Name: إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: تعلم إعداد وعزل البيروفوسفات إينوسيتول عالية الجودة باستخدام تفاعلات إنزيمية والهجرة الكهربائية على الهلام. يتيح هذا البروتوكول دراسة آليات الإشارة الخلوية والأدوار البيولوجية لـ IP7 في الأمراض البشرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر ألف ريشيو عن التعليقات المفيدة وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل عن طريق تمويل البحوث الطبية (MRC) المجلس إلى خلية علم الأحياء وحدة الإنسان من قبل برنامج منح العلوم الحدودي (RGP0048/2009-C).

1. رد الفعل الأنزيمية -- يوم 1 (1 ساعة بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة الأولى هي إعداد 10-20 التفاعلات الإنزيمية المستقلة التي IP 6 K1 أو تحويل الملكية الفكرية VIP1 6 إلى الأشكال الإسوية pyrophosphorylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم له 6 - IP K1 والانزيمات GST - Vip1 تنقيته من E. القولونية وفقا لبروتوكول 17،18 الموصوفة سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 ميكرولتر تحتوي على ردود فعل رد فعل 1X العازلة (Hepes 30 ملم 6.8 درجة الحموضة ، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 6 مم MgSO 4 ، 1 ملم DTT) ، 6 فسفوكرياتين ملم (PCR) ، و 25 يو / مل CreatinePhosphoKinase (CPK) ، 5 مم ATP (ملغ الملح) ، 0.3 ملي IP6 ، 0،05-0،1 ميكروغرام صاحب IP - 6 K1 أو ضريبة السلع والخدمات Vip1. ضبط مستوى الصوت مع 2 MiliQ O. DDH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لفترة وجيزة في رد الفعل واحتضان 37 درجة مئوية خلال الليل مع التناوب. </li></ol> 2. بولي أكريلاميد صب جل والتحميل -- يوم 2 (4 ساعات بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضير هلام بولي أكريلاميد باستخدام 24 سم ، 18 سم لوحات زجاجية واسعة والفواصل واسعة 1.5 مم. وعادة ما يتم استخدام ممر 16 أو مشط التحضيرية حارة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج (50 مل / جل) يحتوي على ما يلي : 35.5 ٪ (W / V) الأكريلاميد : مكرر الأكريلاميد 19:01 ، 1X بيرسلفات الأمونيوم تريس / البورات / EDTA (TBE) ، 0.05 ٪ (W / V) (وكالة الأنباء الجزائرية ) ، Temed 0.05 ٪ (W / V). صب مزيج بين لوحات ما قبل محمل الزجاج ، وادخال المشط والسماح للتبلمر 30-60 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في هلام وبلمرة ، ونقل الجهاز إلى غرفة باردة وقبل تشغيله في TBE 1X لحوالي 30-60 دقيقة على 200-300 فولت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1X صبغة OrangeG (10 ملي تريس - pH7.0 حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.1 ٪ OrangeG) إلى كل التفاعل. تحضير عينة تحتوي على 2 nmol الملكية الفكرية 6 الى تحميل كعنصر تحكم القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا جيدا مع كل تشغيل العازلة باستخدام المحاقن والإبر 21G لإزالة أي يعجل ، ثم تحميل الجل. تجنب التحميل على الآبار الجانبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام بين عشية وضحاها على 450-550 فولت (7 mAmp / هلام) ، حتى الفرقة صبغ OrangeG ضمن مشاركة 10 سم من الجزء السفلي من هلام. </li></ol> 3. بمعزل عن الملكية الفكرية 7 -- يوم 3 (4 ساعات) ، ويوم 4 (6-7 عملية التجفيف SpeedVac ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك جهاز هلام بعناية وإزالة إحدى الصفائح الزجاجية ترك الجل على الآخر. قطع