طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

طريقة اقتصادية لتتبع المصدر الميكروبي باستخدام فيروسات بشرية وحيوانية محددة. تصف الدراسة طريقة اقتصادية لتحديد مصدر التلوث البرازي أو البولي أو التلوث بالنترات في المياه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) للتقدير الكمي المحدد للفيروسات ذات الحمض النووي DNA البشرية والخنزيرية والبقرية، والفيروسات الغدانية (adenoviruses)، والفيروسات الورمية المتعددة (polyomaviruses) المقترحة كأدوات لتتبع المصدر الميكروبي. لقد قمنا بتطوير بروتوكول لتركيز الفيروسات من عينات مياه بحجم 10 liter عن طريق التلبد العضوي باستخدام استخلاص الحليب منزوع الدسم للأحماض النووية الفيروسية من الرواسب، وتقدير كمية فيروسات DNA البشرية أو البقرية أو الخنزيرية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

من المعروف جيدًا أن التلوث الميكروبي للفيتامينات يمثل خطرًا صحيًا كبيرًا، ونحن بحاجة إلى معرفة مصادر هذا التلوث. لذا، اقترحنا استخدام الفيروسات الحمضية النووية (DNA viruses) واسعة الانتشار كأدوات لتتبع المصدر الميكروبي. والفيروسات المختارة هي الفيروسات الغدانية (adenoviruses) والفيروسات بوليومية (polyomaviruses).

يتم إفراز هذه الفيروسات بشكل مستمر على مدار العام وفي جميع المناطق الجغرافية، كما تم تناول ذلك في دراسات سابقة. لقد قمنا بتطوير طرق تركيز قوية ومنخفضة التكلفة للفيروسات في المياه، ونعمل حالياً على تطوير فحوصات QPCR لتقدير كمية الفيروسات الغدانية في الخنازير (purine adenoviruses) والفيروسات التورمية في الأبقار (bovine polyomaviruses).

بالإضافة إلى ذلك، نستخدم الفيروسات الغدانية البشرية (human adenoviruses)، وفيروسات البوليومات NGC Polyomaviruses، التي يتم اختبارها بواسطة QPCR، كعلامات أيضاً على التلوث البشري في المياه، وذلك عند جمع عينات المياه. في هذه الدراسة، يتم جمع أربع مكررات بحجم 10 liter لكل عينة مياه في حاويات بلاستيكية ذات قاع مسطح، بالإضافة إلى عينة إضافية واحدة كعينة ضبط للعملية. سيتم تلقيح هذه العينة الأخيرة بكمية معروفة من الجسيمات الفيروسية المستخدمة كعنصر ضبط.

يتم تحضير ضابط سلبي في المختبر باستخدام مياه الصنبور المجهزة في حاوية بلاستيكية إضافية سعة 10 لتر. إذا كانت العينة تحتوي على كمية كبيرة من المواد العالقة والرمل ومواد أخرى، تُترك لتترسب لمدة 15 دقيقة، ثم يُنقل الماء إلى حاوية جديدة. يتم تركيز الفيروسات عن طريق التلبد العضوي.

يتطلب الكشف عن الفيروسات في عينات المياه منخفضة أو متوسطة التلوث تركيز الفيروسات من عدة لترات من المياه على الأقل في حجم أصغر بكثير. تتضمن إجراءات التركيز تحميض عينات مياه بحجم 10 لتر، والتلبد باستخدام الحليب منزوع الدسم، والترسيب بالجاذبية للندف، وجمع الراسب في 10 ملليلتر من محلول الفوسفات المنظم؛ ولبدء هذه العملية، يتم تحضير محلول لتلبيد الحليب منزوع الدسم في مياه بحر اصطناعية عن طريق إذابة 10 جرام من مسحوق الحليب منزوع الدسم في لتر واحد من مياه البحر الاصطناعية وضبط الـ pH بدقة ليصل إلى 3.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك، وعندها يجب أن يكون التلبد مرئياً.

قم بتحضير المحلول قبل الاستخدام مباشرة أو احفظه عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. يتم تقليب عينات المياه وقياس الموصلية في العينات؛ وفي حال كانت أقل من 1.5 millisiemens، تُضاف أملاح بحرية.

اضبط الرقم الهيدروجيني (pH) لعينة المياه إلى 3.5 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك. سجل قيمة pH للعينات قبل وبعد المعالجة، بالإضافة إلى حجم حمض الهيدروكلوريك المستخدم. كما يجب تسجيل الموصلية الكهربائية أيضاً.

بعد ضبط الرقم الهيدروجيني pH، نضيف 100 ملليلتر من الحليب منزوع الدسم المعد مسبقاً، بنسبة 1% إلى عينة المياه التي يبلغ حجمها 10 لتر، ونقوم بتقليب العينات لمدة تتراوح بين ثماني إلى 10 ساعات للسماح للفيروسات بالامتزاز إلى الندفات. بالنسبة لعينة التدعيم المستخدمة كعينة تحكم في العملية، يضاف الحجم القياسي من فيروس التحكم، ملليلتر واحد على سبيل المثال، إلى العينة. يتم إيقاف التقليب وترك الندفات تترسب بفعل الجاذبية لمدة تتراوح بين ثماني إلى 10 ساعات.

بعد مرور 16 ساعة، وعادةً ما يكون ذلك في اليوم التالي، سنتمكن من جمع الرواسب. وللقيام بذلك، قم بإزالة السائل الطافي باستخدام مضخة 연動ية (peristaltic pump). اجمع الرواسب مع الندف، بحوالي 500 milliliters في زجاجة طرد مركزي.

