تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط
أغسطس 1, 2011
وهناك طريقة قوية لدراسة الانهيارات العصبية ، أي الحجم ثابتة رشقات نارية النشاط المكانية والزمانية ، مما يدل على دينامية حالة حرجة في القشرة. الانهيارات الثلجية تظهر تلقائيا في وضع طبقات القشرة السطحية للمثقف الذي يسمح على المدى الطويل قياسات للنشاط متكامل مع المصفوفات مستو متعددة القطب (MEA) في ظل الظروف تسيطر على وجه التحديد.
الهدف من هذه التجربة هو دراسة التنظيم الذاتي لنشاط الدماغ الصحي في الانهيارات الجليدية العصبية ، وهي السمة المميزة لديناميكيات الحالة الحرجة في القشرة. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين شريحة قشرة الطبقات الإكليلية مع شريحة الدماغ المتوسط ، والتي توفر مدخلات دوبامين مهمة من الناحية التنموية للقشرة. كخطوة ثانية ، تزرع الثقافة المشتركة للدماغ المتوسط Cortex على مجموعة متعددة الأقطاب الكهربائية ، مما يسمح بتحفيز وتسجيل الأنشطة العصبية متعددة المواقع في الثقافة.
بعد ذلك ، نسمح للثقافة المشتركة بالتسطيح والتوسع والالتصاق بسطح الشرق الأوسط وأفريقيا خلال أول أسبوع إلى أسبوعين في حاضنة مصممة خصيصا ، والتي تقوم بتدوير الثقافة من خلال التعرض للهواء الطبيعي والثقافة. يتم الحصول على نتائج السوائل التي تظهر التنظيم الذاتي التلقائي لانفجارات المجال المحلي الزماني المكاني في الانهيارات الجليدية العصبية. استنادا إلى تسجيلات الشرق الأوسط وأفريقيا وتحليل الانهيارات الجليدية دون اتصال بالإنترنت الذي يحدد قانون الطاقة في أحجام الانهيارات الجليدية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية ، مثل الثقافات المرتبطة ب dis ، هي أنظمتها وجانب علم الأعصاب. يمكننا أن نشارك في زراعة العديد من مناطق الدماغ معا ، وتؤسس هذه الثقافات متعددة المناطق تنظيما دماغيا صحيحا على نطاقات واسعة مثل الطبقات القشرية وأنظمة الإسقاط. تمتد تطبيقات هذه التقنية إلى ما هو أبعد من مجرد دراسة الانهيارات الجليدية العصبية.
على سبيل المثال ، يمكننا دراسة التحفيز استجابة على مستوى الشبكة في ظل ظروف مختبرية يتم التحكم فيها بدقة. يعد العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم التطبيق السليم لخليط الثرومبين في البلازما ووضع الأنسجة على منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا. تتطلب هذه الخطوات توقيتا مناسبا وتدرج درجة الحرارة الصحيح وتجنب لمس سطح MEA الرقيق مباشرة.
لإعداد غرفة زجاجية معقمة قابلة للغلق للتسجيلات ، قم أولا بقطع الأسطوانات الزجاجية الملولبة بغطاء بلاستيكي من التفلون ، على بعد ملليمترين تقريبا من أسفل الخيط. هذه مطلوبة لإغلاق غرفة الثقافة بشكل آمن ومحكم. ثم نظف الحلقات الزجاجية عن طريق شطفها بالماء ثلاث مرات ، ثم الغليان لمدة خمس دقائق في 200 كحول إيثيلي برهان.
ضعها جانبا لتجف محلول السيليكون مطلوب لربط الحلقات الزجاجية بسطح MEA. استخدم مجموعة مطاط مطاطية من السيليكون 180 4 واقي الخلية واخلط 15 مل من الجزأين A و B جيدا. ثم دعنا نجلس لمدة 15 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
افصل المحلول إلى مليلتر واحد من Eloqua ، وقم بتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه في المستقبل. الآن قم بلصق حلقة زجاجية في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا عن طريق تناول مليلتر واحد من السيليكون عند 23 درجة مئوية في حقنة بإبرة قياس صغيرة وتطبيقها على السطح المقطوع غير المصقول للحلقة الزجاجية. ثم قم بتوسيط الحلقة الزجاجية على MEA وقم بتطبيق طبقة إضافية من السيليكون حول الجزء الخارجي من الحلقة للحصول على ختم أقوى.
