رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في

الهدف من هذا الإجراء هو استقصاء العلاقات الوظيفية بين الجينات والمسارات البكتيرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مصفوفات من سلالات *Escherichia coli*، وهي سلالات طافرة مفردة سيتم إجراء الاقتران أو التزاوج لها. والخطوة الثانية هي إتمام عملية اقتران الطفرات المفردة بتنسيق مصفوفة على الأطباق.

بعد ذلك، يتم اختيار الطفرات المزدوجة. وتتمثل الخطوة النهائية في تصوير أطباق الطفرات المزدوجة وقياس مستعمرات الطفرات المزدوجة لتحديد مدى لياقة السلالة. وفي النهاية، يتم تحليل بيانات حجم المستعمرات لحساب درجات التفاعل الجيني وتحديد الجينات والمسارات والعمليات المتفاعلة وظيفياً.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الطفرات العشوائية، في إمكانية إنشاء العديد من سلالات الطفرات المزدوجة الفردية. علاوة على ذلك، يمكن تقييم التفاعلات بين العديد من الجينات في وقت واحد بغض النظر عن حجم الجين، أو مدى ضرورته، أو لياقة طفرة الجين المنفرد. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا الأنظمة، مثل تلك المتعلقة بوظائف الجينات والتداخل الوظيفي بين المسارات والعمليات.

تمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج العدوى البكتيرية، حيث إن المعرفة بأغلب الجينات والعمليات المركزية وظيفياً، فضلاً عن فهم أي مجموعات من الجينات والمسارات والعمليات البكتيرية التي يؤدي اضطرابها إلى تحسين أو تقليل الكفاءة البكتيرية، ستساعد في تطوير استراتيجيات التدخل الأكثر فعالية. لبدء هذا البروتوكول، يتم استخدام تضخيم PCR متداخل ثنائي الخطوة لاستبدال إطار القراءة المفتوح المستهدف بعلامة مقاومة الكلورامفينيكول من بلازميد PKD three كما هو موضح في الإجراء المكتوب.

تأكد من المنتج المتوقع ثم قم بتنقية قطعة الـ PCR الناتجة وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد استخلاص منتج الـ PCR في 30 µL من الماء المقطر المعقم، خففه ليصل التركيز إلى حوالي 50 mg/µL تقريباً. يُحفظ المنتج المنقى عند درجة حرارة -20 °C قبل عملية التحول.

بعد ذلك، قم بتحضير خلايا HFR Caval المختصة ذات التردد العالي لإعادة التركيب من أجل بناء المانح. أولاً، قم بتلقيح 1 mL من مزرعة مشبعة لليلة واحدة من سلالة HFR Cavalli في 70 mL من وسط LB الطازج مع 35 µL من Ampicillin بتركيز 50 mg/mL في دورق سعة 250 mL.

يتم تحضين المزرعة عند درجة حرارة 32 درجة مئوية مع الرج اللطيف بسرعة 220 RPM حتى يتم الوصول إلى كثافة ضوئية تتراوح بين 0.5 إلى 0.6 تقريباً. بعد ذلك، تُنقل المزرعة إلى حمام مائي لإتمام الحث الحراري لنظام Lambda Red Recombination عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الرج بسرعة 160 RPM لإيقاف عملية الحث. ثم تُنقل المزرعة إلى حمام مائي من ملاط الثلج المبرد لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة عند سرعة 160 RPM.

تأكد من الحفاظ على برودة الخلايا حتى ما بعد عملية التحول. بعد غسل الخلايا وحصادها عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، قم بتصريف السائل العلوي وأعد تعليق الراسب في 500 µL من Glycerol Eloqua بتركيز 10% مبرد بالثلج. وزع الخلايا في أحجام تبلغ 50 µL في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL مبردة مسبقاً، وابدأ فوراً في عملية التحول.

أضف 100 nanograms من كاسيت حذف الجين المُنقى إلى الخلايا المختصة. قم بنقر الأنبوب واترك المعلق على الثلج لمدة خمس دقائق. ثم انقل المعلق إلى وعاء التثقيب الكهربائي المبرد مسبقاً، وقم بإجراء عملية التثقيب الكهربائي لخليط الخلايا على الفور.

أضف 1 ml من وسط SOC في درجة حرارة الغرفة، وانقل الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي في الوسط إلى أنبوب زراعة سعة 15 ml. قم بتحضين الخلايا عند 32 °C لمدة ساعة واحدة مع رج مداري بسرعة 220 RPM. بعد التحضين، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 4,400 ×g لمدة خمس دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة حوالي 850 µL من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في السائل المتبقي. وزع الخلايا على أطباق LB تحتوي على 17 µg/mL من الكلورامفينيكول واحضنها عند 32 °C طوال الليل. في اليوم التالي، قم بتخطيط متحولين فرديين على أطباق LB الكلورامفينيكول لتأكيد الطفرة، وقم بتخطيط المتحولين ذاتهما على أطباق LB كاناميسين للتأكد من أن السلالات ليست مقاومة للكاناميسين.

