توجه طريقة تطور في

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية إنشاء وفحص مكتبات طافرة في خميرة Saccharomyces Cerevisiae لتجارب التطور الموجه. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الإنشاء المختبري المستخدم في تجارب التطور الموجه المركزة، مثل كيفية تعيين المناطق المتداخلة للتجميع والاستنساخ. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في بساطتها وقوتها، حيث يمكن تعيين مستويات ذات جودة جيدة في خطوة تحول واحدة فقط.

سيتم استعراض هذا البروتوكول الخاص بإنشاء وفحص مكتبات الطفرات باستخدام إنزيم أريل-ألكوهول أوكسيداز (AAO) الفطري. يتم أولاً اختيار المناطق المخصصة للتطور الموجه المركز بمساعدة خوارزميات حوسبية تعتمد على البنية البلورية المتاحة أو نماذج التماثل للإنزيم. سيتم استهداف منطقتين من AAO لإجراء الطفرات العشوائية وإعادة الاندماج: المنطقة M1 والمنطقة M2.

سيتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المطفّر (Mutagenic PCR) لتضخيم المناطق المستهدفة. ولتعزيز عملية الربط (splicing) داخل الحيوية في الخميرة، سيتم إنشاء مناطق تداخل بين القطع بطول 50 زوج قاعدي تقريباً لكل منها عن طريق تراكب تفاعلات PCR للمناطق المحددة. قم بتحضير تفاعلات Mutagenic PCR بحجم 50 µL، بحيث يحتوي كل تفاعل على 46 ng من قالب DNA، و 90 nM من كل من البادئات الأمامية (sense) والعكسية (antisense)، و 0.3 mM من DNTPs، و 3% من DMSO، و 1.5 mM من كلوريد المغنيسيوم، و 0.5 mM من كلوريد المنجنيز، و 0.5 units/µL من Taq DNA polymerase.

استخدم برنامج PCR التالي: 95 °C لمدة دقيقتين، ثم 95 °C لمدة 45 ثانية، و50 °C لمدة 45 ثانية، و74 °C لمدة 45 ثانية لمدة 28 دورة، وأخيرًا 74 °C لمدة 10 دقائق. سيتم تضخيم الجزء المتبقي من جين AAO، وهو منطقة HF، بواسطة PCR عالي الدقة (high fidelity PCR) مع تضمين المناطق المقابلة التي تتداخل مع القطع الطافرة، و/أو الزوائد الطرفية للناقل الخطي.

قم بتحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الدقة في حجم نهائي قدره 50 µL يحتوي على 10 ng من قالب DNA، و250 nM من كل من البادئات الأمامية والعكسية، و0.8 mM من الـ DNTPs، و3% من DMSO، و02 وحدة لكل µL من إنزيم iProof ultra high-fidelity DNA polymerase. استخدم برنامج الـ PCR التالي: 98 °C لمدة 30 ثانية، ثم 98 °C لمدة 10 ثوانٍ، و55 °C لمدة 25 ثانية، و72 °C لمدة 45 ثانية لمدة 28 دورة، ثم 72 °C لمدة 10 دقائق.

يتم بعد ذلك تنقية جميع قطع PCR باستخدام طقم استخلاص الهلام التجاري وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. الخطوة التالية هي جعل الناقل خطياً لإنشاء مناطق محيطة تبلغ حوالي 50 زوجاً قاعدياً تكون متماثلة مع النهايات 5' و 3' للجين المستهدف. قم بتحضير خليط تفاعل خطي بحجم 20 µL يحتوي على 2 µg من DNA، و 7.5 units من BamH-one، و 7.5 units من XHO-one، و 20 µg من BSA، و 2 µL من 10x buffer BamH-one.

يتم تحضين خليط التفاعل عند 37 °C لمدة ساعتين و40 دقيقة. بعد ذلك، يتم إيقاف التفاعل بالتعريض لدرجة حرارة 80 °C لمدة 20 دقيقة. ولتنقية الناقل المخطّي (linearized vector) لتجنب التلوث بالبلازميد الدائري المتبقي، يتم تحميل خليط تفاعل الهضم في البئر الكبير (mega-well) لهلام أغاروز (Agarose) شبه تحضيري منخفض درجة الانصهار.

قم بتحميل خمسة µL من خليط التفاعل في البئر المجاور كعينة مرجعية. قم بإجراء الفصل الكهربائي لـ DNA عند درجة حرارة 4 °C وبجهد قدره 5 V/cm بين الأقطاب الكهربائية. بعد ذلك، افصل هلام الأغاروز المقابل للبئر العملاق (mega-well) واحفظه عند درجة حرارة 4 °C في محلول 1X TAE.

قم بصبغ المسار الذي يحتوي على سلم الوزن الجزيئي والمراسل. قم بتصور الحزم تحت الأشعة فوق البنفسجية UV، وضع علامة صغيرة (خدشاً) عند الموضع الذي يظهر فيه الناقل الخطي. في غياب الأشعة فوق البنفسجية UV وبالاستعانة بالعلامات الموجودة في مسار المراسل المصبوغ، حدد موقع الناقل الخطي في قطعة البئر العملاق (mega-well) وقم بقصه.

