ميكروفلويديك تبادل العازلة لمايكرو / الجسيمات النانوية هندسة الخلايا خالية من التدخل

الهدف العام من هذا الإجراء ، هو إظهار تقنية تنقية الموائع الدقيقة المريحة والفعالة وعالية الإنتاجية ، لفصل الجسيمات النانوية الحرة عن الخلايا ، بعد هندسة الخلايا مع الجسيمات النانوية. تتمثل الحاجة الرئيسية لهذه التقنية في السماح بالإزالة السريعة والفعالة للجسيمات النانوية غير المنضمة بعد إجراء عمل الخلية ، نقوم بجمع كل ما لدينا. تحقق تقنية تنقية الخلايا الموائع الدقيقة هذه فصلا فعالا على أساس الحجم بسبب تأثيرات التركيز بالقصور الذاتي التفاضلية للخلايا والجسيمات النانوية في جهاز دقيق حلزوني.

يمكنه معالجة ما يصل إلى 10 ملايين خلية لكل تركيز مل وهو أمر مفيد جدا للطب التجديدي ، بالإضافة إلى معالجة خلايا حجم المزلاج. هذه التقنية مرغوبة للغاية في مجال هندسة الخلايا ، والذي غالبا ما يستخدم الجسيمات النانوية لخلايا العمل ، لغرض التصوير أو التحكم في الوظيفة. سيوضح الإجراء هوي مين تاي ، مساعد باحث من مختبري ، بالإضافة إلى الدكتور ديفيد يو ، زميل أبحاث ما بعد الدكتوراه من مختبر البروفيسور شي.

زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى أكثر من 80٪ من التقاء على صفيحة ستة آبار قبل وضع العلامات على الخلايا بالجسيمات النانوية. وبالمثل ، قم بزراعة خلايا THP-1 بكثافة مليون خلية لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بإذابة ملليغرام واحد من جزيئات السيليكا النانوية مع مليلتر واحد من مائتي محلول صبغة كالسيوم ميكرومولار.

وحرك الجزيئات بين عشية وضحاها. أيضا ، قم بتصنيع جسيمات الكالسيوم النانوية PLGA AM باستخدام الطرق الموضحة في المرجع الموضح هنا. امزج إما ملليغراما واحدا من جزيئات الكالسيوم النانوية PLGA أو 150 ميكروغراما من جزيئات سيليكا الكالسيوم النانوية في محلول 01٪ بولي إل ليسين في الماء عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل لمدة دقيقة واحدة.

ثم اتركه يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. الطرد المركزي التالي للجسيمات النانوية. قم بإزالة المادة الطافية الزائدة من بولي ليسين وأعد تعليق الجسيمات النانوية في مليلتر واحد من وسط الثقافة المناسب لنوع الخلية المراد تسميته.

أضف 1 ملليغرام من الجسيمات النانوية المسماة إلى مليلتر واحد من الوسط لكل مليون خلية في المزرعة. ماصة خليط الخلايا والجسيمات النانوية والوسط جيدا لمدة دقيقة واحدة. ثم احتضان الخليط لمدة 24 ساعة تقريبا.

بمجرد وضع العلامات ، قم بفصل الخلايا الجذعية وحصادها ، وإعادة تعليقها إلى تركيز يتراوح بين 100 ، 000 و 1 ، 000 ، 000 خلية لكل مليلتر لمعالجة الموائع الدقيقة. استخدم خلايا THP-1 المسمى بنفس التركيز. من أجل تصنيع الجهاز الحلزوني الموائع الدقيقة ، قم أولا بإعداد قالب رئيسي لبسكويت الويفر باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق القياسية.

بعد ذلك ، اخلطي 30 جراما من البوليمر الأساسي PDMS وثلاثة جرامات من عامل المعالجة جيدا في قارب الوزن. قم بإزالة الخليط تحت الفراغ لمدة 60 دقيقة لإزالة أي فقاعات هواء. صب خليط PDMS على القالب الرئيسي ، المزخرف بتصميم القناة الحلزونية ، بعناية على ارتفاع يتراوح من خمسة إلى 10 ملليمترات.

ثم قم بإزالة الخليط لمدة 60 دقيقة لإزالة أي فقاعات هواء. كرر هذه العملية حتى يتم التخلص من جميع الفقاعات. بعد ذلك ، ضع الرقاقة في الفرن ، وتأكد من عدم إمالة الرقاقة أثناء المعالجة ، لضمان ارتفاع ثابت للجهاز.

عالج PDMS عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. بمجرد أن يبرد ، قم بقطع جهاز PDMS الحلزوني باستخدام مشرط وقشر لوح PDMS بعناية من القالب الرئيسي. بعد ذلك ، استخدم مشرطا لتقليم حواف الجهاز لضمان سطح أملس للترابط.