بعد ذلك، يتم تضخيم DNA باستخدام ثلاث مجموعات مختلفة من بادئات تأكيد التعطيل (knockout confirmation primers) كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تتكون مجموعة البادئات الأولى من بادئ أمامي جانبي بطول 20 نوكليوتيدة يقع على بُعد 200 زوج قاعدي قبل المنطقة المستهدفة، وبادئ عكسي مكمل لـ كاسيت مقاومة الكلورامفينيكول. ومن المتوقع أن ينتج عن هذا التضخيم قطعة تضخيم (amplicon) بطول 445 نوكليوتيدة.

تتضمن المجموعة الثانية بادئاً أمامياً، يرتبط بتسلسل كاسيت مقاومة الكلورامفينيكول، وبادئ تأكيد خلفياً محيطاً، تم تصميمه ليكون على بُعد 200 زوج قاعدي في اتجاه المصب من الطرف '3 للجين المحذوف. ومن المتوقع أن ينتج عن تفاعل التضخيم هذا قطعة تضخيم طولها 309 نوكليوتيدات. أما تفاعل PCR الثالث فيحتوي على كل من البادئات المحيطة في اتجاه المنبع واتجاه المصب.

هذا التفاعل مطلوب للتأكيد من أن السلالة المختارة ليست ثنائية الصيغة الصبغية في النخاع مع استبدال موقع جيني واحد بالكاسيت وبقاء نسخة جينية أخرى مكررة ولكنها من النوع البري. ومن المتوقع أن ينتج عن هذا التضخيم منتج بحجم 1.4 KB. وقد تم نقل مجموعة طفرات حذف الجينات الفردية غير الأساسية لـ e coli ke io آلياً عبر روبوت النسخ إلى 24 384.

املأ طبقاً ميكروياً بـ 80 µL من وسط LB السائل في كل بئر، مع تدعيمه بـ 50 µg/mL من الكاناميسين. خصص مساحة لسلالة الضبط الحدية، والتي تُستخدم كضابط موجب وتساعد في تسوية الطبق وكذلك في التكميم الآلي للمستعمرات. قم بإزالة الوسط الملقح من الآبار الخارجية لكل طبق وانقله إلى أطباق جديدة، مع ترك الآبار الخارجية فارغة.

وبالمثل، قم بإنشاء بقع تحكم سلبية عن طريق إزالة أي سلالتين من موقع مختلف داخل كل طبق ونقل السلالات إلى طبق جديد. بعد ذلك، املأ الآبار الفارغة، بما في ذلك آبار التحكم الحدودية وآبار التحكم السلبية، بوسط LV الذي يحتوي على 17 micrograms per milliliter من chloramphenicol. ومن المتوقع أن تكون بقع التحكم السلبية هذه فارغة في الطبق المستقبل، وبالتالي في أطباق الطفرات المزدوجة.

تُستخدم هذه السلالات للتأكد من عدم وجود أخطاء في المعالجة أو مناولة الأطباق عند ترقيم التصوير أو تثبيت الأطباق. بعد تحضير سلالة الحدود الموجبة كما هو موضح في الإجراء المكتوب، يتم استزراع سلالات المصفوفة وكذلك سلالة الحدود الموجبة طوال الليل عند 32 درجة مئوية مع رج مداري بسرعة 190 RPM، وفي اليوم التالي، تُملأ آبار الحدود بحوالي 80 µL من مزرعة الليل.

بدلاً من ذلك، وللتخزين طويل الأمد، يتم تزويد كل بئر في الأطباق المستقبلة بـ 15% glycerol مع خلط الوسط والـ glycerol معاً. ثم تُخزن الأطباق عند درجة حرارة -80 °C. ابدأ إجراء التزاوج بتنمية سلالة HFR المانحة، التي تحمل حذف الجين المستهدف والموسوم بكاسيت مقاومة chloramphenicol، طوال الليل عند درجة حرارة 32 °C في وسط LB السائل الغني الذي يحتوي على 17 µg/mL من chloramphenicol pin.

تم توزيع مجموعة طفرات المستقبل المطلوبة من TH بكثافة 3 84 مستعمرة على أطباق LB الصلبة، والمكملة بـ 50 micrograms per milliliter من can mycin. وبالتوازي، تم نقل سلالة طفرة المانح المستعلم عنها بكثافة 3 84 مستعمرة على نفس العدد من أطباق LB.

