رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في كولاي استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

الهدف من هذا الإجراء هو التحقيق في العلاقات الوظيفية بين الجينات والمسارات البكتيرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير مصفوفات من ceia coli أولا ، وهي سلالات متحولة مفردة سيتم تقارنها أو تزاوجها. الخطوة الثانية هي اقتران الطفرات المفردة في شكل مصفوفة على اللوحات.

بعد ذلك ، يتم تحديد المسوخ المزدوج. الخطوة الأخيرة هي تصوير الصفائح الطافرة المزدوجة وتحديد المستعمرات الطافرة المزدوجة لتحديد لياقة الإجهاد. في النهاية ، يتم تحليل بيانات حجم المستعمرة لحساب درجات التفاعل الجيني وتحديد الجينات والمسارات والعمليات المتفاعلة وظيفيا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الطفرات العشوائية ، هي أنه يمكن إنشاء العديد من السلالات الطافرة الفردية المزدوجة. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم التفاعلات بين العديد من الجينات في وقت واحد بغض النظر عن حجم الجين أو الأهمية أو اللياقة البدنية المتحولة للجين الفردي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأنظمة ، مثل تلك المتعلقة بوظائف الجينات والحديث المتبادل الوظيفي بين المسارات والعمليات.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الالتهابات البكتيرية لأن المعرفة حول معظم الجينات والعمليات المركزية وظيفيا ، بالإضافة إلى فهم مجموعات الجينات والمسارات والعمليات البكتيرية عند الاضطراب التي تعمل على تحسين أو تقليل اللياقة البكتيرية ستساعد في تطوير استراتيجيات التدخل الأكثر فعالية لبدء هذا البروتوكول. متداخلة من خطوتين. يتم استخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستبدال إطار القراءة المفتوح المستهدف بعلامة مقاومة الكلورامفينيكول من PKD ثلاثة بلازميد كما هو موضح في الإجراء المكتوب.

قم بتأكيد المنتج المتوقع وقم بتنقية PCR للجزء الذي تم الحصول عليه باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. بعد تصفية منتج PCR في 30 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، يتم تخفيفه إلى حوالي 50 ملليغرام لكل تركيز ميكرولتر. يتم تخزين المنتج المنقى عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر قبل التحول.

بعد ذلك ، قم بإعداد التردد العالي لإعادة التركيب أو الخلايا المختصة HFR Caval لبناء المانحين. قم أولا بتلقيح ملليلتر واحد من ثقافة مشبعة بين عشية وضحاها لسلالة HFR Cavalli إلى 70 مل من وسط LB الطازج مع 35 ميكرولتر من 50 ملليغرام لكل ملليلتر. أمبيسلين في قارورة سعة 250 ملليلتر.

احتضان المزرعة عند 32 درجة مئوية عن طريق الرج برفق عند 220 دورة في الدقيقة حتى يتم الحصول على كثافة بصرية تتراوح من 0.5 إلى 0.6. ثم انقل المزرعة إلى حمام مائي للحث الحراري لنظام إعادة التركيب الأحمر Lambda عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة لإيقاف الحث. انقل المزرعة إلى حمام مائي ملاط ثلج مبرد لمدة 10 إلى 20 دقيقة عند 160 دورة في الدقيقة.

تأكد من الحفاظ على الخلايا باردة حتى بعد التحول. بعد غسل الخلايا وحصادها عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ، قم بصب السنا وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من البرد المثلج ، 10٪ الجلسرين Eloqua. الخلايا في حجم 50 ميكرولتر إلى أنابيب مركزية دقيقة فردية مبردة مسبقا 1.5 مليلتر وتنتقل على الفور إلى التحول.

أضف 100 نانوجرام من حذف الجينات المنقى ، كاسيت إلى الخلايا المختصة. انقر فوق الأنبوب واترك التعليق يجلس على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم انقل التعليق إلى جهاز كهربائي مبرد مسبقا ، وقم بتشغيل خليط الخلية على الفور.

أضف ملليلترا واحدا من وسط SOC بدرجة حرارة الغرفة ، وانقل الخلايا المثقبة بالكهرباء في الوسط إلى أنبوب ثقافة سعة 15 ملليلترا. احتضان الخلايا عند 32 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري عند 220 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخلايا 4 ، 400 مرة G لمدة خمس دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة ما يقرب من 850 ميكرولتر من السوبينات وأعد تعليق حبيبات الخلية في السائل المتبقي. انشر الخلايا على ألواح LB تحتوي على 17 ميكروغرام لكل مليلتر ، كلورامفينيكول واحتضانها عند 32 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإخراج محولين فرديين على ألواح LB chloramphenicol لتأكيد الطافرة ، وقم بإخراج نفس المحولات على ألواح LB can mycin للتأكد من أن السلالات لا يمكن أن تكون مقاومة للميسين.

