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D- (+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N & ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D- (+) -الجلوكوز</td><td>سيجما - ألدريتش</td><td>G5767</td><td>CAS N & ordm ؛ 50-99-7 مغرب 180.16</td></tr><tr><td>D- (+) - رافينوز خماسي هيدرات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>83400</td><td>CAS N & ordm ؛ 17629-30-0 مغرب 594.51</td></tr><tr><td>بيبتون</td><td>ديفكو</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P0662</td><td>CAS N & ordm ؛ 7778-77-0 مغرب 136.09</td></tr><tr><td>يوراسيل</td><td>مستخلص الخميرة Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>الخميرة الاصطناعية المتسربة من المكملات الغذائية المتوسطة بدون اليوراسيل</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>الاسم</td><td>الشركة</td><td> رقم الكتالوج</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NTP مزيج</td><td>الجينوم الرشيق</td><td>200415-51</td><td>25 ملي مولار لكل</td></tr><tr><td>منهما iProof بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدرات</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>M8054</td><td>CAS N & ordm ؛ 13446-34-9 م.د. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>للخطأ عرضة PCR</td></tr><tr><td><قوي>الاسم</قوي></td><td><قوي>الشركة</td><td> Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. خطية البلازميد < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BamHI إنزيم التقييد</td><td>نيو إنجلاند بيولابس</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الألبومين</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI إنزيم التقييد</td><td>نيو إنجلاند بيولابس</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>ليس أنا إنزيم تقييد</td><td>نيو إنجلاند بيولابس</td><td>R0189S</td><td></td></tr> جل <tr><td>أحمر</td><td>البيوتسيوم</td><td>41003</td><td>لتلوين الحمض النووي</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4. فحوصات FOX< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>كبريتات الأمونيوم الحديد (II) سداسي هيدرات</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>F3754</td><td>CAS N & ordm ؛ 7783-85-9 مغرب 392.14</td></tr><tr><td>كحول أنيسيل</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>W209902</td><td>CAS N & ordm ؛ 105-13-5 مغرب 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N & ordm ؛ 50-70-4 MW 182.17</td></tr><tr><td>بيروكسيد الهيدروجين 30٪</td> <td>ميرك Millipore</td><td>1072090250</td><td>منحنى FOX القياسي</td></tr><tr><td>Xylenol ملح ثنائي الصوديوم البرتقالي</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N & ordm ؛ 1611-35-4 MW 716.62</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>5. الاغاروز هلام الاشياء< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>الاغاروز</td><td>نورجين</td><td>28035</td><td>CAS N & ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>جل الأحمر</td><td>البيوتيوم</td><td>41003</td><td>صبغة تحليل الحمض النووي</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb سلم</td><td>حراري علمي</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. صبغة تحميل قياسية</td></tr><tr><td>6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>درجة حرارة انصهار منخفضة الاغاروز</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N & ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>6. مجموعات وخلايا < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae سلالة BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC سلالة</td><td>نقص البروتياز 208289 مع النمط الجيني: MAT & alpha ؛ ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4 :: HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue الخلايا المختصة</td><td>علم الجينوم الرشيق</td><td>200150</td><td>لتنقية البلازميد وتضخيمه</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel و PCR Clean-up</td> <td>KitMacherey-Nagel</td><td>740،609،250</td><td>استخراج هلام الحمض النووي</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740،588،250</td><td>مجموعة أدوات التحضير المصغر للعمود</td></tr> مجموعة تحويل <tr><td>الخميرة</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>حامل الحمض النووي المتضمن (خصيتين السلمون)</td></tr><tr><td>Zymoprep خميرة البلازميد miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>استخراج البلازميد من الخميرة</td></tr> <tr><td>Name</ قوي></td><td><قوي>الشركة</td><td> رقم الكتالوج</td><td>Comments</td></tr><tr><td>7. ألواح < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>96 بئر</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>البوليسترين الشفاف وغير المعقم (لقياسات النشاط)</td></tr> <tr><td>ألواح 96 بئرا</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>شفاف ، معقم ، بوليسترين (للتخمير الدقيق)</td></tr> <tr><td>غطاء لوحة 96 بئر</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>شفاف ، معقم ، بوليسترين (للتخمير الدقيق)</td></tr></tbody></table>

