طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية
December 3rd, 2011
دراسة توضح طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث برازي / البول أو التلوث النترات في المياه باستخدام qPCR الكمي للفيروسات محددة من الحمض النووي البشري / الخنزير / البقر ، والفيروسات الغدية polyomaviruses ، على النحو المقترح أدوات MST.
طريقة فعالة من حيث التكلفة لتتبع المصادر الميكروبية باستخدام فيروسات بشرية وحيوانية محددة. تصف الدراسة طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث البول البرازي أو التلوث بالنترات في الماء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للقياس الكمي المحدد لخنازير الخنزير البشرية ، والأبقار ، وفيروسات الحمض النووي ، والفيروسات الغدية ، وفيروسات الأورام المتعددة المقترحة كأدوات لتتبع المصدر الميكروبي. لقد قمنا بتطوير بروتوكول لتركيز الفيروسات من عينات الماء سعة 10 لترات عن طريق التلبد العضوي باستخدام استخراج الحليب منزوع الدسم للأحماض النووية الفيروسية من الرواسب والقياس الكمي لفيروسات DNI الأبقار البشرية أو الخنازير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
من المعروف أن التلوث الميكروبي للفيتامين يمثل خطرا صحيا كبيرا ونحتاج إلى معرفة مصادر التلوث. لقد اقترحنا استخدام فيروسات الحمض النووي شديدة الانتشار كأدوات لتتبع المصادر الميكروبية. الفيروسات المختارة هي الفيروسات الغدية وفيروسات الأورام.
وتفرز تلك الفيروسات باستمرار على مدار السنة وفي جميع المناطق الجغرافية. درس في دراسات سابقة. لقد طورنا طرقا قوية منخفضة التكلفة للتركيز للفيروسات في الماء ، ونعمل على تطوير فحوصات QPCR للقياس الكمي للفيروسات الغدية البيورين وفيروسات الورم البقري.
بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم الفيروسات الغدية البشرية ، فيروسات الورم المتعدد NGC ، التي تم اختبارها بواسطة QPCR ، أيضا كعلامات للتلوث البشري في الماء ، وجمع عينات المياه. في هذه الدراسة ، يتم جمع أربعة نسخ مكررة من 10 لترات لكل عينة ماء في حاويات بلاستيكية ذات قاع مسطح وعينة إضافية واحدة كتحكم في العملية. سيتم زرع هذه العينة الأخيرة بكمية معروفة من الجسيمات الفيروسية المستخدمة كعنصر تحكم.
يتم تحضير عنصر تحكم سلبي في المختبر باستخدام ماء الصنبور في حاوية بلاستيكية إضافية سعة 10 لترات. إذا كانت العينة تحتوي على كمية عالية من المواد العالقة والرمل والمواد الأخرى ، اتركها تترسب لمدة 15 دقيقة ، وانقل الماء إلى وعاء جديد. تركيز الفيروس عن طريق التلبد العضوي.
يتطلبالكشف عن الفيروسات في عينات المياه منخفضة أو معتدلة التلوث تركيز الفيروسات من عدة لترات على الأقل من الماء إلى حجم أصغر بكثير. يشمل إجراء التركيز تحمض عينات المياه سعة 10 لترات التلبد باستخدام جاذبية الحليب منزوع الدسم ، وترسيب القطعان وجمع الراسب في 10 مل من عازلة الفوسفات لبدء العملية ، ويتم تحضير محلول تحديد موقع الحليب الخالي من الدسم في مياه البحر الاصطناعية عن طريق إذابة 10 جرامات من مسحوق الحليب الخالي من الدسم في لتر واحد من مياه البحر الاصطناعية وضبط الرقم الهيدروجيني بعناية إلى 3.5. مع حمض الهيدروكلوريك ، يجب أن يكون القطيع مرئيا.
قم بإعداد المحلول قبل استخدامه مباشرة أو تخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. يتم تقليب عينات الماء وقياس الموصلية في العينات. إذا كان أقل من 1.5 مللي سيمن ، فستضاف أملاح البحر.