دع هذا الشفاء لمدة ساعة إلى ساعتين عند حوالي 60 درجة مئوية على طبق ساخن. بعد ذلك ، قم بتعقيم حجرة MEA وأغطية الغرفة تحت غطاء تدفق الصفيحة عن طريق الشطف ثلاث مرات في الماء منزوع الأيونات أكثر من ثلاث مرات بالكحول بنسبة 70٪ للشطف الأخير. دع الغرفة تجلس لمدة 10 دقائق في الكحول.
اتبع ذلك عن طريق تعريض الغرفة والغطاء الداخلي للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. الأوتوكلاف عند 120 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بمجرد تعقيمها ، اتركها تجف.
الآن قم بتغطية سطح MEA داخل غرفة الاستزراع باستخدام بولي دي لايسين. الكميات المتوسطة الجديدة كما هو مستخدم في هذه التجربة محبة للدهون إلى حد ما ، وبالتالي يتم تغطيتها بالقطرات المتكررة. شفط الحل من شبكة القطب.
قم بتوصيل الغطاء لإغلاق غرفة MEA للتخزين والاستخدام في المستقبل. ينتج عن هذا الإجراء أقسام القشرة و VTA لحوالي 12 زراعة مشتركة ويجب إجراؤها داخل غطاء تدفق الصفيحة في ظروف معقمة باستخدام صحية بعد يوم إلى يومين من الولادة ، يجب أن يكون الوقت الإجمالي لجمع الأنسجة أقل من ساعة واحدة. بعد قطع الرأس ، ابدأ بإزالة الدماغ عن طريق إجراء قطعتين جانبيتين مقصية لإزالة الجلد من فروة الرأس.
قم بإزالة الجمجمة ثم قطعها باستخدام مقص العين الناعم ، مما يجعل خط الوسط السهمي يقطع على قطع إكليلي واحد عند تقاطع المخيخ في القشرة. اقلب كل هذه اللوحات الأربعة للخلف لكشف الدماغ. بعد ذلك باستخدام ملعقة حادة ، اقطع أماميا من خلال البصلة الشمية.
ثم قم بتقديم الملعقة كل ثلاثة أشهر تحت الدماغ. ارفع الدماغ برفق إلى الجمجمة واتركه ينزلق في نظرة باردة. حل للتبريد السريع والتخزين المؤقت.
كرر الإجراء أعلاه لدماغين آخرين. للحصول على أنسجة VTA ، انقل الأدمغة إلى طبق بتري جاف معقم. باستخدام ملعقة صغيرة ، قم بإزالة أي سوائل زائدة عن طريق تحريك كل دماغ برفق جانبا حوالي سنتيمتر واحد.
ثم استخدم شفرة حلاقة لإزالة جذع الدماغ عن طريق إجراء قطع رأسي إكليلي على مستوى المخيخ. الآن قم بلصق كتلة أجار على قرص تثبيت لتحقيق الاستقرار الميكانيكي للأدمغة أثناء إجراء التقطيع. ثم ضع خطا رفيعا من الغراء الفائق ، على بعد بضعة ملليمترات أمام كتلة الأجار على القرص ، ولكن تجنب لمس الغراء للأجار باستخدام ملعقة صغيرة.
انقل وقم بتركيب كل عمود أمامي للدماغ لأسفل. تأكد من لصق الأعمدة الأمامية على قرص التثبيت وأن الجوانب البطنية تلامس الأجار دون أي بقايا غراء. هذا يضمن التثبيت الميكانيكي المناسب أثناء القطع وسهولة رفع الشرائح المقطوعة.
بعد ذلك ، قم بغمر قرص التثبيت بعناية وتثبيته باستخدام الأدمغة المثبتة في صينية اهتزاز مملوءة بمحلول النظرة المبردة. ثم باستخدام قطع شفرة الحلاقة التي تم تنظيفها بعناية ، والأقسام الإكليلية بسمك 400 ميكرومتر من الدماغ الأوسط بأعلى تردد اهتزاز وسرعة أمامية منخفضة نسبيا باستخدام ماصة معكرونة مقلوبة مع لمبة شفط ، قم بجمع ونقل الشرائح التي تحتوي على VTA إلى أطباق بتري مقاس 35 × 10 ملم مملوءة بمحلول نظرة معقمة مبرد للأقسام القشرية. كرر خطوات التقطيع السابقة ، ولكن قم بتطبيق قطع رأسي بين القشرة والمخيخ وقم بتركيب الأدمغة الأربعة مع رفع القطب الأمامي.
