توجه طريقة تطور في خميرة الخباز: المسخ مكتبة الخلق والفرز
April 1st, 2016
نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء وفحص المكتبات الطافرة لحملات التطور الموجهة في خميرة الخميرة.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية إنشاء وفحص المكتبات الطافرة في Saccharomyces Cerevisiae لتجارب التطور الموجهة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في استخدام إنشاء المختبر لتجارب التطور الموجهة المركزة مثل كيفية تعيين مناطق متداخلة في التجميع والاستنساخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها وقوتها لأنه في خطوة تحويل واحدة فقط ، يمكن تعيين مستويات ذات نوعية جيدة.
سيتم عرض هذا البروتوكول لإنشاء وفحص المكتبات الطافرة لأوكسيداز كحول الأريل الفطري أو AAO. يتم اختيار مناطق التطور الموجه المركز أولا بمساعدة الخوارزميات الحسابية بناء على التركيب البلوري المتاح أو نماذج التماثل للإنزيم. سيتم استهداف منطقتين من AAO لالطفرات العشوائية وإعادة التركيب: منطقة M1 ومنطقة M2.
سيتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المطفرة لتضخيم المناطق المستهدفة. لتعزيز التضفير في الجسم الحي في الخميرة ، سيتم إنشاء مناطق متداخلة بين أجزاء من حوالي 50 زوجا أساسيا لكل منها عن طريق تركيب تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للمناطق المحددة. قم بإعداد 50 ميكرولتر من أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل المطفرة ، كل منها يحتوي على 46 نانوجراما من قالب الحمض النووي 90 نانومولار لكل من البادئات الحسية والمضادة للمعنى 0.3 مللي مولار من DNTPs ، و 3٪ من DMSO ، و 1.5 مللي مولار من كلوريد المغنيسيوم ، و 05 مللي مولار من كلوريد المنغنيز ، و 05 وحدات لكل ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي.
استخدم برنامج PCR التالي. 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 74 درجة مئوية لمدة 45 ثانية لمدة 28 دورة ، و 74 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. سيتم تضخيم ما تبقى من جين AAO ، منطقة HF ، بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة مع المناطق المقابلة المتداخلة مع الأجزاء المطفرة ، أو متضمنة النواقل المتدلية الخطية.
قم بإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة في حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر يحتوي على 10 نانوجرام من قالب الحمض النووي ، و 250 نانومولار لكل من البادئات الحسية والمضادة للمعنى ، و 0.8 مللي مولار من DNTPs ، و 3٪ من DMSO ، و 02 وحدة لكل ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي فائق الدقة iProof. استخدم برنامج PCR التالي. 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 55 درجة مئوية لمدة 25 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية لمدة 28 دورة ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم يتم تنقية جميع شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تتمثل الخطوة التالية في خطية المتجه لإنشاء مناطق مرافقة من حوالي 50 زوجا أساسيا متماثلة مع النهايات الأولية الخمسة والثلاثة الأولية للجين المستهدف. قم بإعداد خليط تفاعل خطي سعة 20 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 7.5 وحدة من BamH-one ، و 7.5 وحدة من XHO-one ، و 20 ميكروغراما من BSA ، وميكرولترين من 10x buffer BamH-one.
احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين و 40 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتعطيل التفاعل عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لتنقية الناقل الخطي لتجنب التلوث بالبلازميد الدائري المتبقي ، قم بتحميل مزيج تفاعل الهضم في البئر الضخم لجل الاغاروز شبه التحضيري منخفض نقطة الانصهار.
قم بتحميل خمسة ميكرولترات من مزيج التفاعل في البئر المجاور كمراسل. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للحمض النووي عند أربع درجات مئوية وخمسة فولت لكل سنتيمتر بين الأقطاب الكهربائية. ثم افصل جل Agarose المقابل للبئر الضخم وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية في XTAE واحد.
وصمة عار الممر مع سلم الوزن الجزيئي والمراسل. تخيل العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وحدد الموضع الذي يوضع فيه المتجه الخطي. في حالة عدم وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية واستخدام توجيه النكات في ممر المراسل الملون ، حدد المتجه الخطي في جزء البئر الضخم واستئصاله.
استخرج الناقل الخطي من Agarose وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك ، يتم خلط الناقل الخطي المنقى مع شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل ويستخدم خليط الحمض النووي هذا لتحويل خلايا الخميرة المختصة باستخدام مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بوضع الخلايا المحولة على ألواح التسرب SC واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
للتحضير لهذا الاختبار ، اختر مستعمرات فردية من ألواح التسرب SC وانقلها إلى 96 لوحة بئر تحتوي على 50 ميكرولترا من الحد الأدنى من الوسط لكل بئر. في كل لوحة ، قم بتلقيح العمود رقم ستة بالنوع الأبوي كمعيار داخلي. كعنصر تحكم سلبي ، قم بتلقيح H-one جيدا المملوء بوسائط SC المكملة باليوراسيل بخلايا الحشوية ESI السلبية URA3 بدون بلازميد.
قم بتغطية الأطباق بأغطيتها ، ولفها في فيلم para ، واحتضن عند 30 درجة مئوية في شاكر رطب لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة ، أضف 160 ميكرولترا من وسط التعبير إلى كل بئر وأعد إغلاق الألواح. احتضن لمدة 24 ساعة أخرى.