بعد ذلك ، يتم تضخيم الحمض النووي بثلاث مجموعات مختلفة من بادئات تأكيد خروج المغلوب كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تتكون المجموعة التمهيدية الأولى من 20 نيوكليوتيدات مقدمة محاطة ب 200 زوج أساسي في اتجاه المنبع من المنطقة المستهدفة ، وبرايمر عكسي ، وهو مكمل لكاسيت مقاومة الكلورامفينيكول. من المتوقع أن ينتج عن هذا التضخيم 445 نيوكليوتيدات مضخمة.

تشتمل المجموعة الثانية على برايمر أمامي ، وركوع على تسلسل كاسيت مقاومة الكلورامفينيكول ، وبرايمر تأكيد الجناح العكسي ، والذي تم تصميمه لمعالجة 200 زوج أساسي في اتجاه مجرى النهر من الطرف الرئيسي الثلاثة للجين المحذوف. من المتوقع أن ينتج تفاعل التضخيم هذا 309 أمبليكون نيوكليوتيدات. يحتوي PCR الثالث على كل من البادئات المحيطة بالمنبع والمصب

هذا التفاعل مطلوب لتأكيد أن السلالة المختارة ليست ثنائية الصبغيات مع استبدال موضع جيني واحد بالكاسيت وآخر مكرر ، ولكن بخلاف ذلك لا تزال نسخة جينية من النوع البري موجودة. من المتوقع أن ينتج عن هذا التضخيم منتج 1.4 كيلوبايت. إن المجموعة المتحولة لحذف الجينات المفردة غير الأساسية هي نسخة طبق الأصل آليا إلى 24 384.

حسنا ، تحتوي الصفيحة الدقيقة على 80 ميكرولتر من وسط LB السائل لكل بئر. تستكمل ب 50 ميكروغرام لكل مليلتر يمكن مايسين لإفساح المجال لسلالة مراقبة الحدود ، والتي كانت تفتقر إلى التحكم الإيجابي والمساعدة في تطبيع الألواح وكذلك في تكميم المستعمرة الآلي. قم بإزالة الوسائط الملقحة من الآبار الخارجية لكل لوحة وانقلها إلى ألواح جديدة ، مع ترك الآبار الخارجية فارغة.

وبالمثل ، قم بإنشاء نقاط تحكم سلبية عن طريق إزالة أي سلالتين من موقع مختلف داخل كل لوحة ونقل السلالات إلى لوحة جديدة. بعد ذلك ، املأ الآبار الفارغة ، بما في ذلك آبار مراقبة الحدود وآبار التحكم السلبية بوسائط منخفضة تحتوي على 17 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول. من المتوقع أن تكون نقاط التحكم السلبية هذه فارغة في المتلقي وبالتالي تكون لوحات متحولة مزدوجة.

إنها تعمل على ضمان عدم وجود أخطاء في المعالجة أو معالجة اللوحة عند ترقيم أو التصوير أو تثبيت اللوحات. بعد تحضير السلالة الإيجابية للحدود كما هو موضح في الإجراء المكتوب ، تزرع سلالات المصفوفة وكذلك السلالة الإيجابية الحدودية بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 190 دورة في الدقيقة في اليوم التالي ، وتملأ الآبار الحدودية بحوالي 80 ميكرولترا من الثقافة الليلية. يمكن استخدام الألواح المجمعة للتزاوج كما هو موضح في القسم التالي.

بدلا من ذلك ، للتخزين طويل الأجل ، يتم استكمال كل بئر في الألواح المتلقية بنسبة 15٪ من الجلسرين ويتم خلط الوسائط والجلسرين. ثم يتم تخزين الصفائح عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. ابدأ إجراء التزاوج عن طريق زراعة سلالة المتبرع ب HFR ، والتي تحمل حذف جين الاستعلام المميز بكاستيج مقاومة الكلورامفينيكول طوال الليل عند 32 درجة مئوية في وسط سائل غني بالرطل مع 17 ميكروغرام لكل مليلتر من دبوس الكلورامفينيكول.

أمر TH بجمع الطفرة المستلمة بكثافة مستعمرة 3 84 على ألواح LB صلبة. يستكمل ب 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من علبة مايسين. في دبوس متوازي ، يستعلم المتبرع السلالة الطافرة في كثافة مستعمرة 3 84 على نفس العدد من ألواح LB.

