تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

يفحص هذا الإجراء تأثيرات GTP ACEs الصغيرة على الاتجار بالغشية المستقطبة. أولا ، قم بحقن بلازميدات الحمض النووي التي تشفر GTP ACE الصغير وبروتينات المراسل في نوى الخلايا للخلايا المستقطبة. ثم عبر عن الحمض النووي في درجات حرارة من شأنها أن تعتفي بروتينات المراسل في الشبكة الإندوبلازمية أو TGN بينما يتراكم GTPA الصغير في العصارة الخلوية ، ويستمر في مطاردة بروتين المراسل إلى سطح الخلية في وجود cyclo heide لمنع المزيد من تخليق البروتين.

أخيرا ، قم بتسمية بروتين المراسل على سطح الخلية لتحليل التألق المناعي. تسمح النتائج التي تم الحصول عليها من هذا الفحص بتصور التغيير في توطين السطح من خلال الفحص المجهري متحد البؤر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل transtransfect هي أنه خلال الأوقات القصيرة من الإفراط في التعبير الذي يتم تحقيقه بالحقن الدقيق ، تكون التأثيرات الثانوية ضئيلة ، مما يسمح لنا بدراسة التأثيرات الأولية للبروتينات ذات الأهمية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال قطبية الخلية ، مثل كيفية تنظيم gtpa الصغير لتهريب الأغشية المستقطبة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تفسير الخطوات الفردية اللازمة لنجاح الحقن المجهري بدون مساعدة بصرية عزل الحمض النووي للبلازما الخالي من السموم الداخلية باستخدام مجموعة أدوات إعداد ماكسي الخالية من السموم الداخلية Sigma Aldrich وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. في هذه التجربة ، استخدم ثلاثة مرشحات شفافة 12 ملم بحجم مسام 0.4 ميكرومتر للثقافة.

تتسع الخلايا أربع مرات في 10 من خلايا MDCK الخامسة على كل مرشح. بعد يومين ، افحص المزرعة تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا تنمو في طبقة أحادية مغلقة. للحقن المجهري.

في يوم الحقن المجهري ، قم بإعداد ألواح 360 × 15 ملم من وسائط نمو خمسة لترات مم بالإضافة إلى 15 ملم ووضعها في حاضنة 39 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد ثلاث ألواح 12 بئر من وسائط نمو MEM واحدة بالإضافة إلى 50 ملليمولار هايس ، و 0.1 ملليغرام لكل مليلتر سيكلوهيكسيميد وضعها في حاضنة 31 درجة مئوية. قم بتشغيل مجهر الحقن المجهري ، وقم بإعداده مثل هذا المجهر المقلوب مع أهداف المرحلة الساخنة 10 × و 32 × ، وطائرة فيمتو einor.

اضبط المرحلة الساخنة على 39 درجة مئوية. افتح أيضا مصدر خزان غاز النيتروجين إلى طاولة الهواء. الآن قم بتخفيف الحمض النووي بالماء المصفى إلى تركيز نهائي يبلغ 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بتدوير الحمض النووي في جهاز طرد مركزي دقيق einor بسرعة 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الجزء العلوي وضعه في أنبوب جديد. بعد ذلك ، قم بإعداد خلايا MDCK عن طريق إخراج المرشح الأول من طبق الاستزراع الخاص به باستخدام الشفرة الجراحية ، وقطع المرشح من حامل المرشح ووضعه في الصفيحة المحضرة 60 × 15 ملم التي تحتوي على خمسة ملليلتر من 39 درجة مئوية درجة حرارة MEM الدافئة بالإضافة إلى 50 ملليمولار.

لوزن المرشح في لوحة المزرعة، ضع الشفرة الجراحية في وسط الفلتر ثم انقل لوحة الثقافة إلى المرحلة الساخنة من المجهر. قم بتحميل اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي المخفف في إبرة الحقن المجهري. قم بلف الغطاء الواقي للإبرة واتركه يسقط على الأرض.

لوضع الإبرة في الحامل ، اضغط على مفتاح القائمة الخاص بالحقن وتأكد من إغلاق الصمام. اربط الإبرة في حاملها. احذر من ربط الإبرة بإحكام شديد.

نظرا لأن ذلك قد يؤدي إلى الكسر ، اضغط على مفتاح القائمة مرة أخرى. لذا فإن ضغط التعويض المطبق سيمنع امتصاص الوسائط في الإبرة أثناء إجراء الحقن المجهري. أخيرا ، اضغط على عصا التحكم لمسح الموجه المخزن لخفض الإبرة على الخلايا.

استخدم الهدف 10 × وأحضر الإبرة إلى شعاع الضوء فوق السائل. ركز الآن على الخلايا. قم بالتركيز لأعلى مرة أخرى عن طريق تدوير عجلة التركيز البؤري لأعلى 180 درجة وابحث عن الإبرة.

حرك الإبرة ببطء إلى التركيز. ثم أخرجه من التركيز مرة أخرى. العمل على التركيز على الخلايا مرة أخرى.

