رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا
أبريل 1, 2011
يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam - طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.
الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا أولا باستخدام مقياس نسبة بروتين مؤشر الكالسيوم ، والذي يستهدف مصفوفة الميتوكوندريا ، بعد يوم أو يومين من التعدي. تم إعداد المجهر الفلوري والبرنامج لتصوير الخلايا الحية.
ثم يتم الحصول على صور للخلايا التي تعبر عن نسبة البيرام المترية عند إضافة ناهض تعبئة الكالسيوم. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي التحليل الكمي للصور المكتسبة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيرات ديناميكية في تركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا من خلال الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية التي تعبر عن نسبة بروتين مؤشر الكالسيوم المتري.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قياس مستويات الكالسيوم باستخدام مؤشرات الكالسيوم الاصطناعية هي أن نسبة البيرام المترية مشفرة وراثيا وبالتالي يمكن استهدافها للميتوكوندريا أو أي جهاز آخر ذي أهمية. مرحبا ، أنا الدكتور أسكار ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور بينينج ، وسأعرض الإجراء اليوم لبدء خلايا الهليكوبتر للوحة البروتوكول في الليلة السابقة ، يتم وضع التعداء على زلات غطاء زجاجي معقم موضوعة في صفيحة ثقافة قياسية من ستة آبار بكثافة ستكون حوالي 70٪ بطلاقة للتعداء في اليوم التالي. في اليوم التالي ، قم بإعداد مجمعات استئصال الدهون بالحمض النووي 2000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بأربعة ميكروغرامات من ناقل التعبير عن الميتوكوندريا المتري ، و 10 ميكرولترات من استئصال الدهون 2000 المخفف في 0.5 مل من الأمثل لكل بئر ليتم نقله.
بعد ذلك ، استبدل وسائط استزراع D-M-E-M-F-B-S HELOC في كل بئر ب 1.5 مل من نفس الوسائط بدون مضادات حيوية. أضف محلول استئصال الدهون إلى محلول الحمض النووي واخلطه برفق بعد تكوين المجمعات. أضف محلول استئصال الدهون من الحمض النووي بالتنقيط إلى كل بئر ليتم نقله عن طريق هز الصفيحة برفق واحتضانها لمدة أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد الحضانة.
استبدل الوسائط بمضادات حيوية تحتوي على D-M-E-M-F-B-S. اسمح للخلايا بالتعبير عن بيرام متري لمدة يوم إلى يومين قبل التصوير باستخدام الملقط. ضع برفق زلة غطاء مع خلايا HELOC في غرفة تصوير مناسبة مع محلول التصوير.
قم بتركيب غرفة التصوير في مرحلة المجهر المقلوب. بعد ذلك ، استخدم هدف غمر الزيت 40 × أو أعلى وطول موجي يبلغ 380 نانومتر. للعثور على منطقة اهتمام تحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن نسبة متري ، يتم استخدام 380 نانومتر هنا لتحديد الخلايا كمقياس نسبة.
البيرام أقل مقاومة للتبييض الضوئي عند هذا الطول الموجي. بمجرد تحديد مجال الاهتمام ، قم بإعداد البرنامج للإثارة المزدوجة عند 495 و 380 نانومتر. بعد ذلك ، احصل على صور متتابعة عن طريق الإثارة بدلا من ذلك عند 495 و 380 نانومتر.
الحصول على صور لمستويات الكالسيوم الأساسية لمدة 30 ثانية على الأقل قبل تطبيق ناهض. ثم قم بتطبيق ناهض تعبئة الكالسيوم عبر جهاز وفرة ، مع ملاحظة أن وقت الإضافة لكل أوقات التعرض للناهض وفترات الاستحواذ يجب تحسينها لمنع تبييض الصور مع السماح بدقة زمنية كافية. بمجرد اكتمال التجربة ، يمكن تحليل الصور في وضع عدم الاتصال.
لبدء التحليل ، حدد منطقة اهتمام داخل منطقة فارغة من الحقل لطرح مضان الخلفية إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، قم بتصدير قياسات نسبة 4 95 3 80 من منطقة الاهتمام إلى Excel أو برامج الرسوم البيانية المماثلة. توضح لوحة الصور هذه التوطين الخلوي للنسبة المترية والميتوكوندريا.
على اليسار توجد صورة خلية حية لخلايا الهليكوبتر التي تعبر عن نسبة البيرام المترية. في المنتصف يوجد تلطيخ الفلورسنت للميتوكوندريا والصبغة الانتقائية تعقب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا الأحمر CMX Ross. وأخيرا على اليمين ، الصورة المدمجة الموضحة هنا عبارة عن سلسلة من الصور الزائفة 4 95 ، 3 80 نانومتر لأربع خلايا هليكوبتر تعبر عن نسبة البيرام المترية في الميتوكوندريا المعالجة ب 10 ميكرومولار A TP ، ويظهر هنا القياس الكمي للتغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا لتلك الخلايا الأربع السابقة في هذه الصورة لخلية هيلا تعبر عن نسبة بيرام متري في الميتوكوندريا.