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

التطور الموجه في خميرة الخباز يقدم العديد من المزايا الجذابة عند تصميم الانزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية، وهي عملية تنطوي على البناء، والاستنساخ والتعبير المكتبات متحولة، بالإضافة إلى ارتفاع وتيرة مثلي إعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء والمكتبات شاشة متحولة في الخميرة على أساس مثال على فطرية أريل الكحول أوكسيديز (AAO) لتعزيز نشاطها الكامل. تعرض جزأين البروتين لتطور ركزت توجيهها بواسطة الطفرات العشوائية وإعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. سمحت يتدلى من ~ 50 نقطة المرافقة كل قطعة إعادة التجميع الصحيح من الجين AAO الانصهار في ناقلات خطي مما أدى إلى كامل البلازميد تكرار مستقل. تم فحص المكتبات متحولة المخصب مع المتغيرات AAO الوظيفية في س. supernatants الخباز مع حساسية فحص عالية الإنتاجية بناء على رد فعل فنتون. عملية العامة للبناء المكتبة في س. وصف الخباز هنا يمكن تطبيقها بسهولة أن تتطور العديد من الجينات حقيقية النواة الأخرى، وتجنب ردود الفعل PCR إضافية، في المختبر إعادة التركيب الحمض النووي وربط الخطوات.

AAO من P. eryngii هو flavooxidase خارج الخلية التي تزود مستخلصات الفطرية مع H 2 O 2 لبدء الهجوم على اللجنين. تعرض اثنين من شرائح AAO إلى التطور الموجه تركز على أيدي تتحول من أجل تعزيز نشاطها والتعبير في س. الخباز 19. بغض النظر عن الانزيمات الخارجية آوى من قبل س. الخباز، فإن القضية الأكثر أهمية عند بناء المكتبات متحولة في الخميرة يتعلق هندسة المناطق المتداخلة محددة لصالح الربط بين ...

نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء وفحص المكتبات الطافرة لحملات التطور الموجهة في خميرة الخميرة.

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية إنشاء وفحص مكتبات طافرة في خميرة Saccharomyces Cerevisiae لتجارب التطور الموجه. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الإنشاء المختبري المستخدم في تجارب التطور الموجه المركزة، مثل كيفية تعيين المناطق المتداخلة للتجميع والاستنساخ. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في بساطتها وقوتها، حيث يمكن تعيين مستويات ذات جودة جيدة في خطوة تحول واحدة فقط.سيتم استعراض هذا البروتوكول الخاص بإنشاء وفحص مكتبات الطفرات باستخدام إنزيم أريل-ألكوهول أوكسيداز (AAO) الفطري. يتم أولاً اختيار المناطق المخصصة للتطور الموجه المركز بمساعدة خوارزميات حوسبية تعتمد على البنية البلورية المتاحة أو نماذج التماثل للإنزيم. سيتم استهداف منطقتين من AAO لإجراء الطفرات العشوائية وإعادة الاندماج: المنطقة M1 والمنطقة M2.سيتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المطفّر (Mutagenic PCR) لتضخيم المناطق المستهدفة. ولتعزيز عملية الربط (splicing) داخل الحيوية في الخميرة، سيتم إنشاء مناطق تداخل بين القطع بطول 50 زوج قاعدي تقريباً لكل منها عن طريق تراكب تفاعلات PCR للمناطق المحددة. قم بتحضير تفاعلات Mutagenic PCR بحجم 50 µL، بحيث يحتوي كل تفاعل على 46 ng من قالب DNA، و 90 nM من كل من البادئات الأمامية (sense) والعكسية (antisense)، و 0.3 mM من DNTPs، و 3% من DMSO، و 1.5 mM

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول بسيطة لإنشاء مكتبة عشوائية متحولة عن تسلسل هدف ما. نظهر كيف يمكن أن يقترن هذا الأسلوب ، والتي تتم في الجسم الحي في كولاي ، مع تحديدات وظيفية لتطوير الأنشطة الأنزيمية جديدة.