بعد ذلك ، استخدم ثقب خزعة 1.5 ملم لإنشاء فتحتين للمداخل ، وفتحتين للمنافذ. اغسل الجهاز بالأيزوبروبانول لإزالة أي حطام. وجفف الجهاز في فرن 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، استخدم شريطا لاصقا لتنظيف السطح السفلي لجهاز PDMS ، وجانب واحد من الشريحة الزجاجية. ضع الشريحة الزجاجية وجهاز PDMS بعناية في غرفة البلازما مع تعرض الأسطح النظيفة. قم بتشغيل طاقة البلازما إلى الحد الأقصى ، وقم بخفض ضغط الغرفة حتى يتحول لون الغرفة إلى اللون الوردي ، وكشف المكونات لمدة 60 ثانية.

ثم قم بإزالة الشريحة وجهاز PDMS من الغرفة. وربطهم معا عن طريق الضغط على الأسطح المكشوفة للبلازما معا بإحكام. تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة بين السطحين.

قم بتسخين الجهاز المرتبط على لوح ساخن على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعتين لتقوية الرابطة. قم بقص قطعتين من الأنابيب بطول 15 إلى 20 سم للمداخل ، وقم بإرفاق إبرة قياس 23 على أحد طرفي كل أنبوب. بعد ذلك ، قم بقص قطعتين من نفس الأنبوب بطول خمسة إلى 10 سم للمنافذ ، وقم بتوصيلها بفتحات مخرج الجهاز.

قبل تشغيل العينة ، قم بتجهيز الجهاز يدويا بحقنة تحتوي على 70٪ من الإيثانول حتى يتدفق من أنبوب المخرج. اترك الإيثانول في الجهاز لمدة 30 ثانية على الأقل لتعقيمه. ثم قم بتحميل 30 مل من PBS المصفى مع 1٪ BSA في حقنة سعة 60 مل.

أيضا ، قم بتحميل ثلاثة ملليلتر من الخلايا الملصقة في حقنة سعة ثلاثة ملليلتر وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة في أي من المحقنتين. قم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق إخراج بضع قطرات من السائل برفق من الفوهة. قم بتوصيل أطراف مدخل الحقنة والأنابيب بالمحاقن وقم بتأمين المحاقن بمضخات الحقنة.

أدخل الأنابيب في مداخل الجهاز الخاصة بها ، وتأكد من عدم وجود فقاعات على طول الأنبوب. مع إعداد السوائل الآن ، قم بتركيب الجهاز على مجهر تباين الطور المقلوب للتصوير في الوقت الفعلي أثناء عملية فرز الخلايا. قم بتأمين دورق نفايات صغير وأنبوبين سعة 15 مليلتر بالقرب من الجهاز على مرحلة المجهر.

ضع أنبوب المخرج من كلا منفذي الجهاز في دورق النفايات. الآن ، اضبط نسبة التدفق للعينة إلى المخزن المؤقت للغمد على واحد إلى 10 عن طريق ضبط معدل تدفق حقنة العينة على 120 ميكرولتر في الدقيقة وحقنة الغمد إلى 1 ، 200 ميكرولتر في الدقيقة. قم بتشغيل الجهاز لمدة دقيقة ونصف لمنح معدل التدفق فرصة للاستقرار.

استخدم كاميرا عالية السرعة لتأكيد وجود خلايا مركزة بالقصور الذاتي بالقرب من الجدار الداخلي للقناة تحت مجال ساطع مع تباين الطور. بمجرد تحقيق تدفق الحالة الثابتة ، وتشغيل الجهاز بشكل صحيح ، ضع أنابيب المخرج في قوارير مختلفة لجمع مواد منفصلة من مخرج الخلية ومخرج النفايات. هذا الجهاز قادر على فرز التعليق المسمى لخلايا THP-1 أحادية الخلية بشكل صحيح من جزيئات السيليكا النانوية الفلورية.

تم الحصول على كفاءات فصل عالية كما تم تأكيدها من خلال كل من التصوير عالي السرعة وتحليل قياس التدفق الخلوي. تتيح استراتيجية التنقية أحادية الخطوة الاسترداد المستمر للتعليق الملصق والخلايا الملتصقة المعلقة في محلول عازل جديد دون الحاجة إلى الطرد المركزي. الجهاز قادر على الفصل عالي الكفاءة مع كل من جزيئات السيليكا و PLGA النانوية ويمكنه فصل ما يصل إلى 10 ملايين خلية لكل مليلتر بنفس الكفاءة العالية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الخلايا بالجسيمات النانوية. وكيفية تنقية الخلايا الملصقة عن طريق إزالة الجسيمات الزائدة غير المرتبطة باستخدام جهاز الموائع الدقيقة المتخصص.