مُدعمة بـ 17 µg/mL من الكلورامفينيكول. تُحضن الأطباق طوال الليل عند 32 °C لإجراء الاقتران بين السلالات. يتم نقل المانح من أطباق المانح ذات الـ 84 مستعمرة التي حُضنت طوال الليل إلى أطباق LB الصلبة.

بعد ذلك، يتم نقل السلالات من لوحة مستقبلة واحدة تحتوي على 384 مستعمرة تم نقلها مسبقاً لليلة واحدة فوق المانحين الذين تم نقلهم حديثاً. تُحضن لوحات الاقتران المنقولة عند درجة حرارة 32 degrees Celsius لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. ثم يتم نقل كل لوحة اقتران بكثافة 384 إلى لوحة LB صلبة واحدة تحتوي على الكلورامفينيكول.

ويمكن لـ mycin تكرار هذه العملية حتى يتم نقل جميع أطباق الاقتران. يتم تحضين أطباق الاختيار الأولى التي تم نقل العينات إليها حديثاً لمدة تتراوح من 16 إلى 36 ساعة عند 32 درجة Celsius. بعد التحضين، يتم إعادة نقل كل طبق اختيار أول إلى طبق اختيار ثانٍ يحتوي على عقارين بتنسيق 1536 SPOT، بحيث يتم تمثيل كل مستعمرة من Plates الاختيار الأولى بأربع مستعمرات.

في طبق الانتقاء الثاني، قم بتحضين الأطباق لمدة تتراوح من 16 إلى 36 ساعة. عند درجة حرارة 32 درجة مئوية، قم بتصوير أطباق انتقاء الطفرات المزدوجة النهائية لقياس كفاءة نمو الطفرات كمياً ولتحليل التفاعلات بين أزواج الجينات. ونظراً لأن الجينات الموجودة في المسار نفسه تظهر أنماط GI مرتبطة ارتباطاً وثيقاً، يمكن تجميع الجينات ذات الصلة وظيفياً من خلال عنقدتها وفقاً للتشابه العام لملفات درجة S الخاصة بها.

يمثل تشابه ملف GI مدى تطابق الأنماط الظاهرية عند حدوث طفرة في جينين، ويجب أن يشير ذلك إلى ما إذا كان الجينان يعملان في نفس المسار أو في مسارات متداخلة. يظهر هنا توزيع معاملات الارتباط بين ملفات GI لأزواج الجينات التي تشفر بروتينات متفاعلة فيزيائياً مقابل أزواج جينات تم اختيارها عشوائياً. ويظهر كمثال مخطط مبعثر للملفات الجينية المترابطة لناقلين يشكلان معقداً ثلاثي القسيمات غير متجانس ضروري لإفراز الحيوانات المنوية، مع إظهار جين yeast ecoline.

تميل التفاعلات المخففة ذات الملفات الجينية (GI) عالية الارتباط إلى ترميز مسارات مرتبطة فيزيائياً أو تعمل بشكل متسق في مسار كيميائي حيوي مشترك. يظهر هنا مثال تمثيلي حيث تشكل مكونات مسارات التخليق الحيوي للحديد والكبريت ISC و SUF المتكررة وظيفياً، والتي تشارك معاً في عملية أساسية، عناقيد متميزة مرتبطة ببعضها البعض من خلال تفاعلات تفاقم واسعة النطاق. يمكن استخدام مقياس إحصائي للعثور على أي إثراء معنوي للتفاعلات بين تركيبات محددة من المسارات، ودمج شبكات GI مع التفاعلات الفيزيائية وبيانات الارتباط الوظيفي الأخرى، مثل السياق الجينومي.

يمكن للعلاقات أن تكشف عن تنظيم الوحدات الوظيفية ذات الرتب العالية التي تحدد الأنظمة البيولوجية الأساسية في البكتيريا. كما يمكن تطبيق تحليل العنقودة على شبكات الجزر الجينومية (GI) للتنبؤ بوظائف الجينات المشروحة. ونظراً لاختلاف خوارزميات العنقودة.

ومع ذلك، فإن التعيينات الوظيفية الافتراضية التي يتم تحديدها من خلال التجميع تتطلب تحققاً تجريبياً مستقلاً. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تضمين جميع الضوابط الموجبة والسالبة الضرورية عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل البروتيوميات، والتجارب البيوكيميائية المتابعة، والجينوميات الكيميائية للإجابة على أسئلة إضافية حول وظائف جينات محددة بالإضافة إلى طبيعة العلاقات الوظيفية بين الجينات والمسارات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إنشاء سلالات طافرة مزدوجة، وتجميع مصفوفات مستقبلة، وإجراء فحوصات ESGA لاستقصاء العلاقات الوظيفية بين الجينات والعمليات في بكتيريا e coli.