طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتتبع المصدر الميكروبي باستخدام فيروسات بشرية وحيوانية محددة. تصف الدراسة طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث البول البرازي أو التلوث بالنترات في المياه باستخدام تقنية PCR الكمي للتقدير الكمي المحدد للفيروسات DNA البشرية والخنزيرية والبقرية، والفيروسات الغدية (adenoviruses)، والفيروسات đa-العدة (polyomaviruses) المقترحة كأدوات لتتبع المصدر الميكروبي. لقد قمنا بتطوير بروتوكول لتركيز الفيروسات من عينات مياه بحجم 10 لتر عن طريق التلبد العضوي باستخدام استخلاص الحليب منزوع الدسم للأحماض النووية الفيروسية من الرواسب، والتقدير الكمي لفيروسات DNI البشرية أو البقرية أو الخنزيرية باستخدام تقنية PCR الكمي.

من المعروف جيداً أن التلوث الميكروبي للفيتامينات يمثل خطراً صحياً جسيماً، ومن الضروري معرفة مصادر هذا التلوث. لذا، اقترحنا استخدام الفيروسات الحمضية النووية (DNA viruses) واسعة الانتشار كأدوات لتتبع المصدر الميكروبي. والفيروسات المختارة هي الفيروسات الغدانية (adenoviruses) والفيروسات الورمية المتعددة (polyomaviruses).

يتم إفراز هذه الفيروسات بشكل مستمر على مدار العام وفي جميع المناطق الجغرافية، وهو ما تم تناوله في دراسات سابقة. لقد قمنا بتطوير طرق تركيز قوية ومنخفضة التكلفة للفيروسات في المياه، ونعمل حالياً على تطوير مقاييس QPCR لتقدير كمية الفيروسات الغدانية للخنازير والفيروسات متعددة الأوجه البقرية.

بالإضافة إلى ذلك، نستخدم الفيروسات الغدانية البشرية (human adenoviruses)، وفيروسات NGC Polyomaviruses، التي يتم اختبارها بواسطة QPCR، كعلامات أخرى على التلوث البشري في المياه. جمع عينات المياه: في هذه الدراسة، يتم جمع أربع مكررات بحجم 10 liter لكل عينة مياه في حاويات بلاستيكية ذات قاع مسطح، وعينة إضافية واحدة كضابط للعملية. هذه العينة الأخيرة سيتم تلقيحها بكمية معروفة من الجسيمات الفيروسية المستخدمة كضابط.

يتم تحضير ضابط سلبي في المختبر باستخدام مياه صنبور مستوفية للشروط في حاوية بلاستيكية إضافية سعة 10 لتر. إذا كانت العينة تحتوي على كمية كبيرة من المواد العالقة والرمل ومواد أخرى، تُترك لترسيب هذه المواد لمدة 15 دقيقة، ثم يُنقل الماء إلى حاوية جديدة. تركيز الفيروسات عن طريق التندف العضوي.

يتطلب الكشف عن الفيروسات في عينات المياه الملوثة بشكل منخفض أو متوسط تركيز الفيروسات من عدة لترات من الماء على الأقل في حجم أصغر بكثير. تتضمن إجراءات التركيز تحميض عينات مياه بحجم 10 لتر، والترويب باستخدام الحليب منزوع الدسم، والترسيب بالجاذبية للندف، وجمع الرواسب في 10 ملليلتر من محلول الفوسفات المنظم. لبدء هذه العملية، يتم تحضير محلول الترويب من الحليب منزوع الدسم في مياه بحر اصطناعية عن طريق إذابة 10 جرام من مسحوق الحليب منزوع الدسم في لتر واحد من مياه البحر الاصطناعية، مع ضبط pH بدقة ليصل إلى 3.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك، وعندها يجب أن تكون الندف مرئية.

قم بتحضير المحلول مباشرة قبل الاستخدام أو يحفظ في درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. تُقلب عينات المياه ويُقاس الموصلية الكهربائية في العينات. إذا كانت القيمة أقل من 1.5 millisiemens، تضاف أملاح بحرية.

اضبط الرقم الهيدروجيني (pH) لعينة الماء إلى 3.5 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك. سجل الرقم الهيدروجيني (pH) للعينات قبل التهيئة وبعدها، بالإضافة إلى حجم حمض الهيدروكلوريك المستخدم. كما يجب تسجيل الموصلية الكهربائية أيضاً.

بعد ضبط الـ pH، نضيف 100 milliliters من الحليب منزوع الدسم المسبق التدفق، بنسبة 1% إلى عينة المياه سعة 10 liter، ونقوم بتحريك العينات لمدة تتراوح من ثماني إلى 10 ساعات للسماح للفيروسات بالامتزاز على الندف. وبالنسبة لعينة التدعيم المستخدمة كعنصر تحكم في العملية، يتم إضافة الحجم القياسي من فيروس التحكم، 1 milliliter على سبيل المثال، إلى العينة. ثم نوقف عملية التحريك ونترك الندف تترسب بفعل الجاذبية لمدة تتراوح من ثماني إلى 10 ساعات.

بعد مرور 16 ساعة، وعادة ما يكون ذلك في اليوم التالي، سنتمكن من جمع الرواسب. وللقيام بذلك، يتم إزالة السائل الطافي باستخدام مضخة 연동ية (peristaltic pump). اجمع الرواسب مع الندف، بنحو 500 milliliters في زجاجة طرد مركزي.

