رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا أولا باستخدام مقياس نسبة بروتين مؤشر الكالسيوم ، والذي يستهدف مصفوفة الميتوكوندريا ، بعد يوم أو يومين من التعدي. تم إعداد المجهر الفلوري والبرنامج لتصوير الخلايا الحية.

ثم يتم الحصول على صور للخلايا التي تعبر عن نسبة البيرام المترية عند إضافة ناهض تعبئة الكالسيوم. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي التحليل الكمي للصور المكتسبة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيرات ديناميكية في تركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا من خلال الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية التي تعبر عن نسبة بروتين مؤشر الكالسيوم المتري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قياس مستويات الكالسيوم باستخدام مؤشرات الكالسيوم الاصطناعية هي أن نسبة البيرام المترية مشفرة وراثيا وبالتالي يمكن استهدافها للميتوكوندريا أو أي جهاز آخر ذي أهمية. مرحبا ، أنا الدكتور أسكار ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور بينينج ، وسأعرض الإجراء اليوم لبدء خلايا الهليكوبتر للوحة البروتوكول في الليلة السابقة ، يتم وضع التعداء على زلات غطاء زجاجي معقم موضوعة في صفيحة ثقافة قياسية من ستة آبار بكثافة ستكون حوالي 70٪ بطلاقة للتعداء في اليوم التالي. في اليوم التالي ، قم بإعداد مجمعات استئصال الدهون بالحمض النووي 2000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بأربعة ميكروغرامات من ناقل التعبير عن الميتوكوندريا المتري ، و 10 ميكرولترات من استئصال الدهون 2000 المخفف في 0.5 مل من الأمثل لكل بئر ليتم نقله.

بعد ذلك ، استبدل وسائط استزراع D-M-E-M-F-B-S HELOC في كل بئر ب 1.5 مل من نفس الوسائط بدون مضادات حيوية. أضف محلول استئصال الدهون إلى محلول الحمض النووي واخلطه برفق بعد تكوين المجمعات. أضف محلول استئصال الدهون من الحمض النووي بالتنقيط إلى كل بئر ليتم نقله عن طريق هز الصفيحة برفق واحتضانها لمدة أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد الحضانة.

استبدل الوسائط بمضادات حيوية تحتوي على D-M-E-M-F-B-S. اسمح للخلايا بالتعبير عن بيرام متري لمدة يوم إلى يومين قبل التصوير باستخدام الملقط. ضع برفق زلة غطاء مع خلايا HELOC في غرفة تصوير مناسبة مع محلول التصوير.

قم بتركيب غرفة التصوير في مرحلة المجهر المقلوب. بعد ذلك ، استخدم هدف غمر الزيت 40 × أو أعلى وطول موجي يبلغ 380 نانومتر. للعثور على منطقة اهتمام تحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن نسبة متري ، يتم استخدام 380 نانومتر هنا لتحديد الخلايا كمقياس نسبة.

البيرام أقل مقاومة للتبييض الضوئي عند هذا الطول الموجي. بمجرد تحديد مجال الاهتمام ، قم بإعداد البرنامج للإثارة المزدوجة عند 495 و 380 نانومتر. بعد ذلك ، احصل على صور متتابعة عن طريق الإثارة بدلا من ذلك عند 495 و 380 نانومتر.

الحصول على صور لمستويات الكالسيوم الأساسية لمدة 30 ثانية على الأقل قبل تطبيق ناهض. ثم قم بتطبيق ناهض تعبئة الكالسيوم عبر جهاز وفرة ، مع ملاحظة أن وقت الإضافة لكل أوقات التعرض للناهض وفترات الاستحواذ يجب تحسينها لمنع تبييض الصور مع السماح بدقة زمنية كافية. بمجرد اكتمال التجربة ، يمكن تحليل الصور في وضع عدم الاتصال.

لبدء التحليل ، حدد منطقة اهتمام داخل منطقة فارغة من الحقل لطرح مضان الخلفية إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، قم بتصدير قياسات نسبة 4 95 3 80 من منطقة الاهتمام إلى Excel أو برامج الرسوم البيانية المماثلة. توضح لوحة الصور هذه التوطين الخلوي للنسبة المترية والميتوكوندريا.

على اليسار توجد صورة خلية حية لخلايا الهليكوبتر التي تعبر عن نسبة البيرام المترية. في المنتصف يوجد تلطيخ الفلورسنت للميتوكوندريا والصبغة الانتقائية تعقب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا الأحمر CMX Ross. وأخيرا على اليمين ، الصورة المدمجة الموضحة هنا عبارة عن سلسلة من الصور الزائفة 4 95 ، 3 80 نانومتر لأربع خلايا هليكوبتر تعبر عن نسبة البيرام المترية في الميتوكوندريا المعالجة ب 10 ميكرومولار A TP ، ويظهر هنا القياس الكمي للتغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا لتلك الخلايا الأربع السابقة في هذه الصورة لخلية هيلا تعبر عن نسبة بيرام متري في الميتوكوندريا.

يتضح عدم تجانس استجابة الكالسيوم في الميتوكوندريا الفردية بالإضافة إلى التجزئة الكبيرة للميتوكوندريا من خلال 60 دقيقة من علاج 0.5 ميكرومولار سبورين. تحتوي بعض الميتوكوندريا على زيادات تذبذبية في الكالسيوم موضحة بالسهم الأبيض ، في حين أن البعض الآخر لا يظهر تغيرات كبيرة في مستوى الكالسيوم الموضح بسهم أصفر. يكشف هذا الرسم البياني عن التغير في مستويات الكالسيوم العالمية للميتوكوندريا في خلية مجسمية واحدة بعد تحريض موت الخلايا المبرمج لمدة 120 دقيقة باستخدام 0.5 ميكرومولار سبورين ستور.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس التغيرات الديناميكية في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا استجابة لمختلف tli باستخدام البروتين العلاجي بالكالسيوم R البيرام الهندسي ، والذي يستهدف بشكل انتقائي مصفوفة الميتوكوندريا.