استخلص الناقل الخطي (linearized vector) من هلام الأجاروز وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخلاص الهلام التجارية وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك، يتم خلط الناقل الخطي المُنقّى مع قطع الـ PCR، وتُستخدم هذه الخلاصة من الـ DNA لتحويل خلايا الخميرة المختصة (competent yeast cells) باستخدام مجموعة تجارية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ازرع الخلايا المحولة في أطباق SC dropout واحضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

للتحضير لهذا المقايسة، اختر مستعمرات فردية من أطباق SC dropout وانقلها إلى أطباق ذات 96 بئراً تحتوي على 50 µL من الوسط الأدنى (minimal medium) لكل بئر. في كل طبق، قم بتلقيح العمود رقم ستة بالسلالة الأبوية كمعيار داخلي. وكعنصر تحكم سلبي، قم بتلقيح البئر H-one المملوء بأوساط SC المكملة باليوراسيل بخلايا ESI visceral سلبية لـ URA3 ولا تحتوي على بلازميد.

قم بتغطية الأطباق بأغطيتها، ولفّها بغشاء البارافيلم (para film)، ثم حضنها عند 30 درجة Celsius في هزاز رطب لمدة 48 ساعة. بعد مرور 48 ساعة، أضف 160 µL من وسط التعبير إلى كل بئر وأعد إغلاق الأطباق. ثم حضنها لمدة 24 ساعة إضافية.

بعد طرد الصفائح مركزياً، استخدم محطة روبوتية متعددة للتعامل مع السوائل لنقل 20 µL من السائل الطافي من الآبار في كل صفيحة إلى صفيحة مماثلة. أضف 20 µL من P-methoxybenzyl alcohol بتركيز 2 mM ومحلول sodium phosphate buffer بتركيز 100 mM وبقيمة pH 6.0 إلى كل بير. قم برج الصفائح لفترة وجيزة باستخدام جهاز خلط الصفائح ذات 96 بئراً، ثم حضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف 160 µL من كاشف FOX إلى كل لوحة مكررة وحركها لفترة وجيزة باستخدام الخلاط. اقرأ اللوحات عند 560 nm باستخدام قارئ اللوحات. حضن اللوحات في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر اللون.

قس الامتصاص مرة أخرى. تُحسب النشاطية النسبية من الفرق بين قيمة الامتصاص بعد الحضن وقيمة القياس الأولي، مع معايرتها بالنسبة للنمط الأبوي لكل طبق. تُظهر صورة الهلام التمثيلية هذه الناقل المخطّي في المسار الثاني، وقطعة PCR الخاصة بـ M1 في المسار الثالث، وقطعة PCR الخاصة بـ M2 في المسار الرابع، وقطعة PCR الخاصة بـ HF في المسار الخامس، والناقل الذي أعيد تجميعه في الجسم الحي والمخطّي باستخدام NHE one في المسار السادس.

يُظهر الجل التالي في المسار الثاني تحضير البلازميد الصغير (mini-prep) للنواقل المعاد تجميعها، وفي المسار الثالث البلازميد المخطط باستخدام NHE I، وفي المسار الرابع البلازميد المخطط باستخدام BamH I و Xho I، وفي المسار الخامس البلازميد المخطط الذي تم الحصول عليه عن طريق الاستخلاص والتنقية باستخدام الجل. تم ضبط الأحمال الطفرية من خلال أخذ عينات من مكتبات طافرة ذات مناظر طبيعية مختلفة، وحساب عدد المستعمرات التي لديها أقل من 10% من نشاط الإنزيم الأبوي، مع مزيد من التحقق عن طريق تسلسل عينة عشوائية من المتغيرات النشطة وغير النشطة. وأظهر تقييم حد الكشف لهذا المقايسة أن المقايسة كانت خطية في وجود sorbitol، وهو ما تم تمثيله بالدوائر السوداء.

في حالة غياب السوربيتول والمتمثلة بالمربعات البيضاء، كانت الخطية أكثر استمرارية ولكن الاستجابة كانت أضعف. ولوحظ وجود ارتباط خطي بين تركيز AAO والامتصاصية. كما تم إنشاء مكتبة طافرة مكونة من 2,000 مستنسخ وفحصها باستخدام هذا المقايسة.

يشير المربع المظلل إلى طفرات AAO التي أظهرت تحسناً ملحوظاً في الإفراز والنشاط ضد P-methoxybenzyl alcohol. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إنشاء مكتبات الطفرات في غضون أربع ساعات تقريباً إذا نُفذت بشكل صحيح. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تعيين مناطق تداخل مناسبة لكل عائلة PCR وناقل خطي لعمليتي الربط والاستنساخ في الجسم الحي (in vivo) ضمن خطوة تحول واحدة.

باتباع نهج مماثل، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل أخذ عينات DNA في الجسم الحي (in vivo)، أو مكتبة الطفرات المشبعة، أو تجميع DNA من أجل بناء مكتبات طافرة و/أو مسارات أيضية. وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال الهندسة الحيوية لاستكشاف الأنشطة، أو الاستقرارات، أو حتى ابتكار أنواع لا حصر لها من التفاعلات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسخير جهاز Saccharomyces Cerevisiae هذا لبناء المكتبات وفحصها