يستكمل ب 17 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول. احتضان الصفائح طوال الليل عند 32 درجة مئوية لاقتران السلالات. قم بتثبيت المتبرع من 3 84 مستعمرة بين عشية وضحاها على ألواح LB صلبة.

ثم قم بتثبيت السلالات من لوحة متلقية واحدة من مستعمرة 3 84 بين عشية وضحاها فوق المتبرعين المثبتين حديثا. احتضان ألواح الاقتران المثبتة عند 32 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بتثبيت كل صفيحة اقتران بكثافة 384 على صفيحة LB صلبة واحدة تحتوي على الكلورامفينيكول.

وهل يمكن أن يكرر الميسين هذه العملية حتى يتم تثبيت جميع ألواح الاقتران؟ احتضن أطباق الاختيار الأولى المثبتة حديثا لمدة 16 إلى 36 ساعة عند 32 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أعد تثبيت كل لوحة اختيار أولى على لوحة اختيار دواء مزدوجة ثانية بتنسيق 1536 SPOT بحيث يتم تمثيل كل مستعمرة اختيار أولى بأربع مستعمرات.

على لوحة الاختيار الثانية ، احتضن اللوحات لمدة 16 إلى 36 ساعة. عند 32 درجة oss ، قم بتصوير لوحات الاختيار الطافرة المزدوجة النهائية لقياس لياقة نمو الطفرات كميا وتحليل التفاعلات بين أزواج الجينات. نظرا لأن الجينات في نفس المسار تعرض أنماط GI مرتبطة ارتباطا وثيقا ، يمكن تجميع الجينات ذات الصلة وظيفيا عن طريق تجميعها وفقا للتشابه العام لملفات تعريف درجة S الخاصة بها.

يمثل تشابه ملف تعريف الجهاز الهضمي تطابق الأنماط الظاهرية عند طفرة جينين ويجب أن يكون مؤشرا على ما إذا كان الجينان يعملان في نفس المسار أو المتداخل. يظهر هنا توزيع معاملات الارتباط بين ملفات تعريف الجهاز الهضمي لأزواج الجينات التي تشفر البروتينات المتفاعلة جسديا مقابل أزواج الجينات المرسومة عشوائيا. يظهر مثال على مخطط مبعثر للملامح الجينية المترابطة لاثنين من الناقلين اللذين يشكلان مركبا غير متجانس مطلوبا لإفراز المنوية كما هو الحال مع عرض جين الخميرة البيئية.

يميل التخفيف من التفاعلات مع ملفات تعريف الجهاز الهضمي شديد الارتباط إلى تشفير المسارات المرتبطة فيزيائيا أو التي تعمل بشكل متماسك في مسار كيميائي حيوي مشترك. هنا يتم عرض مثال تمثيلي حيث تشكل مكونات مسارات التخليق الحيوي لكبريت الحديد ISC و SUF الزائدة عن الحاجة وظيفيا ، والتي تشارك معا في عملية أساسية مجموعات متميزة مرتبطة ببعضها البعض من خلال تفاعلات مشددة واسعة النطاق. يمكن استخدام مقياس إحصائي للعثور على أي إثراء كبير للتفاعلات بين مجموعات محددة من المسارات ، وتكامل شبكات GI مع التفاعلات الفيزيائية وبيانات الارتباط الوظيفي الأخرى ، مثل السياق الجيني.

يمكن أن تكشف العلاقات عن تنظيم وحدات وظيفية عالية المستوى تحدد الأنظمة البيولوجية الأساسية في البكتيريا. يمكن أيضا تطبيق التحليل العنقودي على شبكات الجهاز الهضمي للتنبؤ بوظائف الجينات المشروحة. نظرا لاختلاف خوارزميات التجميع.

ومع ذلك ، فإن المهام الوظيفية المفترضة التي يتم تحديدها من خلال التجميع تتطلب التحقق التجريبي المستقل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تضمين جميع الإيجابيات والسلبيات الضرورية باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل البروتينات وتجارب المتابعة الكيميائية الحيوية وعلم الجينوم الكيميائي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول وظائف جينية محددة بالإضافة إلى طبيعة العلاقات الوظيفية بين الجينات والمسارات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء سلالات متحولة مزدوجة ، وتجميع مصفوفات المتلقين ، وإجراء شاشات ESGA للتحقيق في العلاقات الوظيفية بين الجينات والعمليات في الإشريكية القولونية.