جزء صغير من الجل من فوق الشريط صبغ OrangeG إلى القاع الذي يحتوي على 6 من IP القياسية ومسار واحد العينة ، كما هو مبين في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على قطع جزء من هلام مع الأزرق طولويدين (0.1 ٪ (W / V) طولويدين الزرقاء ، و 20 ٪ (W / V) والميثانول ، 2 ٪ (W / V) الجلسرين) لبضع دقائق (1-3 دقائق) أو حتى الفرقة بيروفوسفات اينوزيتول تظهر. وضع لوحة من الزجاج الخلفي إزالة سابقا على رأس لمنع هلام هلام غير ملوثين من التجفيف. </li></ol> ينبغي أن الفرقة الملكية الفكرية 7 تكون مرئية منذ تشغيله بشكل أبطأ قليلا من مستوى 6 IP. وينبغي للاعبي التنس المحترفين ، والذي يعمل بشكل أسرع من 6 الملكية الفكرية ، وأيضا أن تكون مرئية (الشكل 1). نقل الجزء الملون من هلام في التوصل إلى حل لإزالة البقع (20 ٪ (W / V) الميثانول) لبضع دقائق ، يغسل أي فائض في الزرقاء وإعادة طولويدين الجل مع الجل غير ملوثين. إذا كان مطلوبا التصور العالي الأشكال الإسوية اينوزيتول pyrophosphorylated (IP IP 8 و 9) ، وصمة عار الجل مع الحل طولويدين تلطيخ الأزرق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، يغسل الأزرق طولويدين مع الحل دي تلطيخ لحوالي 15 دقيقة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع خفض شفرة حلاقة الملكية الفكرية 7 الفرقة على الجزء غير ملوثين من هلام به كمرجع للملكية الفكرية موقف ترحيل 7 العزم مع الجل الملون (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الملكية الفكرية 7 الفرقة التي قطعت من الجل على أنبوب 15 مل و 10 مل من إضافة 2 MilliQ O. DDH وضع الأنابيب في التناوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رفض السائل لإزالة الفائض من جزيئات الأكريلاميد TBE والمجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، نفذ two - جفاف الماء دورات. إضافة 5 مل من 50 ٪ (W / V) الميثانول إلى أنبوب مع هلام يحتوي على 7 الملكية الفكرية وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. نقل شريحة هلام لأنبوب جديد 15 مل تحتوي على 5 مل من 2 MilliQ O DDH وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. لا يتخلص من الميثانول وMilliQ H O 2 من الأنابيب. تكرار الجفاف دورة الماء مرة أخرى ، من خلال إعادة نقل هلام بولي أكريلاميد في 15 مل من الأنابيب المستخدمة سابقا. لا يمكن أن يؤديها واحد من يغسل طوال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيز IP eluted 7 ، جفاف 10 مل معا (5 مل MilliQddH 2 O و 5 مل 50 ٪ الميثانول (ث / ت)) باستخدام SpeedVac ساخنة عند 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على عينات جافة تقريبا ، ونقل السائل المتبقي (300-600 ميكرولتر) لa1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وتدور لمدة 2 دقيقة في 5000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف جمع ونقل الى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي ؛ مغادرةأسفل 20-30 ميكرولتر أنها قد تحتوي على جزيئات الأكريلاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك ضروريا الاستمرار في عملية التجفيف باستخدام SpeedVac غير مدفأة. وخفضت بشكل كبير في انتعاش IP 7 إذا العينات يجف تماما ، ثم إنهاء عملية التجفيف عندما تصل عينات حجم 100-300 ميكرولتر. </li></ol> 4. تحديد تركيز 7 الملكية الفكرية والنقاء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2-5 ميكرولتر من العينة تعافى 7 IP لتشغيل على هلام PAGE ، على غرار الأقسام 2،2-2،5. تحميل العديد من التخفيفات IP 6 (أي 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 nmol) وفقا لمعايير وتركيز 4 nmol من بولي - P علامة. بعد تشغيل هلام ، تصور الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول بواسطة تلطيخ واجتثاث تلطيخ الجل كامل مع حل طولويدين الأزرق ، وبعد الإجراء الموضح في القسم 3.2 (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تلطيخ طولويدين ، يمكن تحديد التركيزات عن طريق مسح الجل ومقارنة الاختلافات في كثافة تتراوح بين 6 الملكية الفكرية والملكية الفكرية 7 ، وذلك باستخدام برامج التصوير مثل J - الصور ، كما هو مبين في الشكل 2B. </li></ol> 5. ممثل النتائج : ويمكن تحويل التحضيرية الأنزيمية للملكية الفكرية من 6 إلى 7 باستخدام IP IP 6 K1 وVIP1 الانزيمات حلها بسهولة باستخدام التحليل PAGE (الشكل 1). التحميل من 6 الملكية الفكرية باعتبارها التحكم في حجم جنبا إلى جنب مع تلوين طولويدين الجل الأزرق يتيح التعرف على المشتقات pyrophosphorylated ، حيث أنها تعمل بشكل أبطأ اعتمادا على عدد من المجموعات الفوسفات الموجودة على الحلبة اينوزيتول. الإجراء المذكورة أعلاه يسمح للتنقية سهلة من 7 IP. وكشف تحليل لبيروفوسفات اينوزيتول يطهر PAGE نقاء الملكية الفكرية لدينا 7 (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام ، و1/3PP-IP 5 ايزومير من الناتج 7 IP من VIP1 يهاجر أبطأ قليلا من أيزومر 5 5PP - IP من 7 IP التي تم إنشاؤها بواسطة K1 6 IP. 6 استخدام معايير الملكية الفكرية تسمح الكمي سهلة للتركيز IP المنقى 7 (الشكل 2B). 7 قبل استخدام الملكية الفكرية لمزيد من التجارب ، يمكن تقييم نشاطها البيولوجي (الشكل 3). 5PP - IP هو المحتضنة 5 مع VIP1 ومع الفوسفاتيز 7 IP DDP1 (diphosphoinositol phosphohydrolase متعددة الفوسفات). بشكل روتيني ، يتم تحويل الملكية الفكرية تنقيته من 7 إلى 8 من VIP1 الملكية الفكرية والملكية الفكرية التي DDP1 6 (الشكل 3). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 : من تلطيخ طولويدين PAGE والعزلة من الفرقة الملكية الفكرية 7 قطع جزء من الجل الذي يحتوي على معيار (IP 6) والملون باستخدام حل طولويدين الأزرق. الفرق الثلاثة تمثل (من أعلى إلى أسفل) 7 IP ، IP 6 و ATP. ثم كان متحالفا الجزء الملون من هلام مع ما تبقى من هلام. هذا يسمح للتوطين جزء من هلام يحتوي على 7 الملكية الفكرية ، والتي يمكن بعد ذلك قص وتنقيته (مربع متقطع). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2 : تحليل PAGE الملكية الفكرية منتجات التفاعل 6 K1 وVIP1. أ) تم استخدام تحليل IP 6 (4 ، 2 ، 1 ، 0.5 nmol) عن طريق تلوين طولويدين الأزرق من أجل تحديد IP 7 تركيز تنقيتها من كل 6 IP K1 (IP - 5PP 5) وVIP1 (1/3PP-IP 5) ردود الفعل. B) مبعثر تحليل مؤامرة لتحديد تركيز الملكية الفكرية المنقى 7. وتم تحديد التركيزات وفقا لكثافة الموجات ، محسوبة باستخدام البرمجيات imageJ ، مقارنة كميات محددة مسبقا من 6 IP. والمحور السيني يمثل شدة ، ويمثل المحور Y - تركيزات التي أعرب عنها في nmol. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3 : تحليل النشاط 7 IP البيولوجي لتحديد نوعية الملكية الفكرية المنقى 7 المحتضنة نحن 5PP 5 - IP (IP 6 K1 IP ولدت 7) مع VIP1 أو مع الفوسفاتيز 7 DDP1 IP وحلها ثم رد الفعل على الصفحة. كشفت وتلطيخ دابي طولويدين الإنتاج المتوقع من 8 VIP1 الملكية الفكرية وتحويل الملكية الفكرية من 7 إلى 6 من DDP1 IP.