اضبط درجة الحموضة في عينة الماء إلى 3.5 بإضافة حمض الهيدروكلوريك. سجل درجة الحموضة للعينات قبل التكييف وبعده ، وكذلك حجم حمض الهيدروكلوريك المستخدم. يجب أيضا تسجيل الموصلية.
بعد ضبط الأس الهيدروجيني ، نضيف 100 مل من الحليب الخالي من الدسم ، و 1٪ إلى عينة الماء سعة 10 لترات ، ونقلب العينات لمدة ثماني إلى 10 ساعات للسماح للفيروسات بالامتصاص في القطعان. بالنسبة لعينة السنبلة المستخدمة كعنصر تحكم في العملية ، أضف الحجم القياسي لفيروس التحكم ، مليلتر واحد ، على سبيل المثال ، إلى العينة. أوقف التقليب واترك القطيع يرسب بالجاذبية لمدة ثماني إلى 10 ساعات.
بعد 16 ساعة ، عادة في اليوم التالي ، سنكون قادرين على جمع الرواسب. للقيام بذلك ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام مضخة تمعجية. اجمع الرواسب مع القطعان ، حوالي 500 مل في زجاجة جهاز طرد مركزي.
قم بموازنة الأواني عن طريق إضافة الحليب الخالي من الدسم 3.5 ، والطرد المركزي للأواني بجهاز طرد مركزي عالي السرعة ، 8 ، 000 جم 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بمجرد توقف جهاز الطرد المركزي ، قم بإزالة أواني أجهزة الطرد المركزي بعناية من جهاز الطرد المركزي. اسكب بلطف شديد وتخلص من المادة الطافية.
قم بإذابة الحبيبات في كل زجاجة طرد مركزي إلى حجم نهائي من 10 ملليلتر من الفوسفات واستخراج الحمض النووي والقياس الكمي للفيروسات. يستخدم التركيز الفيروسي لاستخراج الأحماض النووية الفيروسية وسيتم قياس الفيروسات الغدية المحددة وفيروسات الورم المتعدد ذات الأهمية بواسطة A-Q-P-C-R. قم بإجراء استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي الفيروسي المصغرة أمبير الرئيسية.
تحلل الفيروسات الموجودة في 140. يتم إجراء ميكرولتر من المركزات الفيروسية يدويا ، ويتم استخراج إجمالي الأحماض النووية إلى 80 ميكرولترا. تتيح هذه المجموعة استخدام نظام أساسي آلي مثل Key cube.
الخطوة التالية هي القياس الكمي للجينوم الفيروسي. يمكن تحديد النسخ الموجودة في العينات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع مجسات الرجل التكسي والفيروسات الغدية البشرية وفيروسات الورم المتعدد JC وفيروسات الورم البقري في نفس لوحة البئر 96. نظرا لأن جميعها تستخدم نفس دورات التضخيم ، يجب اختبار فيروسات الخنازير الغدية بشكل منفصل في لوحة مستقلة لتقدير الفيروس المستهدف.
تحضير مزيج PCR الكمي في منطقة منفصلة نظيفة. بمجرد تحضير المزيج ، خصص 15 ميكرولترا في كل بئر ، بما في ذلك أدوات التحكم. أضف استخراج الحمض النووي من العينات 10 ميكرولتر في منطقة منفصلة ، وقم بتشغيله مباشرة وتخفيف عشرة أضعاف في الماء النقي لكل عينة في تكرار الحجم الكلي لتفاعل واحد بعد إضافة الهدف سيكون 25 ميكرولتر ، 15 من المزيج بالإضافة إلى 10 من العينة أو تغطية قياسية للآبار التي تحتوي على العينات بجزء من غطاء لاصق.
احتفظ بالجزء الآخر من الغطاء للخطوة التالية. تخفيف AB لمعلقات الحمض النووي القياسية. 10 ميكرولتر من 10 إلى صفر إلى 10 إلى ست نسخ جينوم ، تظاهر بالميكرولتر عن طريق النسخ ثلاث مرات واستخدام ميكرو بيبت يستخدم حصريا لغطاء الحمض النووي القياسي.
الآبار التي تحتوي على المعايير مع الغطاء اللاصق مقطوعة مسبقا. يوضح هذا الشكل توزيع عينات التعليق القياسية والضوابط. في لوحة البئر 96.