اجمع حوالي ثلاث شرائح إكليلية بسماكة 350 ميكرومتر بدءا من مستوى المخطط. الآن باستخدام سكين صغير مصنوع من شفرات حلاقة مكسورة ، قم بتشريح أقسام إكليلية بعرض ملليمترين تقريبا من القشرة الأمامية ومناطق الدماغ المتوسط التي تحتوي على VTA تحت مجهر مجسم. اجمع قسم الأنسجة بشكل منفصل في أطباق صغيرة مليئة بمحلول النظرة المبردة.
لبدء تركيب الأنسجة في الموضع الأول لغرفة الشرق الأوسط وإفريقيا ، MEA في درجة حرارة الغرفة تحت مجهر استريو مع تركيز مصفوفة الأقطاب الكهربائية. ثم قم بتوسيط قطرة 25 ميكرولتر من البلازما على مصفوفة صفيف الأقطاب الكهربائية النظيفة الخالية من الغبار والمعقمة. باستخدام ملعقة صغيرة ، حرك بعناية قسم القشرة و VTA في قطرة البلازما.
الآن ضع MEA على لوحة تبريد وأعد تركيز العرض. اترك هذا يبرد لمدة 15 ثانية قبل إضافة 25 ميكرولترا من الثرومبين إلى قطرة البلازما. ثم باستخدام طرف ماصة الثرومبين، انشر خليط الثرومبين في البلازما بعناية بحركات دائرية صغيرة عبر منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا.
احرص على عدم لمس مجموعة الأقطاب الكهربائية الهشة مباشرة. بعد ذلك ، ضع القشرة برفق على المصفوفة ذات الحدود الظهرية على طول صف القطب الثاني من المصفوفة. بهذه الطريقة ، ستغطي الطبقات السطحية النامية في النهاية ما تبقى من المصفوفة.
ثم ضع VTA بجوار الحدود البطنية لقسم القشرة. الآن قم بتغطية غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا وأغلقها بشكل غير محكم للاحتفاظ بالرطوبة العالية. اسمح لمجموعة ثقافة الشرق الأوسط وأفريقيا بالجلوس لمدة ست دقائق تقريبا داخل غطاء المحرك في درجة حرارة الغرفة للسماح بثرومبين البلازما والتخثر والابتهاج.
في غضون ذلك ، كرر الإجراء لإعداد ثلاث ثقافات أخرى. بعد ذلك ، في قطرات صغيرة ، أضف بعناية 600 ميكرولتر من وسط الثقافة إلى غرف الثقافة ، باستخدام حقنة واحدة سم مكعب بإبرة قياس 25 × خمسة ثمان. ثم أغلق غرفة MEA بإحكام وضع مجموعة ثقافة MEA على صينية التخزين الهزاز داخل الحاضنة.
بعد يومين ، في المختبر ، أضف 10 ميكرولتر من مثبط الانقسام. ثم قم بتحديث وسائط الثقافة بنسبة 60٪ في أربعة أيام في المختبر وكل أربعة أيام بعد ذلك. أثناء النمو الطبيعي ، سوف تتسطح الثقافة بشكل كبير وتتوسع ظهريا قليلا.
نظرا لتطور الطبقات القشرية السطحية ، يتم التعرف على الثقافة الصحية من خلال أنسجتها الرمادية غير الشفافة في الحقل الساطع. على العكس من ذلك ، فإن الحويصلات العاكسة الساطعة ، وهي سمة من سمات الخلايا التنكسية الميتة بعد حوالي 10 إلى 12 يوما من تحضير الثقافات ، فهي جاهزة للتسجيل والتحفيز. لبدء جلسة التسجيل، يتم نقل MEA من درج التخزين إلى مرحلة رأس التسجيل.
لتسجيل إمكانات المجال المحلي أو LFP ، استخدم مرشح تمرير النطاق من واحد إلى 200 هرتز. يمكن أيضا دراسة النشاط متعدد الوحدات باستخدام مرشح تمرير النطاق من 300 إلى 3000 هرتز. يميل النشاط التلقائي الصحي إلى الحدوث في رشقات نارية متنوعة الحجم والمدة.