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

وقد وضعت رواية الأسلوب التطور الموجه محددة لمجال الهندسة صمود للحرارة وبالتالي التحقق من صحة لالإنزيمات للجراثيم. فقط بعد جولة واحدة من الطفرات العشوائية، وهو الانزيم تطورت للجراثيم، PlyC 29C3، عرض أكبر من النشاط المتبقية مرتين بالمقارنة مع البروتين من النوع البري بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة.

A طريقة الفرز الجديد للمن التطور الموجه للجراثيم الانزيمات بالحرارة

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للطفرات العشوائية الجينات الهدف في الأنشطار الخميرة. على سبيل مثال، نحن نستهدف rpt4 +، الذي يشفر وحدة فرعية بروتوزوم 19S، وشاشة للطفرات التي تزعزع استقرار هيتيروتشروماتين.

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

تقدم هذه المقالة طريقة التزاوج القائم لتسهيل فحص أوفيريكسبريشن في مهدها الخميرة استخدام مكتبة صفت بلازميد.

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

نقدم بروتوكول شاشة القامع بسيطة في انشطار الخميرة. يعد هذا الأسلوب كفاءة خالية مطفر والانتقائي للطفرات التي غالباً ما تحدث في موضع الجينوم واحد.  البروتوكول مناسبة لعزل المكثفات التي تخفف من عيوب النمو في الثقافة السائلة التي تنتج عن طفرة أو دواء.

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

يمكن تطوير الإندونوكليس التقييد مع خصوصية تسلسل جديدة من الإنزيمات التي تعترف بتسلسل منحط جزئيًا. هنا نقدم بروتوكول مفصل استخدمناه بنجاح لتغيير خصوصية تسلسل إنزيم NlaIV. المكونات الرئيسية للبروتوكول هي تجزئة المختبر من رد فعل النسخ / الترجمة واختيار المتغيرات مع خصائص تسلسل جديدة.

في المختبر إخراج تطور Endonuclease تقييد مع خصوصية أكثر صرامة

يصف هذا العمل بروتوكولا للشاشة الجينية المثبطة متعددة النسخ في Schizosaccharomyces pombe. تستخدم هذه الشاشة مكتبة بلازميد على نطاق الجينوم لتحديد استنساخ (نسخ) مثبط لنمط ظاهري مفقود الوظيفة مرتبط بسلالة متحولة للاستعلام. تم تحديد مثبطات جينية جديدة للمتحور الفارغ ell1 باستخدام هذه الشاشة.

الفحص الجيني لتحديد مثبطات النسخ المتعددة في Schizosaccharomyces pombe

تفاعلات الجزيئات الحيوية ، مثل تفاعلات البروتين والبروتين ، هي الأساس الجزيئي للوظائف البيولوجية. إذا كان من الممكن عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة التي تفتقر على وجه التحديد إلى التفاعل ذي الصلة ، فإنها ستساعد بشكل كبير على فهم وظيفة (وظائف) هذا التفاعل. تقدم هذه المقالة طريقة فعالة لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة.

عزل الطفرات التفاعلية الفارغة / الضعيفة باستخدام مقايسة الخميرة ثنائية الهجين

يصف هذا البروتوكول الخطوات الأساسية لإجراء حملات اختيار عرض سطح الخميرة لإثراء متغيرات البروتين المرتبطة بمستضد ذي أهمية.

هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة

اكتشف بروتوكولاً موثوقاً لبناء وفرز مكتبات الطفرات في Saccharomyces cerevisiae باستخدام خوارزميات حاسوبية لتحديد مناطق الهدف. هذه الطريقة البسيطة تُمكّن الباحثين من تطوير بروتينات ذات صفات مرغوبة بكفاءة عالية.

توجه طريقة تطور في

استكشف المزيد من الفيديوهات