رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الميتوكوندريا في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن الخلايا ببروتين Peram، وهو مؤشر قياس نسبة الكالسيوم الموجه إلى مصفوفة الميتوكوندريا، وذلك بعد يوم أو يومين من عملية الترانسفكشن. يتم إعداد المجهر الفلوري والبرمجيات الخاصة به لتصوير الخلايا الحية.

يتم بعد ذلك الحصول على صور للخلايا التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم القياسي (ratio metric peram) عند إضافة محفز لتعبئة الكالسيوم. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في التحليل الكمي للصور التي تم الحصول عليها. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات الديناميكية في تركيز الكالسيوم الميتوكوندري من خلال الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية التي تعبر عن بروتين مؤشر الكالسيوم القياسي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل قياس مستويات الكالسيوم باستخدام مؤشرات الكالسيوم الاصطناعية، في أن ratio metric peram مشفر جينياً، وبالتالي يمكن توجيهه إلى الميتوكوندريا أو أي عضية أخرى ذات أهمية. مرحباً، أنا د. Ascar، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر د. Benning، وسأقوم بشرح الإجراء اليوم. لبدء البروتوكول، قم بزراعة خلايا helo في الليلة السابقة، حيث يتم إجراء عملية ترانسفكشن على شرائح غطاء زجاجية معقمة موضوعة في طبق زراعة قياسي مكون من ستة آبار، بكثافة تصل إلى 70% تقريباً عند إجراء الترانسفكشن في اليوم التالي. وفي اليوم التالي، قم بتحضير معقدات DNA Lipectomy 2000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، باستخدام 4 µg من ناقل التعبير الميتوكوندري metric peram، و 10 µL من Lipectomy 2000 مخففة في 0.5 mL من optimum لكل بئر سيتم إجراء الترانسفكشن له.

بعد ذلك، استبدل وسط استزراع D-M-E-M-F-B-S HELOC في كل بئر بـ 1.5 milliliters من الوسط نفسه بدون مضادات حيوية. أضف محلول LIPECTOMY إلى محلول DNA واخلطهما برفق بعد تكوين المعقدات. أضف محلول DNA Lipectomy قطرة بقطرة إلى كل بئر سيتم ترنسفكشنه، مع الخلط عن طريق هز الطبق برفق، ثم احضنها لمدة أربع ساعات في حاضنة استزراع خلايا عند 37 °C و 5% carbon dioxide بعد عملية التحضين.

استبدل الوسط بوسط D-M-E-M-F-B-S المحتوي على مضادات حيوية. اترك الخلايا لتعبر عن metric peram لمدة تتراوح من يوم إلى يومين قبل التصوير باستخدام الملقط. ضع بلطف شريحة غطاء تحتوي على خلايا HELOC في غرفة تصوير مناسبة تحتوي على محلول التصوير.

قم بتثبيت غرفة التصوير على منصة مجهر مقلوب. بعد ذلك، استخدم عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 40 x أو أعلى وطول موجي يبلغ 380 nanometers. وللعثور على منطقة ذات أهمية تحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن ratio metric peram، يُستخدم طول موجي 380 nanometers هنا لتحديد الخلايا على أنها ratio metric.

يعد Peram أقل مقاومة للتبييض الضوئي عند هذا الطول الموجي. وبمجرد تحديد المنطقة ذات الأهمية، قم بضبط البرنامج للإثارة المزدوجة عند 495 و 380 نانومتر. بعد ذلك، قم بالتقاط الصور بالتتابع عن طريق الإثارة البديلة عند 495 و 380 نانومتر.

قم بالتقاط صور لمستويات الكالسيوم الأساسية لمدة 30 ثانية على الأقل قبل إضافة الناهض. بعد ذلك، قم بإضافة الناهض المحفز لتعبئة الكالسيوم عبر جهاز التروية، مع تدوين وقت الإضافة لكل فترة تعرض للناهض؛ ويجب تحسين أوقات التعرض وفترات الالتقاط لمنع التبييض الضوئي مع الحفاظ على دقة زمنية كافية. وبمجرد اكتمال التجربة، يمكن تحليل الصور دون اتصال بالإنترنت.

لبدء التحليل، اختر منطقة اهتمام ضمن منطقة فارغة من الحقل لطرح الفلورة الخلفية إذا لزم الأمر. بعد ذلك، قم بتصدير قياسات نسبة 4 95 3 80 من منطقة الاهتمام إلى برنامج Excel أو برنامج رسم بياني مماثل. تعرض هذه اللوحة من الصور التوطن تحت الخلوي لـ peram والمتقدرات (mitochondria) بنظام القياس النسبي.

تظهر على اليسار صورة لخلية حية من خلايا helo التي تعبر عن peram القياسي. وفي المنتصف، يظهر التلوين الفلوري للميتوكوندريا باستخدام الصبغة الانتقائية MIT tracker red CMX Ross. وأخيراً على اليمين، تمثل الصورة المدمجة المعروضة هنا سلسلة من صور النسبة ذات الألوان الزائفة عند 495 و 380 nanometer لأربع خلايا helo تعبر عن peram القياسي في الميتوكوندريا والمعالجة بـ 10 micromolar ATP، كما يظهر هنا في هذه الصورة لخلية hela تعبر عن peram القياسي في الميتوكوندريا القياس الكمي للتغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا لتلك الخلايا الأربع السابقة.

يتضح تباين استجابة الكالسيوم في الميتوكوندريا الفردية، بالإضافة إلى تفتت ملحوظ في الميتوكوندريا، بعد مرور 60 دقيقة من المعالجة بـ 0.5 micromolar staurosporine. تظهر بعض الميتوكوندريا زيادات تذبذبية في الكالسيوم كما يشير السهم الأبيض، بينما لا تظهر ميتوكوندريا أخرى تغيرات ملحوظة في مستوى الكالسيوم كما يشير السهم الأصفر. يكشف هذا الرسم البياني عن التغير في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا العامة في خلية HeLa واحدة بعد تحفيز الموت الخلوي المبرمج لمدة 120 دقيقة باستخدام 0.5 micromolar staurosporine.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس التغيرات الديناميكية في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا استجابةً لمؤثرات مختلفة باستخدام البروتين R geometric peram الحساس للكالسيوم، والذي يتم توجيهه بشكل انتقائي إلى مصفوفة الميتوكوندريا.