مقارنة الانجذاب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة الألفات النسبية لشركاء ربط البروتين لـ Row Family GTPases تحت ظروف تحميل نوكليوتيدية مضبوطة بدقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنقية شركاء الربط التنافسيين المفترضين، بحيث يتم وسم كل منهم بنفس العلامة، على سبيل المثال، البروتين الفلوري الأخضر أو GFP. وتتمثل الخطوة الثانية في تنقية GTPase المعني.

على سبيل المثال، يتم إجراء RAC one وتحميله بالنيوكليوتيد المناسب للوصول إلى حالة إشارات GTPA المطلوبة. بعد ذلك، يتم تحضين gtpa المحمل بالنيوكليوتيد مع كمية ثابتة من منافس ارتباط واحد وكميات متزايدة من منافس الارتباط الآخر للحصول على منحنى ارتباط معاير. وتتمثل الخطوة النهائية في فصل البروتينات المرتبطة بـ GT pase المثبت بواسطة لطخة ويسترن (western blot) وفحص الغشاء بحثاً عن وسم GFP المشترك بين شريكي الارتباط.

في نهاية المطاف، يُستخدم تحليل اللطخة الغربية (Western blot) لتحديد التركيزات النسبية التي يتم عندها التقاط كميات مماثلة من كل شريك ارتباط موسوم بـ GFP بواسطة GTPase. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الترسيب المشترك (co precipitation)، في أن خصائص ارتباط البروتين بـ gtpa تمليها النوكليوتيدة المرتبطة في الخلية. وبما أن النوكليوتيدة المرتبطة تكون غير مستقرة، فإن ذلك يجعل تفسير بيانات ارتباط البروتين أمراً صعباً.

ابدأ هذا الإجراء بتنقية G tpa الموّسم بـ GST وتعبير البروتينات المرتبطة بـ gtpa كما هو مفصل في البروتوكول النصي. اشطف قارورات الخلايا المحولة باستخدام محلول منظم فوسفاتي ملحي أو PBS وقم بتصريف القارورة لمدة خمس دقائق. اسحب السائل الحر، ثم اكشط الخلايا في 500 µL من محلول التحلل في أنبوب طرد مركزي دقيق، واخلط الخلايا للتحليل عن طريق القلب عند 4 °C لمدة 30 دقيقة.

خلال غسل التحلل، اغسل مجموعتين من خرزات GFP trap بسعة 40 µL ثلاث مرات باستخدام محلول التحلل المنظم الطازج. قم بترسيب الخرزات عند 2,700 ×g لمدة دقيقتين بين عمليات الغسل. بعد التحلل، قم بتصفية نواتج التحلل عن طريق الطرد المركزي عند 21,000 ×g لمدة 10 دقائق.

انقل الراشح المصفى لكل من البروتينات المنافسة إلى حبيبات GFP trap مغسولة ومنفصلة. اترك بروتينات GFP المدمجة لترتبط لمدة ساعتين، مع الخلط عن طريق القلب عند درجة حرارة 4 °C. اغسل حبيبات GFP trap المحملة مرتين في محلول التحلل (lysis buffer) ومرتين في محلول المنافسة (competition).

ترسيب الخرز باستخدام محلول الربط (Binding buffer) عند 2,700 ×g لمدة دقيقتين بين عمليات الغسل. يتم استخلاص بروتينات GFP المندمجة عن طريق إضافة 40 µL من glycine بتركيز 0.2 M والماصة صعوداً وهبوطاً لمدة 30 ثانية، ثم يتم ترسيب الخرز فوراً عند 21,000 ×g لمدة 60 ثانية ونقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي جديد يحتوي على 4 µL من tris HCL بتركيز 1 M؛ يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة للحد من تلف البروتين المنقى. يتم تحليل 1 µL من كل بروتين منقى عن طريق لطخة ويسترن (western blot) والتحسس باستخدام جسم مضاد لـ GFP لتحديد الحصيلة النسبية باستخدام نظام لطخة كمي وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

قم بتوحيد التركيز المولي للبروتين عن طريق إضافة محلول منظم للارتباط التنافسي. خذ 90 µL من حبيبات GST rack one المُحضرة واغسلها ثلاث مرات باستخدام محلول منظم لتحميل النيوكليوتيدات، مع استخدام جهاز فرز الجسيمات المغناطيسية لترسيب الحبيبات في كل خطوة. اسحب المحلول المنظم من الحبيبات وأضف 100 µL من محلول منظم لتحميل النيوكليوتيدات بناءً على ما إذا كان المطلوب هو تحميل G-D-P-G-T-P أو عدم تحميل أي نيوكليوتيد.