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
<li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li>
<li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+structure%2C+enzymology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphosphoinositol+polyphosphates%3A+metabolic+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li>
<li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li>
<li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li>
<li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li>
<li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li>
<li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li>
<li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li>
<li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li>
<li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns%283%2C4%2C5%29P3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li>
<li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plc1p%2C+Arg82p%2C+and+Kcs1p%2C+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis%2C+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li>
<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+%28IP6K1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li>
<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

غير محدودة بشدة استخدام بيروفوسفات اينوزيتول في الكيمياء الحيوية بسبب عدم توفر هذه المركبات التجارية وحساسية الفقيرة من طرق الكشف الحالية. مزيج من صفحة ، والذي تمكن من فصل الجزيئات التي تمتلك عدد مختلف من مجموعات الفوسفات ، وزرقة الطولويدين (الشكل 1) ، وصبغ متبدل اللون الذي يربط لمجموعات الفوسفات ، وتمكن من السهل اكتشاف الأشكال الإسوية pyrophoshate اينوزيتول فتح مجالات جديدة للبحث 20. نفذت استخدام التكنولوجيا PAGE وصف لتنقية المنتجات بيروفوسفات اينوزيتول رد الفعل الأنزيمية outby إما 6 أو IP K1 VIP1 هو بسيط ، طريقة اقتصادية والموثوق بها التي تسمح لإنتاج كميات كبيرة من الملكية الفكرية ذات جودة عالية 7. لا يقتصر على الطريقة الموصوفة أعلاه لعملية تنقية بسيطة للملكية الفكرية 7 ولكن تعديلات طفيفة على البروتوكول صفها قد تسمح لتنقية مجموعة مختلفة من pyrophosphates اينوزيتول. ويمكن الكشف عن أعلى فسفرته الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول ، تحتوي على مجموعة الفوسفات أكثر من ثمانية باستخدام الملكية الفكرية (7) أو كميات مختلفة من 6 الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 20،6. ويمكن الكشف عن هذه pyrophosphates اينوزيتول من خلال زيادة طول تلطيخ الداخلي وتنقيته في وقت لاحق (القسم 3.2). علاوة على ذلك ، فإن استخدام الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 5 للتفاعل الأنزيمي السماح للتنقية PP - IP (5) وpyrophosphates اينوزيتول أخرى تحتوي على مجموعة الهيدروكسيل على الحلقة اينوزيتول. في الختام ، وهذه الطريقة بسهولتها يسمح لتنقية موثوق بها كميات مليغرام من pyrophosphates اينوزيتول مع الأدوات المتاحة على نطاق واسع ، مما يفتح آفاقا جديدة لهذا الحقل البحوث المثيرة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> حمض الفيتيك (IP 6) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> بولي - P (فوسفات الصوديوم) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP ملغ الملح + 2 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> سيغما الدريخ </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> فسفوكرياتين (PCR) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho كيناز (CPK) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST - Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> له ، IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> له ، Ddp1 </td><td> المتوفرة في المختبر </td><td> المتوفرة في المختبر </td></tr><tr><td> الأكريلاميد : مكرر الأكريلاميد 19:01 (40 ٪) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> بيرسلفات الأمونيوم (APS) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> تريس / البورات / EDTA (TBE) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> تي 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> طولويدين الأزرق </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> المسيح </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> جل الأجهزة </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> فراغ مشعب </td><td> المسيح </td><td> ألفا 2-4 </td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

