مقارنة الانجذاب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة الصلات النسبية لشركاء ربط البروتين ل Row Family GT P ACEs في ظل ظروف تحميل النيوكليوتيدات التي يتم التحكم فيها بعناية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تنقية شركاء الربط التنافسي المفترض أولا ، كل منهم يحمل نفس العلامة ، على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر أو GFP. الخطوة الثانية هي تنقية GTPA ذات الاهتمام.

على سبيل المثال ، RAC واحد وتحميل مع النيوكليوتيدات المناسبة لتحقيق حالة إشارات GTPA المطلوبة. بعد ذلك ، يتم احتضان gtpa المحمل بالنيوكليوتيدات بكمية ثابتة من منافس ملزم واحد وكميات متزايدة من منافس الربط الآخر لتحقيق منحنى ربط المعايرة بالتحليل الحجمي. تتمثل الخطوة الأخيرة في حل البروتينات المرتبطة ب GT pase الجمود بواسطة اللطخة الغربية وفحص الغشاء لعلامة GFP المشتركة بين الشريكين الملزمين.

في النهاية ، يتم استخدام اللطخة الغربية لتحديد التركيزات النسبية التي يتم فيها التقاط كميات مماثلة من كل شريك ربط موسوم ب GFP بواسطة GTPase. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الترسيب المشترك ، هي أن خصائص ربط البروتين ل gtpa تمليها النيوكليوتيدات المرتبطة في الخلية. النيوكليوتيدات المرتبطة قابلة للطي مما يجعل تفسير بيانات ربط البروتين أمرا صعبا.

ابدأ هذا الإجراء بتنقية GST الموسومة G tpa والتعبير عن بروتينات ربط gtpa كما هو مفصل في بروتوكول النص. قم بتنظيف قوارير الخلايا المنقولة في محلول ملحي عازل للفوسفات أو PBS وتصريف القارورة لمدة خمس دقائق. شفط السائل الحر ، ثم كشط الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل في أنبوب فوج دقيق ، وخلط الخلايا للتحلل عن طريق الانعكاس عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

أثناء التحلل ، اغسل مجموعتين من 40 ميكرولترا من حبات مصيدة GFP ثلاث مرات باستخدام رواسب عازلة للتحلل الطازجة. الخرزات عند 2 ، 700 مرة جم لمدة دقيقتين بين الغسيل. بعد التحلل ، قم بتوضيح المحللات عن طريق الطرد المركزي عند 21 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق.

انقل المحللة المصفاة لكل بروتين من البروتينات المنافسة لفصل حبات مصيدة GFP المغسولة. اسمح لبروتينات اندماج GFP بالارتباط لمدة ساعتين ، وخلطها عن طريق الانعكاس عند أربع درجات مئوية. اغسل حبات مصيدة GFP المحملة مرتين في عازلة التحلل ومرتين في المنافسة.

حبات ترسيب عازلة ملزمة عند 2 ، 700 مرة جم لمدة دقيقتين بين الغسيل. تقوم بروتينات اندماج GFP عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من 0.2 مولار جلايسين وسحب العينة لأعلى ولأسفل لمدة 30 ثانية على الفور ، وترسب الخرزات عند 21،000 مرة G لمدة 60 ثانية ونقل السائل إلى أنبوب فوج جديد يحتوي على أربعة ميكرولترات من مولر واحد tris HCL تنفيذ هذه الخطوة بسرعة للحد من الضرر الذي يلحق بالبروتين المنقى. قم بتحليل ميكرولتر واحد من كل بروتين منقى بواسطة لطخة غربية ومسبار بجسم مضاد مضاد ل GFP لتحديد العائد النسبي باستخدام نظام نشاف كمي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

معادلة تركيز البروتين المولي عن طريق إضافة عازلة ملزمة للمنافسة. خذ 90 ميكرولترا من رف ضريبة السلع والخدمات المحضر واغسلها ثلاث مرات باستخدام مخزن تحميل النيوكليوتيدات باستخدام فارز الجسيمات المغناطيسي لترسيب الخرزات في كل خطوة. استنشق المخزن المؤقت من الخرزات وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل النيوكليوتيدات وفقا لما إذا كان G-D-P-G-T-P مطلوبا أو لا يلزم تحميل النيوكليوتيدات.