اجعل الإبرة في التركيز مرة أخرى. كرر حتى تلامس الإبرة سطح الوسائط ، وعند هذه النقطة يتم ملاحظة هالة. استمر في الوصول إلى النقطة التي تكون فيها الخلايا في بؤرة التركيز ، لكن الإبرة لا تزال غامضة خارج المستوى البؤري.

الآن قم بالتبديل إلى الهدف 32 x وابحث عن إعدادات الدورة التدريبية. اضبط حد Z عن طريق لمس الغشاء القمي بطرف الإبرة وطرح حوالي 10 ميكرومتر. حيث تضع النوى حوالي 10 ميكرومتر تحت الغشاء القمي.

الآن أحضر الإبرة بضع ميكرون من المستوى البؤري في أسرع وقت ممكن. صوب بالإبرة فوق النواة واضغط على زر الحقن الخاص بعصا التحكم وحرره. ابدأ من 95 رطل لكل بوصة مربعة للعثور على ضغط الحقن المناسب.

إذا كان الضغط مرتفعا جدا ، تنفجر الخلايا. إذا كان الضغط منخفضا جدا ، تستمر نقطة بيضاء ، ولكن لا يحدث شيء آخر. إجراء حقنة ناجحة تنطوي على تغيير الطور دون تغيير حجم الخلية.

حقن 100 إلى 500 خلية داخل فتحة الشفرة الجراحية الموجودة على الخلايا. ثم ضع الخلايا مع طبق الثقافة والشفرة الجراحية في حاضنة 39 درجة مئوية واحتضانها لمدة ساعتين. أخيرا ، قم بنقل الخلايا إلى صفيحة 12 بئر محضرة من مليلتر واحد ، MEM بالإضافة إلى 50 ملليمولار 0.1 ملليغرام لكل مليلتر ، cyclo heide واحتضانها لمدة ساعتين عند 31 درجة مئوية.

من أجل تجنب تبييض إشارة GFP المعبر عنها ، قم بحماية العينات من الضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم أثناء جميع الإجراءات اللاحقة لتلوين السطح. ضع الخلايا في طبق استزراع على صفيحة معدنية على الثلج واغسلها. بمجرد استخدام PBS plus البارد المثلج ، ضع قطعة نظيفة من الطفيلي على الصفيحة المعدنية على ماصة الثلج 30 قطرة ميكرولتر من الجسم المضاد الذي يتعرف على المجال الخارجي للبروتين محل الاهتمام.

الآن ضع الفلتر الذي يحتوي على خلايا رأسا على عقب على القطرة وأضف بضع قطرات من الجسم المضاد على الجانب الخلفي من الفلتر. احتضن لمدة ساعة على الجليد. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS plus المثلج البارد وقم بإصلاحه باستخدام 3٪ ألدهيد بارافورم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

استمر في غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS plus plus وتوازن في PBS plus plus لمدة خمس دقائق. الآن احتضان الخلايا في حظر المخزن المؤقت النفاذ. احتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية من واحد إلى 200 في BPB للكشف عن جهاز الطرد المركزي RAB GTP ACE المعبر عنه لمدة 10 دقائق عند ماصة 13,000 دورة في الدقيقة ، 30 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد على معلمة نظيفة موضوعة في غرفة مبللة.

ضع الخلايا على المرشح رأسا على عقب على قطرات الجسم المضاد واحتضانها لمدة ساعة. في درجة حرارة الغرفة ، ضع الخلايا مرة أخرى على الجانب الأيمن لأعلى في 12. طبق جيدا واغسله خمس مرات على مدار 30 دقيقة باستخدام BPB في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة ، بما في ذلك خطوة الغسيل.

اغمس الخلايا على الفلتر ثلاث مرات في الماء منزوع الأيونات وضع الجانب الأيمن لأعلى على شرائح صغيرة عند 10 ميكرولتر من الحامل ضع زجاجا مغطى بصغر مقاس 18 × 18 ملم في الأعلى وباستخدام مناديل الوجه ، اضغط برفق على زلة الغطاء على الخلايا. أخيرا ، قم بختم طلاء الأظافر في الحقن الوهمي فقط لترميز البلازميد V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. يتم توصيل البروتين إلى السطح القاعدي الجانبي لخلايا MDCK المستقطبة جيدا كما هو محكوم عليه من خلال تلطيخ السطح الأحمر في الخلايا غير المستقطبة جيدا.

سيتم توصيل بعض بروتين اندماج GFP إلى الغشاء القمي. إذا بدت عينات التحكم هكذا ، فلا يمكن الوثوق بالبيانات ويجب تكرار التجربة بخلايا مستقطبة أفضل. لاحظ أنه لا يتم توصيل كل الاندماج المعبر عنه إلى GFP إلى الغشاء القاعدي الوحشي أثناء مطاردة 31 درجة مئوية ، كما يتضح من الإشارة الخضراء الواسعة داخل الخلايا للبروتين الكلي بمجرد إتقانها ، يجب أن تستغرق هذه التقنية حوالي 10 إلى 12 ساعة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تهريب الأغشية لاستكشاف البروتينات التنظيمية في الخلايا الظهارية المستقطبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات في الخلايا الظهارية المستقطبة باستخدام تقنية الحقن المجهري.