إعداد pyrophosphates إينوسيتول الجودة

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

يتواجد الميو-إينوزيتول في الطبيعة إما في صورته غير المعدلة أو في مشتقات مفسفرة أكثر تعقيداً. ومن هذه الأخيرة، يعد إينوزيتول بنتakisفوسفات (IP5) وإينوزيتول هيكسakisفوسفات (حمض الفيتيك أو IP6) الأكثر وفرة في الخلايا حقيقية النواة. ويعتبر IP5 و IP6 من سلائف جزيئات إينوزيتول بيروفوسفات التي تحتوي على رابطة بيروفوسفات واحدة أو أكثر1. وتؤدي فسفرة IP6 إلى إنتاج ثنائي فوسفات إينوزيتول بنتakisفوسفات (IP7 أو PP-IP5) وثنائي ثنائي فوسفات إينوزيتول تتrakisفوسفات (IP8 أو (PP)2-IP4). وقد تم عزل إينوزيتول بيروفوسفات من جميع الكائنات حقيقية النواة التي تمت دراستها حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك، فإن فئتي الإنزيمات المتميزتين المسؤولتين عن تخليق إينوزيتول بيروفوسفات محفوظتان للغاية عبر التطور2-4.
تتمتع كينازات IP6 (IP6Ks) بمرونة تحفيزية هائلة، حيث تقوم بتحويل IP5 وIP6 إلى PP-IP4 وIP7 على التوالي، ومن ثم تعزز توليد جزيئات أكثر تعقيداً باستخدام هذه النواتج كركائز5,6. ومؤخراً، تم تحديد فئة ثانية من الإنزيمات المولدة للبيروفوسفات في صورة بروتين VIP1 في الخميرة (المشار إليه أيضاً باسم PP-IP5K)، والذي لديه القدرة على تحويل IP6 إلى IP7 وIP87,8.
تنظم بيروفوسفات الإينوزيتول العديد من العمليات الخلوية المتباينة مثل إفراز الإنسولين9، وطول التيلومير10,11، والانجذاب الكيميائي12، والنقل الحويصلي13، والتوازن الفوسفاتي14، وتحرر بروتين gag في فيروس HIV-115. وقد اقتُرح آليتان للتأثير لهذه الفئة من الجزيئات؛ حيث يمكنها التأثير على الوظيفة الخلوية من خلال التفاعل الخيفي مع بروتينات محددة مثل AKT16، أو بدلاً من ذلك، يمكن لمجموعة البيروفوسفات أن تمنح مجموعة فوسفات لبروتينات مفسفرة مسبقاً17. غير أن الإمكانات الهائلة لمجال البحث هذا تعوقها غياب مصدر تجاري لبيروفوسفات الإينوزيتول، مما يمنع العديد من العلماء من دراسة هذه الجزيئات وهذا التعديل الجديد لما بعد الترجمة. كما أن الطرق المتاحة حالياً لعزل بيروفوسفات الإينوزيتول تتطلب أجهزة كروماتوغرافية متطورة18,19، وتستخدم هذه الإجراءات ظروفاً حمضية قد تؤدي إلى تحلل بيروفوسفات الإينوزيتول20 وبالتالي ضعف الاسترداد. علاوة على ذلك، فإن إجراءات إزالة الأملاح المرهقة بعد الفصل الكروماتوغرافي تقصر استخدامها على المختبرات المتخصصة.
نصف في هذه الدراسة طريقة ميسرة لإنتاج وعزل وتنقية نواتج تفاعلات إنزيمات IP6-kinase و PP-IP5-kinases. وقد أمكن تطبيق هذه الطريقة بفضل قدرة الفصل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE) على فصل فوسفاتات الإينوزيتول عالية الفسفرة20. فبعد إجراء التفاعلات الإنزيمية لـ IP6K1 و PP-IP5K باستخدام IP6 كركيزة، استُخدم PAGE لفصل بيروفوسفاتات الإينوزيتول الناتجة، والتي جرى استخلاصها لاحقاً في الماء.

pyrophosphates اينوزيتول تلعب دورا هاما في أمراض السرطان مثل الإنسان ، والسكري والسمنة ، إلا أن الآلية الدقيقة لعمل هو موضع خلاف. عدم وجود pyrophosphates اينوزيتول المتاحة تجاريا يجعل دراسات تفصيلية للمشاكل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإنتاج وعزل ملليغرام من pyrophosphates اينوزيتول.

إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة

يتواجد الميو-إينوزيتول في الطبيعة إما في شكل غير معدل أو في صورة مشتقات مفسفرة أكثر تعقيداً. ومن بين هذه الأخيرة، فإن الأكثر وفرة في الخلايا حقيقية النواة...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج وتنقية بيروفوسفات عالي الجودة والنقاء. ويتم تحقيق ذلك أولاً باستخدام IP six كركيزة لإنزيم IP six kinase لإنتاج IP seven. بعد ذلك، يتم تحميل التفاعلات الإنزيمية على هلام من البولي أميد واستئصال النطاق المقابل لـ IP seven.يتم بعد ذلك عزل IP seven عن طريق دورات متتالية من التجفيف والترطيب. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تأكيد نقاء المنتج وتحديد تركيزه. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر النشاط البيولوجي لـ IP seven من خلال تحضين IP seven.باستخدام كيناز VIP one وفوسفاتاز DDP one لـ IP seven، تنتج هذه التفاعلات IP eight وIP six على التوالي. يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول إشارات IP seven. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى، مثل الفوسفات المتعدد مثل IP eight أو PPIP four المشتق من IP five.يبدأ هذا البروتوكول بتحضير التفاعلات الإنزيمية التي تقوم فيها إنزيمات IP six kinase one أو VIP one بتحويل IP six إلى الأشكال المتماثلة المرتبطة بالبيروفوسفات. ولغرض هذا العرض التوضيحي، تم تنقية إنزيمات IP six kinase one الملحقة بعلامة histamine وإنزيمات VIP one الملحقة بعلامة GST من بكتيريا e coli وفقاً لإجراء موصوف سابقاً. في البداية، قم بتحضير من 10 إلى 20 تفاعلاً إنزيمياً مستقلاً تحتوي على IP six و his IP six kinase one أو GST VIP one كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.اضبط الحجم إلى 50 µL باستخدام ماء milli Q المقطر مرتين. بعد تدوير الأنابيب لفترة وجيزة، حضن التفاعلات عند 37 °C طوال الليل مع التدوير. جهز جهاز جل بولي أكريلاميد باستخدام ألواح زجاجية بطول 24 cm وعرض 18 cm، وفواصل بعرض 1.5 mm، ومشط مكون من 16 مسارًا.بعد ذلك، صب محلول الهلام (gel) المُحضّر مسبقاً بين الألواح الزجاجية المصبوبة مسبقاً بحجم 50 milliliters لكل هلام. أدخل المشط واترك الهلام ليتبلمر لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد تبلمر الهلام، انقل الجهاز إلى الغرفة الباردة.قم بتشغيل الجل مسبقاً في محلول TBE بتركيز 1× لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة بجهد يتراوح بين 200 إلى 300 فولت، مع إضافة صبغة orange G بتركيز 1× في هذه الأثناء. ولكل تفاعل، قم بتحضير عينة ضبط قياسية تحتوي على 2 mol من IP six. بعد التشغيل المسبق، اغسل كل بئر جيداً باستخدام محلول التشغيل المنظم.استخدم حقنة متصلة بإبرة مقاس 21 لإزالة أي راسب. ثم قم بتحميل العينات في الهلام (gel)، مع تجنب تحميل أول مسارين وآخر مسارين من الهلام. وأخيراً، قم بتشغيل الهلام طوال الليل بتيار شدته 7 mA لكل هلام حتى تصل حزمة صبغة Orange G إلى آخر 10 cm من قاع الهلام.لبدء عزل IP seven، قم بتفكيك جهاز الفصل الكهربائي للهلام وأزل إحدى الصفائح الزجاجية بعناية مع ترك الهلام على الصفيحة الأخرى. قص جزءاً صغيراً من الهلام بدءاً من المنطقة التي تقع فوق نطاق GD البرتقالي مباشرة وحتى الأسفل، بحيث يشمل ذلك مسار المعيار IP six ومسار عينة واحدة. قم بصبغ الجزء المقطوع من الهلال بصبغة التولودين الأزرق لبضع دقائق حتى يظهر نطاق Anatol Pyrophosphate.وفي هذه الأثناء، أعد وضع اللوح الزجاجي الذي تمت إزالته سابقاً فوق الهلام لمنع جفاف الجزء غير المصبوغ منه. انقل الجزء المصبوغ من الهلام إلى محلول صبغ DES لبضع دقائق من أجل غسل أي فائض من صبغة التولويدين الزرقاء، ثم أعد وضع الهلام بجانب الجزء غير المصبوغ. يجب أن يكون نطاق IP seven مرئياً لأنه يتحرك ببطء أكبر قليلاً من معيار IP six، كما يجب أن يكون TP مرئياً أيضاً لأنه يتحرك بشكل أسرع من IP six.بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة لقص حزمة IP seven من الجزء غير المصبوغ من الهلام. استفد من موضع هجرة IP seven الذي تم تحديده باستخدام الهلام المصبوغ. ولتقدير موقع حزمة IP seven، ضع حزمة IP seven التي تم قصها من الهلام في أنبوب سعة 15 milliliter وأضف 10 milliliters من ماء milli Q المقطر مرتين.قم بتدوير الأنابيب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد التحضين، ثم تخلص من السائل عن طريق الصب لإزالة TBE الزائد وجسيمات الأكريلاميد المجهرية. بعد ذلك، قم بإجراء دورتين من إزالة الماء والترطيب عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من 50% methanol أولاً إلى الأنبوب الذي يحتوي على هلام IP seven. قم بتدوير العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.ثم انقل شريحة الهلام إلى أنبوب جديد سعة 15 milliliter يحتوي على خمسة milliliters من ماء milli Q المقطر مرتين، وقم بتدويره في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. احتفظ بالأنبوب الذي يحتوي على الميثانول لاستخدامه لاحقاً بعد فترة الحضن. كرر دورة التجفيف والترطيب مرة أخرى لتركيز IP seven المستخلص.امزج خمسة مليليترات من الماء التي تمت إضافتها سابقاً مع خمسة مليليترات من الميثانول بتركيز 50%. قم بتجفيف المحلول الناتج باستخدام جهاز التركيز بالتفريغ (speed vac) المسخن عند 60 °C. وبمجرد أن تصبح العينات جافة تقريباً، انقل السائل المتبقي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مليليتر.قم بتدوير الأنبوب لمدة دقيقتين بسرعة 5,000 دورة في الدقيقة. اجمع السائل الطافي (SUP natant) مع ترك 20 إلى 30 µL في القاع لأنها قد تحتوي على جزيئات أكريلاميد. انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 mL.إذا لزم الأمر، استمر في عملية التجفيف باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ من الهواء (speed vac) غير مسخن. يقل استرداد IP seven بشكل كبير إذا جفت العينات تماماً. لذا، من الضروري إنهاء عملية التجفيف عندما يصل حجم العينات إلى 100 إلى 300 microliters.بمجرد استعادة IP seven المعزول، يتم تحميل من 2 إلى 5 µL من العينة على هلام PAGE لتحديد تركيزها ونقائها. يتم تحميل عدة تخفيفات من IP six كمعايير للتركيز و 4 µL من علامة البروتين المتعددة (polyp marker). بعد تشغيل الهلال، يتم تصور الأشكال الإسوية الأولية للبيروفوسفات عن طريق صبغ وإزالة صبغ الهلام بالكامل باستخدام محلول التولودين الأزرق.بعد اتباع الإجراء الموصوف سابقاً عقب الصبغ بالتولويدين، يمكن تحديد التركيزات عن طريق مسح الهلام ومقارنة الاختلافات في الكثافة بين IP six وIP seven. وباستخدام برامج التصوير مثل Image J، يمكن تحليل التحويل الإنزيمي التحضيري لـ IP six إلى IP seven بسهولة باستخدام تحليل page، وذلك عند استخدام إنزيمات IP six kinase one وVIP one.يتيح تحميل IP six كعنصر تحكم في الحجم جنباً إلى جنب مع صبغ الهلام بصبغة تولودين الزرقاء (toluidine blue) إمكانية التعرف على مشتقات البيروفوسفات. ونظراً لأن حركتها تكون أبطأ بناءً على عدد مجموعات الفوسفات الموجودة في المادة الأولية، فقد أدى الإجراء الموصوف أعلاه إلى تنقية سهلة لـ IP seven. علاوة على ذلك، كشف تحليل بيروفوسفات الأناتول المنقى بواسطة PAGE عن نقاء IP seven.من المثير للاهتمام أن مصاوغ IP5 ذو الـ pyrophosphate في الموقع 1,3 لمنتج IP7 الناتج عن VIP1 يهاجر بشكل أبطأ قليلاً من مصاوغ IP5 ذو الـ pyrophosphate في الموقع 5 لـ VIP7 الذي يتم إنتاجه بواسطة IP6 kinase 1. يتيح استخدام معايير IP6 قياساً كمياً سهلاً لتركيز IP7 المنقى قبل استخدامه. وفي تجارب لاحقة، يمكن تقييم نشاطه البيولوجي.Five.يتم تحضين Pyrophosphate IP five مع FIP one ومع IP seven phosphatase DDP one بشكل روتيني. ويتم تحويل IP seven المُنقى إلى IP eight بواسطة VIP one وإلى IP six بواسطة DDP one. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل صبغ tolin in blue لفترة ممتدة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل عزل IP eight أو أشكال isoforms المفسفرة الأخرى.