يتضح عدم تجانس استجابة الكالسيوم في الميتوكوندريا الفردية بالإضافة إلى التجزئة الكبيرة للميتوكوندريا من خلال 60 دقيقة من علاج 0.5 ميكرومولار سبورين. تحتوي بعض الميتوكوندريا على زيادات تذبذبية في الكالسيوم موضحة بالسهم الأبيض ، في حين أن البعض الآخر لا يظهر تغيرات كبيرة في مستوى الكالسيوم الموضح بسهم أصفر. يكشف هذا الرسم البياني عن التغير في مستويات الكالسيوم العالمية للميتوكوندريا في خلية مجسمية واحدة بعد تحريض موت الخلايا المبرمج لمدة 120 دقيقة باستخدام 0.5 ميكرومولار سبورين ستور.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس التغيرات الديناميكية في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا استجابة لمختلف tli باستخدام البروتين العلاجي بالكالسيوم R البيرام الهندسي ، والذي يستهدف بشكل انتقائي مصفوفة الميتوكوندريا.
النظرة العامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس تدفقات الكالسيوم في الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيًا، pericam-mt المعدل. تسمح هذه التقنية بالمراقبة الديناميكية لمستويات الكالسيوم في الخلايا الحية، مما يوفر رؤى حول وظيفة الميتوكوندريا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- التصوير الفلوري
الخلفية
- مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا حاسمة لعملية التمثيل الغذائي والإشارات الخلوية.
- الطرق التقليدية لقياس مستويات الكالسيوم تعتمد غالبًا على مؤشرات تركيبية.
- المؤشرات المشفرة وراثيًا توفر مزايا في الخصوصية والاستهداف.
- تستخدم هذه الدراسة pericam-mt المعدل لتحسين تصوير ديناميكيات الكالسيوم في الميتوكوندريا.
هدف الدراسة
- لمراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا الحية.
- لإظهار استخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيًا الموجه إلى الميتوكوندريا.
- لتوفير بروتوكول مفصل لتصوير وتحليل تدفقات الكالسيوم في الميتوكوندريا.
الطرق المستخدمة
- تشنيع الخلايا بـ pericam-mt المعدل.
- تصوير الخلايا الحية باستخدام الميكروسكوب الفلوري.
- إثارة متتابعة بطولين موجيين لقياس الكالسيوم.
- تحليل كمي للصور الفلورية لتقييم ديناميات الكالسيوم.
النتائج الرئيسية
- تم قياس التغيرات الديناميكية في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا بنجاح.
- تمت ملاحظة عدم تجانس في استجابات الكالسيوم بين الميتوكوندريا الفردية.
- تم ملاحظة تجزئة كبيرة للميتوكوندريا تحت بعض العلاجات.
- أظهرت النتائج فعالية pericam-mt المعدل للتصوير في الوقت الحقيقي.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة ديناميات الكالسيوم في الميتوكوندريا.
- تعزز المؤشرات المشفرة وراثيًا مثل pericam-mt المعدل قدرات التصوير.
- يمكن تطبيق هذه التقنية في ظروف تجريبية مختلفة للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Monitoring mitochondrial calcium dynamics provides critical mechanistic insights into apoptosis pathways, enabling target validation in cell death mechanisms. This genetically encoded sensor approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying organelle-specific calcium fluxes with temporal resolution. The method facilitates early de-risking of therapeutic hypotheses involving mitochondrial dysfunction in disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial calcium as a regulator of apoptotic pathways for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides organelle-specific readouts that reduce ambiguity in mechanistic studies of cell death.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in calcium-mediated apoptosis through real-time flux measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ratiometric data enabling dose-response analysis of compounds affecting mitochondrial calcium.
- Operational Value: Compatible with standard wide-field microscopy, allowing integration into existing imaging platforms without specialized equipment.
- Scalability Value: Enables longitudinal tracking of calcium dynamics and mitochondrial morphology in live cells over hours.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial calcium changes to apoptotic outcomes, supporting biomarker relevance in disease models.
- Operational Value: Demonstrates utility with both ATP (physiological agonist) and staurosporine (apoptosis inducer), broadening applicability across experimental conditions.
- Translational Continuity: Facilitates progression from mechanism discovery to preclinical validation by providing dynamic, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through mechanistic de-risking to preclinical assessment by providing dynamic, quantifiable data on mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium-dependent apoptotic pathways through real-time mitochondrial flux measurements.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized, reproducible calcium readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative ratiometric outputs (495nm/380nm excitation ratio) that allow statistical comparison of calcium dynamics across conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial calcium changes to apoptotic phenotypes, supporting continuity from mechanism to phenotypic outcome.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying mitochondrial dysfunction across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through genetically encoded, organelle-targeted indicators that avoid dye leakage and artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into mitochondrial mechanisms of compound action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial calcium modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for transfection and live-cell imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-excitation capability (380nm and 495nm) and standard filter sets.
- Necessitates standardization of image acquisition protocols and region-of-interest analysis across teams.
- Adaptation considerations include mitochondrial targeting efficiency and potential overexpression artifacts in different cell models.
- Practical limitations include photobleaching risks during long-term imaging and need for optimization of agonist exposure intervals.