وازن الأنابيب بإضافة حليب منزوع الدسم مصفى مسبقاً بـ pH 3.5، ثم قم بطرد الأنابيب مركزياً باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة، عند 8,000 Gs لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة أربع درجات مئوية. بمجرد توقف جهاز الطرد المركزي، أخرج أنابيب الطرد المركزي بحذر. صب السائل الطافي وتخلص منه برفق شديد.

قم بإذابة الراسب في كل زجاجة طرد مركزي حتى يصل الحجم النهائي إلى 10 milliliter من الفوسفات، وذلك لاستخلاص الأحماض النووية للفيروسات وقياس كميتها. يُستخدم المركز الفيروسي لاستخلاص الأحماض النووية الفيروسية، وسيتم قياس كمية الفيروسات الغدانية (adenoviruses) وفيروسات البوليوم (polyoma Viruses) المحددة محل الدراسة باستخدام تقنية A-Q-P-C-R. قم بإجراء عملية استخلاص الحمض النووي باستخدام مجموعة key amp viral RNA mini kit.

يتم إجراء تحلل الفيروسات الموجودة في 140 µL من المركزات الفيروسية يدويًا، وتُستخلص الأحماض النووية الكلية في 80 µL. وتتيح هذه المجموعة استخدام منصة مؤتمتة مثل Key cube.

تتمثل الخطوة التالية في تقدير كمية الجينوم الفيروسي. يمكن تقدير عدد النسخ في العينات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مع مجسات Tacman، حيث يمكن تقدير كمية الفيروسات الغدانية البشرية، وفيروسات JC Polyoma، وفيروسات polyoma البقرية في نفس الطبق المكون من 96 بئراً. وبما أن جميعها تستخدم دورات التضخيم نفسها، يجب فحص الفيروسات الغدانية الخنزيرية بشكل منفصل في طبق مستقل لتقدير كمية الفيروس المستهدف.

قم بتحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) في منطقة منفصلة ونظيفة. وبمجرد تحضير المزيج، وزع 15 µL في كل بئر، بما في ذلك عينات الضبط. أضف 10 µL من المستخلصات الحمض النووية من العينات في منطقة منفصلة، مع إجراء فحص مباشر وتخفيف بمقدار عشرة أضعاف في ماء منقى لكل عينة على مكررات؛ سيكون الحجم الإجمالي للتفاعل الواحد بعد إضافة الهدف 25 µL، أي 15 µL من المزيج بالإضافة إلى 10 µL من العينة أو المعيار. غطِّ الآبار التي تحتوي على العينات بجزء من غطاء لاصق.

احتفظ بالجزء الآخر من الغطاء للخطوة التالية. تخفيف AB لمعلقات الحمض النووي DNA القياسية. 10 µL من 10 إلى 0 و10 إلى 6 نسخ جينومية، مكررة ثلاث مرات وباستخدام ماصة دقيقة (micropipette) مخصصة حصرياً لغطاء DNA القياسي.

الآبار التي تحتوي على المعايير مع الغطاء اللاصق الذي تم قصه مسبقاً. يوضح هذا الشكل توزيع عينات معلق المعايير والضوابط في طبق الـ 96 بئراً.

أجرِ تفاعل QPCR في نظام مناسب، مع اختيار المعاملات الملائمة بعد تنشيط amplitude gold لمدة 10 دقائق. وعند درجة حرارة 95 °C، يتم إجراء 40 دورة من التضخيم بمجرد اكتمال التفاعلات. احفظ البيانات والنتائج وفقاً لما هو موضح في دليل المستخدم الخاص بالجهاز المستخدم.

سيتم تحديد كمية DNA على أنها الوسيط للبيانات التي تم الحصول عليها بعد تصحيح عامل التخفيف عند الحاجة. وأظهر مخطط التضخيم والمنحنى القياسي اللذان تم الحصول عليهما لتقدير كمية الفيروسات الغدية الخنزيرية معامل ارتباط قدره 0.999. وتتراوح قيم الميل المقبولة بين -3.1 و -3.6 وفقاً للإجراء المتبع.

تم اختبار الفيروسات البشرية والحيوانية الموصوفة في عينات من المياه الجوفية من منطقة تظهر مستويات عالية من النترات لتحديد مصادر التلوث. أظهرت المكررات الأربعة التي تم تحليلها نتائج إيجابية لمتوسط قيمة الفيروسات الغدانية الخنزيرية، بواقع 7.74 لكل 10² نسخة جينومية لكل لتر، وهو ما يرتبط بوجود ملاط الخنازير في المنطقة المحيطة بموقع أخذ العينات، مما يثبت وجود تلوث برازي خنزيري في المياه الجوفية. ولم يوجد أي تلوث بشري في أي من العينات التي تم اختبارها.

تم تأكيد البيانات الفيروسية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR) وتحليل التسلسل. الخلاصة. قدمنا في هذه الدراسة نتائج تحليل عينات من المياه الجوفية، والتي أظهرت تلوثاً من أصل خنزيري في ظل غياب التلوث البشري أو البقري. كما تم تطبيق هذا الإجراء لتحليل مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه الأنهار.

نعرض هنا الإجراء المتبع لتطبيق هذه الأدوات في تحديد مصدر التلوث في المياه الجوفية، مع تقديم مستويات عالية من النترات كمثال على قابلية تطبيق الطرق المطورة للكشف عن مصدر التلوث في البيئة.