الخرز وفصل الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك متعدد القنوات باستخدام Dielectrophoresis وتدفق رقائقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في الخلايا والخرزات داخل الأجهزة الموائع دقيقة باستخدام الرحلان الكهربائي العازل أو DEP باستخدام لوحات الدوائر المطبوعة أو PCBs. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تصميم وتجهيز أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة وقنوات الموائع الدقيقة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تجهيز تجميعة الموائع الدقيقة للوحة الدوائر المطبوعة ومحاليل الخرزات والخلايا.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في ملء القنوات بوسط ذي موصلية منخفضة، ثم تحميل الخرزات والخلايا. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في توصيل تجميعة لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) بمضخم القدرة ومولد الدوال، ثم بدء عملية DEP. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر فصل ومعالجة الخلايا والخرزات في الأجهزة الموائع دقيقة من خلال استخدام DEP.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن المستخدم يجب أن يستوعب مبادئ DEP من أجل تطوير قطب كهربائي فعال يعمل مع جهاز ميكروفلويديك للتلاعب بالخلايا أو الحبيبات المطلوبة. ومن ناحية أخرى، فإن استخدام لوحات الدوائر المطبوعة (PCBs) كأقطاب كهربائية يجعل تحفيز الخلايا والحبيبات في أجهزة الميكروفلويديك متاحًا لمجموعة متنوعة من التخصصات العلمية. وتتمثل الخطوة الأولى من هذا الإجراء في تصميم لوحة الدوائر المطبوعة أو أقطاب PCB بحيث تمتلك الهندسة المطلوبة لتوليد مجال كهربائي غير منتظم.

عند اكتمال التصميم، اطلب رقاقات أقطاب PCB المخصصة من خلال منشأة تصنيع تجارية. بعد وصول لوحة PCB المصنعة حسب الطلب، افتحها وافحصها من أجل هذا العرض التوضيحي. يبلغ طول لوحة PCB ‏ 8.4 centimeters وعرضها 2.1 centimeters.

يبلغ عرض الأقطاب الكهربائية المعدنية خمسة مليمترات. وفي هذا المثال، تتكون الأقطاب من شريطين معدنيين طويلين ومنطقتين عرضيتين بطول 4.5 مليمتر حيث تكون الأقطاب متداخلة. وتولد هذه المناطق المتداخلة مجالاً كهربائياً قوياً وغير منتظم لإنشاء اتصال من المحفز إلى قطب لوحة الدوائر المطبوعة (PCB).

ضع سلكاً بمعيار 16 على طرف القطب الكهربائي. استخدم مكواة لحام ساخنة لتثبيت السلك في مكانه على المنطقة المعدنية من لوحة الدائرة المطبوعة (PCB). يؤدي ذلك إلى تسخين السلك.

ثبت سلك اللحام على السلك المسخن واسمح لكمية صغيرة من اللحام بالتدفق إلى داخل السلك. بعد امتلاء السلك باللحام، ارفع كاوية اللحام مع الاستمرار في تثبيت السلك في مكانه حتى يبرد اللحام. كرر عملية اللحام للوصلة الكهربائية الأخرى على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB).

تتمثل الخطوة التالية في تحضير قنوات مائعية دقيقة بنمط التفرع المطلوب. باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق القياسية، قم بإنشاء قالب رئيسي لتحديد القنوات باستخدام رقاقة سيليكون ومقاوم ضوئي من نوع SU eight. يحتوي هذا القالب الرئيسي على قناة إدخال واحدة وثلاث قنوات مستهدفة.

يبلغ عرض القنوات 100 micrometers، ويبلغ ارتفاع القنوات 27 micrometers. بمجرد إنشاء القالب الرئيسي، اخلط بوليمر LAANE أو مطاط PDMS مع عامل معالجة بنسبة وزنية 10 إلى 1 لمدة خمس دقائق. صب PDMS السائل فوق قالب SU eight الرئيسي مسبق الصنع، وقم بإزالة الفقاعات الهوائية عن طريق تعريض PDMS السائل للتفريغ لمدة ثلاث دقائق.

كرر عملية التفريغ عند الحاجة لإزالة كافة الفقاعات تماماً. يمكن استخدام تدفق من غاز النيتروجين لإزالة الفقاعات الإضافية إذا لزم الأمر. يتم معالجة PDMS في فرن عند 70 °C لمدة ساعتين.

استخدم شفرة حلاقة لإزالة طبقة P-D-M-S-S التي تحتوي على القنوات الموائعية الدقيقة من الرقاقة، مع الحرص على عدم كسر الرقاقة مع توجيه مساحة القناة للأعلى. استخدم خرامة خزعات لعمل ثقوب لإدخال السوائل والخلايا في الجهاز الموائعي الدقيق. ثم قم بالتشذيب.

أي PDMS زائد. افحص الجهاز الموائع الدقيقة للتأكد من خلوه من الغبار والرواسب. استخدم شريط 3M Scotch Magic لتنظيف PDMS.

قم بتعريض قنوات PDMS وشريحة غطاء نظيفة رقم صفر بسماكة تتراوح من 80 إلى 130 ميكرومتر لغاز البلازما لمدة 1.5 دقيقة. قم بإزالة مختبر PDMS وشريحة الغطاء من جهاز تنظيف البلازما في طبق بيتري؛ لربط البلازما، قم بوضع قنوات PDMS للموائع الدقيقة فوق شريحة الغطاء، ثم قم بتسخين مجموعة الموائع الدقيقة الخاصة بشريحة الغطاء على لوح تسخين مضبوط عند 100 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. تتمثل الخطوة النهائية في تحضير جهاز الموائع الدقيقة في وضع قنوات PDMS وشريحة الغطاء فوق أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة (PCB).