بالنسبة لتجربة المنافسة ، أضف 12 ميكرولترا من الناتج المحلي الإجمالي 100 ملليمولار ، و 12 ميكرولترا من 10 ملليمولار GTP جاما S أو بدون نيوكليوتيدات إلى 60 ميكرولترا من رف ضريبة السلع والخدمات ، حبة واحدة لعناصر التحكم في تحميل النيوكليوتيدات. قسم الخرزات المتبقية إلى ثلاثة 10 ميكرولتر كوات وأضف ميكرولترين من الناتج المحلي الإجمالي 100 ملليمولار ، ولترين ميكرولترين من 10 ملليمولار GTP جاما S أو بدون نيوكليوتيدات إلى كل أنبوب. احتضن خلطات الخرز لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع التحريض.

قم بتثبيت الرف المرتبط بالنيوكليوتيدات ، واحدا عن طريق إضافة كلوريد المغنيسيوم المولي إلى المزيج التجريبي وخلطات التحكم لأداء ربط المنافسة. قم بإعداد ستة أنابيب صغيرة fuge. يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.

يجب أن يحتوي كل أنبوب أيضا على 10 ميكرولترات من الرف المحمل بالنيوكليوتيدات ، وخرز واحد وخمسة ميكرولترات من الرف. بروتين ربط واحد A كبروتين ربط ثابت لكل أنبوب يضيف 0 1 2 0.55 أو 10 أو 20 ميكرولترا من الرف ، وبروتين ربط واحد B كبروتين ربط متغير. تفترض هذه الأحجام تركيزات مخزون متساوية تقريبا لبروتينات الربط الثابتة والمتغيرة وقد تحتاج إلى تعديل.

اصنع الحجم الإجمالي لخليط الربط إلى 235 ميكرولتر عن طريق إضافة المخزن المؤقت الملزم. بعد ذلك ، قم بإعداد أنبوب fuge صغير يحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمنافسة. 10 ميكرولترات من الرف المحمل بالنيوكليوتيدات التجريبية ، حبة واحدة و 10 ميكرولترات من الرف ، وبروتين ملزم واحد ، ثم قم بإعداد G-D-P-G-T-P جاما S ولا توجد أنابيب تحكم في النيوكليوتيدات كما هو موضح في بروتوكول النص.

احتضان الأنابيب لمدة ساعتين الخلط عن طريق الانعكاس عند أربع درجات مئوية بعد الحضانة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت الملزم. أخيرا ، قم بإزالة البروتينات المرتبطة في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة.

يكشف النشاف الغربي الكمي لعلامة GFP ل GFP RCC 2 المنقى و GFP Corona في مجال C.Propeller واحد أن البروتين الموجود في النطاق العلوي ، GFP RCC two أكثر وفرة بمقدار 1.4 مرة من النطاق السفلي ويجب تخفيفه لتحقيق نسبة مولار واحد إلى واحد لتجربة المنافسة. توضح تجربة التحكم أن حالة تحميل النوكليوتيدات للرف الأول تملي خصوصية الربط ، والمعايرة ، وزيادة أحجام GFP RCC ، اثنان مقابل حجم ثابت من متساوي المولار GFP Corona في مجال مروحة C واحد ، والنشاف. تسمح البروتينات التي ترتبط بالرف الواحد بتصور تغيير نسبي في البروتين المرتبط برسم شدة نطاق GFP لكلا المنافسين على نفس الرسم البياني ، وتحديد النقطة التي تتقاطع عندها الخطوط ، مما يسمح بتحديد حجم البروتين المرتبط المتغير عند التوازن.

ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لضمان أن قضايا مثل التفاعل بين المنافسين أو الطعم الزائد gtpa لا تضر بالتجربة. تشير الزيادة في أحد المنافسين دون فقدان الآخر كما هو موضح هنا ، إلى وجود مشكلة أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر التحقق من وجود علاقة متبادلة بين وفرة الشركاء الملزمين المتنافسين.

هناك عدد من المشكلات التي يمكن أن تشوه النتائج أو يمكن حلها طالما تم تحديدها من خلال فحص البيانات.