يتم موازنة الأنابيب بإضافة حليب منزوع الدسم مُعد مسبقاً بـ pH 3.5، ثم تُفصل الأنابيب باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة عند 8,000 Gs لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وبمجرد توقف جهاز الطرد المركزي، تُزال الأنابيب بعناية من الجهاز، ثم يُسكب الطافي ويُتخلص منه برفق شديد.

أذب الراسب في كل زجاجة طرد مركزي ليصل الحجم النهائي إلى 10 milliliter من الفوسفات، ثم قم باستخلاص الأحماض النووية للفيروسات وتقدير كميتها. يُستخدم المركز الفيروسي لاستخلاص الأحماض النووية الفيروسية، ويتم تقدير كمية الفيروسات الغدانية (adenoviruses) وفيروسات البوليوما (polyoma Viruses) المحددة محل الدراسة باستخدام تقنية A-Q-P-C-R. قم بإجراء عملية استخلاص للأحماض النووية باستخدام طقم key amp viral RNA mini kit.

يتم إجراء تحلل الفيروسات الموجودة في 140 µL من المركزات الفيروسية يدويًا، ثم تُستخلص الأحماض النووية الكلية في 80 µL. تتيح هذه المجموعة استخدام منصة مؤتمتة مثل Key cube.

الخطوة التالية هي تقدير كمية الجينوم الفيروسي. يمكن تقدير عدد النسخ في العينات باستخدام تقنية PCR الكمي مع مجسات tac man، حيث يمكن تقدير كمية الفيروسات الغدانية البشرية، وفيروسات JC Polyoma، وفيروسات polyoma البقرية في نفس الطبق ذو الـ 96 بئراً. وبما أن جميعها تستخدم دورات التضخيم نفسها، يجب اختبار الفيروسات الغدانية الخنزيرية بشكل منفصل في طبق مستقل لتقدير كمية الفيروس المستهدف.

قم بتحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) في منطقة نظيفة ومنفصلة. وبمجرد تحضير المزيج، وزع 15 µL في كل بئر، بما في ذلك عينات الضبط. وفي منطقة منفصلة، أضف 10 µL من مستخلصات الحمض النووي من العينات؛ حيث يتم تشغيل كل عينة بشكل مباشر وبتركيز مخفف عشر مرات في ماء منقى وبنسختين مكررتين. سيكون الحجم الإجمالي للتفاعل الواحد بعد إضافة الهدف 25 µL (15 µL من المزيج زائد 10 µL من العينة أو المعيار). قم بتغطية الآبار التي تحتوي على العينات بجزء من غطاء لاصق.

احتفظ بالجزء الآخر من الغطاء للخطوة التالية. تخفيف AB لمعلقات DNA القياسية. 10 µL من 10 إلى 0 إلى 10 إلى 6 نسخ جينومية، ميكرولترات مكررة ثلاث مرات وباستخدام ماص دقيق (micropipette) مخصص حصرياً لغطاء DNA القياسي.

الآبار التي تحتوي على المعايير مع الغطاء اللاصق الذي تم قصه مسبقاً. يوضح هذا الشكل توزيع عينات معلق المعايير وعينات الضبط في طبق الـ 96 بئر.

قم بإجراء تفاعل QPCR في نظام مناسب، مع اختيار المعلمات الملائمة بعد تفعيل amplitude gold لمدة 10 دقائق. وعند درجة حرارة 95 درجة مئوية، يتم إجراء 40 دورة من التضخيم بمجرد اكتمال التفاعلات. احفظ البيانات والنتائج كما هو موضح في دليل المستخدم الخاص بالجهاز المستخدم.

سيتم تحديد كمية DNA على أنها الوسيط للبيانات التي تم الحصول عليها بعد تصحيح عامل التخفيف عند الحاجة. وقد أظهر مخطط التضخيم والمنحنى القياسي اللذان تم الحصول عليهما لتقدير كمية الفيروسات الغدانية الخنزيرية (porcine adenoviruses) معامل ارتباط قدره 0.999. وتتراوح قيم الميل المقبولة بين -3.1 و -3.6 وفقاً للإجراء المتبع.

تم اختبار الفيروسات البشرية والحيوانية الموصوفة في عينات من المياه الجوفية مأخوذة من منطقة تظهر مستويات عالية من النترات لتحديد مصادر التلوث. أظهرت المكررات الأربعة التي تم تحليلها نتائج إيجابية لمتوسط قيمة الفيروسات الغدية الخنزيرية، 7.74 لكل 10² نسخة جينومية لكل لتر، وهو ما قد يرتبط بوجود مخلفات الخنازير السائلة في المنطقة المحيطة بموقع أخذ العينات، ومن شأنه أن يثبت وجود تلوث برازي خنزيري في المياه الجوفية. ولم يتم العثور على أي تلوث بشري في أي من العينات المختبرة.

تم تأكيد البيانات الفيروسية عن طريق تقنية PCR المتداخلة وتحليل التسلسل. الخلاصة. قدمنا في هذه الدراسة نتائج تحليل عينات من المياه الجوفية، والتي أظهرت تلوثاً من أصل خنزيري في ظل غياب التلوث البشري أو البقري. كما تم تطبيق هذا الإجراء على تحليل مياه الاستحمام، ومياه البحر، ومياه الأنهار.

نقدم هنا إجراء تطبيق هذه الأدوات لتحديد مصدر التلوث في المياه الجوفية، مع عرض المستويات العالية من النترات كمثال على مدى قابلية تطبيق الطرق المطورة للكشف عن مصدر التلوث في البيئة.