ابدأ بوضع حوالي 10 µL من الزيت المعدني على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB). ولضمان التلامس المحكم بين لوحة الدوائر المطبوعة والغطاء الزجاجي، ضع مجموعة القنوات الموائعية الدقيقة للغطاء الزجاجي فوق لوحة الدوائر المطبوعة المزيّتة مع الغطاء الزجاجي. وعند ملامسة الزيت، اضغط بلطف على مجموعة القنوات الموائعية الدقيقة للغطاء الزجاجي لضمان التلامس الجيد وتقليل الفقاعات الهوائية التي قد تعيق رؤية الخلايا والخرزات.

تتمثل خطوة مهمة أخرى في تحضير خليط الوسط منخفض الموصلية، المكون من 8.5% sucrose و0.3% glucose وزن إلى حجم في ماء منزوع الأيونات. أصبح الجهاز الموائع الدقيق الآن جاهزاً للاستخدام؛ وباستخدام ماصة، يتم ملء كل قناة موائع دقيقة بـ 15 إلى 20 µL من الوسط منخفض الموصلية إذا لزم الأمر. استخدم الشفط بالتفريغ لإزالة أي فقاعات موجودة في القنوات.

الخطوة التالية هي إدخال الجسيمات الاختبارية في الجهاز الموائع الدقيقة. يستخدم هذا العرض تعليقاً يحتوي على 550 من خرزات البوليستيرين لكل ميكرولتر من وسط منخفض الموصلية، وبما أن الخرزات قد تترسب بمرور الوقت، يجب إعادة تعليقها عن طريق الرج. ثم باستخدام ماصة، يتم إدخال 200 ميكرولتر من تعليق خرزات البوليستيرين في القناة.

تتمثل الخطوة التالية في تحضير الأقطاب الكهربائية، وتوصيل مخرج مولد الدوال بمدخل مضخم قدرة التيار المتردد (AC). ثم يتم توصيل مخرج المضخم بأسلاك الأقطاب الكهربائية. قم بتغطية جميع الأسلاك الكهربائية وأسطح الجهاز بشريط لاصق عازل للكهرباء لحماية المستخدمين من التعرض المحتمل لصدمة كهربائية.

اضبط مولد الدوال لإنتاج موجة جيبية بتردد يتراوح من 1 إلى 1.5 megahertz. ابدأ عملية DEP لبدء فرز الخلايا والخرز في هذا الإعداد. تقع قناة المدخل إلى اليمين، بينما تنفصل القنوات المستهدفة الثلاث عند الوصلة ثلاثية التشعب.

تتوافق أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) مع الخطوط السوداء في غياب التدفق الصفائحي وفي غياب قوة عزل dielectrophoresis (DEP). تظل الخرزات ثابتة أساساً عند بدء تطبيق DEP، ولكن في غياب التدفق. وتهاجر الخرزات نحو أقطاب PCB وبعيداً عن المسافة الفاصلة بين الأقطاب عند تشغيل التدفق الصفائحي.

عندما يكون نظام DEP متوقفاً، تتوزع الخرزات المتدفقة عبر قنوات المدخل بين القنوات الثلاث المستهدفة. أما عند تفعيل DEP مع وجود تدفق صفيحي، يتم توجيه الخرزات للتدفق في القناة المركزية فقط. وفي الفيديوهات التالية، تم تدوير الجهاز الموائع الدقيقة فوق أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة (PCB)، مما أدى إلى تغيير اتجاه القنوات.

فيما يتعلق بأقطاب لوحة الدوائر المطبوعة (PCB). أصبحت قناة المدخل، التي كانت متعامدة سابقاً مع أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة، الآن موازية تقريباً للأقطاب عند تشغيل التدفق الصفائحي. ولكن عند إيقاف تشغيل DEP، تدخل الخرزات في القنوات المستهدفة الثلاث بالتساوي.

عند بدء عملية DEP، تقترب الخرزات من نقطة التشعب وتعمل قوة DEP على سحب الخرزات إلى القناة الجانبية الموجودة فوق القطب الكهربائي. تظهر مجموعة الصور التالية في الفيديو خليطاً من خلايا سرطان القولون البشري (human colon adenocarcinoma) أو خلايا HT 29 وخرزات فلورية في جهاز الموائع الدقيقة. وفي هذه الصورة المأخوذة بتقنية DIC، يشير السهم المفتوح إلى اتجاه التدفق الصفائحي، كما تم تحديد القنوات بخطوط متقطعة.

يمكن رؤية الأقطاب الكهربائية المعدنية العاكسة كشريط خلفية فاتح، ويُستخدم مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) لتصوير الخرزات أثناء التوهج. تم استخدام شدة المقياس في الصور لجعل الخلايا أكثر وضوحاً.

هذا الشكل هو نفس الصورة الموجودة في الشكل الآخر، باستثناء أنه معروض كصورة كثافة بمقياس توهج (glow scale)، وذلك بهدف تصور الخلايا والخرز معاً. وتظهر الأقطاب الكهربائية المعدنية العاكسة كخطوط صفراء وخضراء في هذا الشكل. ومع تطبيق DEP، يخرج الخرز من القناة اليمنى كما هو موضح في صورة DIC، بينما تخرج خلايا HT 29 من القناتين المركزية واليسرى كما هو موضح في صورة مقياس التوهج قبل بدء DEP. يتدفق محلول مختلط من الخلايا والخرز من قناة مدخل واحدة إلى ثلاث قنوات مستهدفة منفصلة.

بعد تحفيز DEP، يتم توجيه الخرزات والخلايا بشكل انتقائي إلى قنوات منفصلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية البدء في تطبيق الرحلان الكهربائي القرصي لمعالجة الخلايا والخرزات داخل الأجهزة الموائعية الدقيقة.