بعد الطرد المركزي ، تستخدم الألواح محطة روبوتية متعددة لمعالجة السوائل لنقل 20 ميكرولترا من المادة الطافية من الآبار في كل لوحة إلى لوحة طبق الأصل. أضف 20 ميكرولترا من كحول P-methoxybenzyl و 100 مللي ضروحي من فوسفات الصوديوم المخزن الهيدروجيني 6.0 لكل بئر. قلب الأطباق لفترة وجيزة باستخدام خلاط 96 بئرا واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، أضف 160 ميكرولترا من FOX reagant إلى كل طبق طبق مقلد وحركها لفترة وجيزة باستخدام الخلاط. اقرأ اللوحات بحجم 560 نانومتر على قارئ الألواح. احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة حتى يتطور اللون.
قم بقياس الامتصاص مرة أخرى. يتم حساب النشاط النسبي من الفرق بين قيمة الامتصاص بعد الحضانة وقيمة القياس الأولي الذي تم تطبيعه حسب النوع الأبوي لكل لوحة. تظهر صورة الهلام التمثيلية هذه المتجه الخطي في الممر الثاني ، ومقطع M1 PCR في الممر الثالث ، ومقطع M2 PCR في الممر الرابع ، ومقطع HF PCR في الممر الخامس ، والمتجه المعاد تجميعه في الجسم الحي الخطي مع NHE واحد في الممر السادس.
يظهر هذا الجل التالي الإعداد المصغر للبلازميد للناقل المعاد تجميعه في الممر الثاني ، والبلازميد الخطي مع NHE واحد في الممر الثالث ، والبلازميد الخطي مع BamH واحد و XHO واحد في الممر الرابع ، والبلازميد الخطي الذي تم الحصول عليه عن طريق استخراج الهلام وتنظيفه في الممر الخامس. تم تعديل الأحمال الطفرية عن طريق أخذ عينات من المكتبات الطافرة ذات المناظر الطبيعية المختلفة ، وحساب عدد المستنسخة التي تحتوي على أقل من 10٪ من نشاط الإنزيم الأبوي ، ومزيد من التحقق عن طريق تسلسل عينة عشوائية من المتغيرات النشطة وغير النشطة. أظهر تقييم حد الكشف عن هذا الاختبار أن الاختبار كان خطيا في وجود السوربيتول الذي تمثله دوائر سوداء.
في غياب السوربيتول الذي تمثله المربعات البيضاء ، كانت الخطية أكثر ثباتا ولكن الاستجابة كانت أضعف. لوحظ وجود ارتباط خطي بين تركيز AAO والامتصاص. تم إنشاء مكتبة متحولة من 2,000 نسخة وفحصها باستخدام هذا الفحص.
يشير المربع المظلل إلى طفرات AAO مع إفراز ونشاط محسن بشكل ملحوظ ضد كحول P-methoxybenzyl. بمجرد إتقانها ، يمكن إنشاء المكتبات المتحولة في غضون أربع ساعات تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تعيين مناطق متداخلة مناسبة لكل عائلة PCR ومتجه خطي للربط والاستنساخ في الجسم الحي في خطوة تحويلية واحدة.
باتباع نهج مماثل ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل أخذ عينات الحمض النووي في الجسم الحي أو مكتبة الطفرات في التشبع أو تجميع الحمض النووي من أجل بناء مكتبات متحولة و / أو مسارات التمثيل الغذائي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الهندسة الحيوية لاستكشاف الأنشطة أو الاستقرار أو حتى اختراع أنواع لا حصر لها من التفاعل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسخير جهاز Saccharomyces Cerevisiae لبناء المكتبة وفحصها
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول بناء وفرز مكتبات المتحولات في Saccharomyces cerevisiae لتجارب التطور الموجه. يؤكد على نهج مباشر يسمح بالتحول الفعال وإعادة التركيب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- التكنولوجيا الحيوية
- الهندسة الوراثية
- علم الأحياء الدقيقة
الخلفية
- التطور الموجه هي طريقة تستخدم لتطوير بروتينات ذات سمات مرغوبة.
- يعمل Saccharomyces cerevisiae ككائن نموذجي لهذه التجارب.
- التحول العشوائي وإعادة التركيب هما تقنيات رئيسية في هذه العملية.
- تساعد الخوارزميات الحسابية في اختيار المناطق المستهدفة للتحول.
هدف الدراسة
- لعرض بروتوكول لإنشاء وفرز مكتبات المتحولات.
- لتحديد المجالات المتداخلة للتجميع والاستنساخ في التطور الموجه.
- لتوجيه مناطق معينة من أوكسيديز الأريل الكحول الفطري (AAO) من أجل التحسين.
الطرق المستخدمة
- اختيار المناطق المستهدفة باستخدام الخوارزميات الحسابية.
- التحول العشوائي لمناطق M1 وM2 من AAO.
- فحص مكتبات المتحولات من خلال خطوة تحويل واحدة.
- تقييم جودة المتحولات الناتجة.
النتائج الرئيسية
- البناء الناجح لمكتبات المتحولات في Saccharomyces cerevisiae.
- تحديد المتحولات الفعالة ذات السمات المرغوبة.
- التحقق من قوة البروتوكول.
- رؤى حول عملية التطور الموجه لأوكسيديز الأريل الكحول.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسات التطور الموجه.
- توجيه مناطق معينة يعزز كفاءة التحول.
- يمكن تطبيق هذا النهج على بروتينات مختلفة بخلاف AAO.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