لدراسة العلاقة بين LFP ونشاط الوحدة ، قد نحسب المتوسطات المرتفعة التي يتم تشغيلها ل LFP. بالنسبة لثقافات القشرة هذه ، ترتبط انحرافات LFP السلبية بالارتفاع العصبي لتسجيل نشاط التحفيز. أولا ، يتم تحديد شكل الموجة الزمنية وسعة المحفزات باستخدام برنامج يتحكم في مولد التحفيز.
نموذج التحفيز المفيد هو الصدمة المفردة المحايدة للشحنة التي يتم التحكم فيها الحالية مع شكل موجة مربع ثنائي القطب. بعد ذلك ، يتم تحديد قطب كهربائي ، والذي سيتم استخدامه لتوصيل المحفزات. تبدو استجابات LFP النموذجية التي تثيرها التحفيز مشابهة لرشقات النشاط التلقائي.
تعملدوائر الطمس على فصل مكبرات الصوت أثناء التحفيز لتقليل القطع الأثرية المحفزة ومنع تشبع مكبر الصوت. يتطلب قطب التحفيز عدة ثوان للتعافي من التحفيز وبالتالي لا يمكن استخدامه لتسجيل نشاط الاستجابة. في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا يميل إلى الظهور في مجموعات زمانية مكانية مع نشاط في قطب كهربائي واحد ، وغالبا ما يكون مصحوبا بنشاط في مواقع أخرى.
في الوقت نفسه ، يتم عرض الأشكال الموجية النموذجية ل LFP خلال فترات النشاط هذه هنا من خلال رسم ثلاث مجموعات تحدث بفارق عدة ثوان لكل مجموعة. يمكن رؤية انحرافات LFP السالبة في عدة أقطاب كهربائية في غضون نافذة مدتها ثانية واحدة عند استخراج قمم NLFP التي تعبر عتبة SD سالبة متعددة ، ويتم تصور النشاط في شكل أوقات الذروة NLFP بشكل ملائم في Rasta حيث تمثل أعمدة النقاط NPS قريبة من متزامنة في أقطاب كهربائية مختلفة. التنظيم الزماني المكاني لهذا النشاط معقد إلى حد ما.
تتكون الأعمدة التي تبدو متجانسة إلى حد ما عند دقة زمنية منخفضة من مجموعات منفصلة بدقة زمنية أعلى وما إلى ذلك. إن ظهور المجموعات الفضائية والجغرافية الزمنية وLFP منظم للغاية في الشبكات القشرية. وبشكل أكثر تحديدا ، فإن المنظمة هي مقياس متغير للانهيارات الجليدية العصبية.
يتضح ذلك من خلال حساب احتمالية أحجام المجموعات عند استبانة زمنية معينة. تتكون مجموعات Delta T.Here من NL FPS التي تحدث في نفس الصناديق الزمنية أو المتتالية عندما يتم التعبير عن حجم هذه المجموعة بالعدد الإجمالي ل NFPS لكل مجموعة أو اتساع NLFP المتكاملة لكل مجموعة ، تكشف توزيعات حجم المجموعة عن قانون طاقة بأسهم قريب من سالب 1.5. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح أنسجة المخ بعناية وزراعة الثقافات على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية من أجل دراسة التنظيم الذاتي للنشاط العصبي.
تم استخدام هذه الطرق أيضا لدراسة العلاقة بين النشاط التلقائي والنشاط المحفز في الشبكات القشرية.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التنظيم الذاتي للانهيارات العصبية في القشرة، مما يشير إلى ديناميكيات الحالة الحرجة. باستخدام ثقافة مشتركة من شرائح القشرة والدماغ المتوسط على مصفوفات متعددة الأقطاب، تلتقط الدراسة النشاط العصبي العفوي بمرور الوقت.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربية
- الديناميات العصبية
الخلفية
- الانهيارات العصبية هي انفجارات من النشاط لا تتغير مع المقاييس.
- تعكس ديناميكيات الحالة الحرجة في قشرة الدماغ.
- فهم هذه الديناميكيات يمكن أن يوفر رؤى حول تنظيم الدماغ.
- تُمكِّن مصفوفات متعددة الأقطاب من تسجيل مفصل للنشاط العصبي.