بالنسبة لتجربة التنافس، أضف 12 µL من GDP بتركيز 100 mM، أو 12 µL من GTP gamma S بتركيز 10 mM، أو لا تضف أي نيوكليوتيد إلى 60 µL من حبيبات GST rack one من أجل ضوابط تحميل النيوكليوتيد. قسّم الحبيبات المتبقية إلى ثلاث حصص سعة كل منها 10 µL، وأضف إلى كل أنبوب 2 µL من GDP بتركيز 100 mM، أو 2 µL من GTP gamma S بتركيز 10 mM، أو لا تضف أي نيوكليوتيد. قم بتحضين خلطات الحبيبات لمدة 30 دقيقة عند 30 °C مع الرج.

قم بتثبيت الرف المرتبط بالنوكليوتيدات عن طريق إضافة كلوريد المغنيسيوم بتركيز 1 molar إلى المزيج التجريبي ومزيج التحكم لإجراء ربط التنافس. قم بتجهيز ستة أنابيب طرد مركزي دقيقة، يحتوي كل منها على 200 microliters من محلول درئة ربط التنافس.

يجب أن يحتوي كل أنبوب أيضاً على 10 µL من الحامل المحمل بالنيوكليوتيدات، وحبة واحدة، و 5 µL من الحامل. وباعتبار البروتين A هو البروتين الرابط الثابت، أضف إلى كل أنبوب 0 أو 1 أو 2 أو 0.55 أو 10 أو 20 µL من البروتين B الرابط كبروتين رابط متغير. تفترض هذه الأحجام وجود تركيزات مخزون متساوية تقريباً للبروتينات الرابطة الثابتة والمتغيرة، وقد تتطلب التعديل.

أكمل الحجم الإجمالي لمزيج الارتباط إلى 235 µL بإضافة منظم الارتباط التنافسي. بعد ذلك، قم بتجهيز أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 200 µL من المنظم التنافسي. أضف 10 µL من النيوكليوتيد التجريبي المحمل على الرف الواحد، وحبيبة واحدة، و 10 µL من بروتين A المرتبط بالرف الواحد. ثم قم بتجهيز أنابيب التحكم الخاصة بـ G-D-P-G-T-P gamma S والأنابيب الخالية من النيوكليوتيد كما هو موضح في البروتوكول النصي.

تُحضن الأنابيب لمدة ساعتين مع الخلط عن طريق القلب بعد انتهاء التحضين في درجة حرارة 4 °C. تُغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام محلول التنافس الارتباطي المنظم. وأخيراً، يتم استخلاص البروتينات المرتبطة في 20 µL من محلول عينة الاختزال المنظم.

يكشف تحليل لطخة ويسترن الكمي لعلامة GFP في بروتيني GFP RCC two وGFP Corona in one C.Propeller المُنقين أن البروتين الموجود في النطاق العلوي، GFP RCC two، أكثر وفرة بمقدار 1.4 مرة من النطاق السفلي، ويجب تخفيفه لتحقيق نسبة مولارية واحد إلى واحد في تجربة التنافس. وتُظهر تجربة ضابطة أن حالة تحميل النيوكليوتيدات في rack one هي التي تحدد خصوصية الارتباط عند معايرة أحجام متزايدة من GFP RCC two مقابل حجم ثابت من GFP Corona in one C propeller domain متساوي المولارية ثم إجراء اللطخة. إن البروتينات التي ترتبط بـ rack one تسمح بتصور التغير النسبي في البروتين المرتبط؛ وبتمثيل شدة نطاقات GFP لكلا المتنافسين على الرسم البياني نفسه، وتحديد النقطة التي تتقاطع عندها الخطوط، يمكن تحديد حجم بروتين الارتباط المتغير عند حالة التوازن.

ومع ذلك، يجب توخي الحذر لضمان عدم تأثير مشكلات مثل التفاعل بين المتنافسين أو زيادة طعم gtpa على سلامة التجربة. إن الزيادة في أحد المتنافسين دون نقصان الآخر، كما هو موضح هنا، تشير إلى وجود مشكلة أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء. ومن المهم تذكر التحقق من وجود علاقة عكسية بين وفرة شركاء الارتباط المتنافسين.

هناك عدد من المشكلات التي يمكن أن تؤدي إلى تشويه النتائج و/أو يمكن حلها طالما تم تحديدها من خلال فحص البيانات.