قم بإجراء QPCR في نظام مناسب ، وحدد المعلمات المناسبة بعد تنشيط الذهب سعة لمدة 10 دقائق. عند 95 درجة مئوية ، يتم إجراء 40 دورة من التضخيم بمجرد اكتمال التفاعلات. تخزين البيانات والنتائج كما هو موضح في دليل المستخدم للمعدات المستخدمة.
سيتم تعريف كمية الحمض النووي على أنها متوسط البيانات التي تم الحصول عليها بعد تصحيح عامل التخفيف عند الحاجة. أظهر مخطط التضخيم والمنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه للقياس الكمي لفيروسات الخنازير الغدية معامل ارتباط قدره 0.999. تتراوح قيم الميل المقبولة بين سالب 3.1 وسالب 3.6 بعد الإجراء.
تم اختبار الفيروسات البشرية والحيوانية الموصوفة في عينات المياه الجوفية من منطقة تحتوي على مستويات عالية من النترات لتحديد مصادر التلوث. أظهرت التكرارات الأربعة التي تم تحليلها نتائج إيجابية لمتوسط القيمة لفيروسات الخنازير الغدية ، 7.74 لكل 10 إلى نسختين من الجينوم لكل لتر ، والتي ستكون مرتبطة بوجود ملاط الخنازير في المنطقة المحيطة بموقع أخذ العينات ، وستثبت وجود تلوث بخزير البراز في المياه الجوفية. لم يكن هناك تلوث بشري في أي من العينات المختبرة.
تم تأكيد البيانات الفيروسية من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل وتحليل التسلسل. استنتاج. في هذه الدراسة ، قدمنا نتائج لتحليل عينات المياه الجوفية ، وعرض تلوث من أصل خنزير في حالة عدم وجود تلوث بشري أو أبقاري. تم تطبيق الإجراء أيضا على تحليل مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه الأنهار.
نقدم هنا إجراء تطبيق هذه الأدوات لتحديد مصدر التلوث في المياه الجوفية ، مع تقديم مستويات عالية من النترات كمثال على قابلية تطبيق الطرق المطورة للكشف عن مصدر التلوث في البيئة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصادر تلوث البراز والبول في الماء. باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، تقيس الطريقة الفيروسات المحددة للحمض النووي البشري، والخنزيري، والبقري، بما في ذلك الفيروسات الغدية والفيروسات متعددة الأشكال، كأدوات لتتبع المصدر الميكروبي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تتبع المصدر الميكروبي
- علم الأحياء الدقيقة البيئية
- تقييم جودة المياه
الخلفية
- يشكل التلوث الميكروبي مخاطر صحية كبيرة.
- تحديد مصادر التلوث أمر بالغ الأهمية للصحة العامة.
- الفيروسات الحمض النووي سائدة ويمكن أن تكون أدوات تتبع فعالة.
- يتم اختيار الفيروسات الغدية والفيروسات متعددة الأشكال لأهميةها.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة لتتبع تلوث البراز في الماء.
- لتكميم الفيروسات الحمض النووي المحددة من عينات الماء.
- لتعزيز فهم مصادر التلوث.
الطرق المستخدمة
- تركيز الفيروسات من عينات الماء حجمها 10 لترات.
- التلبد العضوي باستخدام الحليب منزوع الدسم لاستخراج الأحماض النووية الفيروسية.
- تكميم الفيروسات البشرية، والخنزيرية، والبقرية للحمض النووي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
- تقييم مصادر التلوث من خلال مؤشرات فيروسية محددة.
النتائج الرئيسية
- تركيز وتكميم ناجح للفيروسات المستهدفة.
- فعالية المنهج المثبتة لتتبع المصدر الميكروبي.
- التعرف على الفيروسات الغدية والفيروسات متعددة الأشكال كمؤشرات موثوقة.
- توفير حل فعال من حيث التكلفة لتقييم تلوث الماء.
الاستنتاجات
- الطريقة المتقدمة فعالة لتحديد مصادر التلوث.
- استخدام الفيروسات الحمض النووي يمكن أن يعزز جهود تتبع المصدر الميكروبي.
- يمكن أن يحسن هذا النهج بشكل كبير مراقبة جودة المياه.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