هدف الدراسة
- استكشاف التنظيم الذاتي لنشاط الدماغ إلى انهيارات عصبية.
- استخدام نظام ثقافة مشترك لدراسة التفاعلات بين مناطق الدماغ.
- لتقييم مزايا الثقافات متعددة المناطق على الثقافات المنفصلة.
الطرق المستخدمة
- ثقافة مشتركة من شرائح القشرة التاجية والدماغ المتوسط على مصفوفات متعددة الأقطاب.
- مراقبة طويلة الأمد للنشاط العصبي في بيئة خاضعة للرقابة.
- تحليل انفجارات المجال المحلي لتحديد خصائص الانهيارات.
- تحضير غرف ثقافة معقمة وشرائح نسيجية في ظروف تدفق الصفائح.
النتائج الرئيسية
- لوحظت الانهيارات العصبية العفوية في نظام الثقافة المشتركة.
- تم تحديد توزيعات قانون القوة في أحجام الانهيارات.
- سمحت التقنية بالتحكم الدقيق في الظروف التجريبية.
- أظهرت جدوى دراسة الاستجابات على مستوى الشبكة في المختبر.
الاستنتاجات
- توفر طريقة الثقافة المشتركة منصة قوية لدراسة الديناميات العصبية.
- تعزز فهم السلوك الحرجي في القشرة.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى جوانب مختلفة من علم الأعصاب الشبكي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding the self-organization of neuronal activity into scale-invariant avalanches provides a mechanistic window into cortical criticality, a state hypothesized to optimize information processing. This in vitro co-culture model enables reproducible observation of avalanche dynamics under controlled conditions, supporting target validation and assay development in neuroscience drug discovery. The approach de-risks mechanistic hypotheses by linking network-level electrophysiological phenotypes to underlying cellular and molecular pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying spontaneous network bursting patterns that reflect cortical excitation-inhibition balance.
- Operational Value: Enables functional validation of molecular targets through perturbation of avalanche size distribution and critical exponent.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that shift network dynamics away from criticality, indicating potential functional impact.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares disease-relevant neuronal networks for downstream compound screening by establishing baseline avalanche statistics.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative readouts (avalanche size, duration, power law exponent) suitable for high-content electrophysiological screening.
- Platform Value: Leverages multi-electrode array technology for scalable, reproducible monitoring of spatiotemporal activity across dozens of sites.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains laminar cortical organization and dopaminergic innervation, enhancing disease relevance for neuropsychiatric disorder models.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical workflows by providing a stable, long-term culture system for chronic compound exposure studies.
- Predictive Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating in vitro avalanche modulation with in vivo network biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically supporting electrophysiological phenotyping in neuronal networks.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether genetic or pharmacological perturbations alter the scale-free organization of cortical activity.
- Screening: Delivers assay-ready networks with reproducible LFP burst statistics, enabling reliable compound effect detection across concentrations.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables (avalanche size distribution, critical exponent, branching parameter) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through preserved cortical layering and midbrain-cortical projections relevant to dopamine-dependent pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable to multiple target classes and disease areas involving network dysfunction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by linking molecular interventions to emergent network criticality.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through sterile chamber preparation, controlled tissue plating, and automated LFP thresholding.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early biomarkers of network dysfunction, reducing late-stage attrition due to unanticipated cognitive or behavioral effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by quantifying how compounds affect fundamental cortical dynamics rather than isolated synaptic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue dissection, plasma-thrombin bonding, and multi-electrode array handling under laminar flow.
- Dependent on specialized instrumentation including multi-electrode arrays, environmental incubators with humidity cycling, and electrophysiology recording systems.
- Necessitates cross-team standardization of avalanche detection algorithms, threshold settings, and binning parameters for reproducible analysis.
- Involves adaptation considerations when extending to disease models or human iPSC-derived cortical cultures to maintain laminar development.
- Limited by the technical challenge of maintaining long-term culture stability and preventing electrode fouling over multi-week recording periods.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:09
Preparation of a Glass Chamber with Integrated Microelectrode Arrays (MEA)
5:00
Cortex and Ventral Tegmental Area (VTA) Tissue Dissection
8:46
Mounting Cortex and VTA Tissue Slices on the MEA
11:20
Electrophysiological Recording of Spontaneous and Stimulus-Evoked Neural Activity
13:38
MEA Recording Results
15:31
Conclusion