preparation-of-quality-inositol-pyrophosphates

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

بروتوكول الموصوفة هنا يهدف إلى شرح وينتقص من العقبات العديدة في طريق المسار المعقدة مما يؤدي إلى triphosphates نوكليوزيد تعديل. بالتالي، هذا البروتوكول يسهل على حد سواء تركيب هذه بناء كتل تنشيط وتوافرها للتطبيقات العملية.

نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية

يوصف N-TS-iodoaziridines - بروتوكول لdiastereoselective إعداد وعاء واحد من رابطة الدول المستقلة. توليد diiodomethyllithium، بالإضافة إلى N-TS aldimines وسيكليزيشن من ويتجلى الأمينية ثنائي يوديد جوهرة المتوسط ​​إلى iodoaziridines. وشملت أيضا هو بروتوكول بسرعة وكميا لتقييم مرحلة ثابتة الأنسب لتنقية بواسطة اللوني.

التوليف وتنقية Iodoaziridines إشراك الكمي التحديد الأمثل للقرطاسية المرحلة اللوني لل

Phosphoinositides محت الدهون التي تتغير بسرعة استجابة للمؤثرات المختلفة وفرة نسبية. توضح هذه المقالة طريقة لقياس وفرة phosphoinositides التي وصفها أيضي الخلايا مع 3 H- ميو -inositol، تليها استخراج وdeacylation. ثم يتم فصل استخراج glycero-inositides بواسطة عالية الأداء اللوني السائل وكميا بواسطة التلألؤ التدفق.

Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

مهام دخلول المبكر تعتمد على بلمرة الأكتين و. هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة للكيمياء الحيوية والوراثية التلاعب.

في المختبر بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس

هنا نقدم طبقة ثنائية الدهون المدعومة في سياق منصة ميكروفلويديك لدراسة التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد باستخدام طريقة خالية من التسمية على أساس التشكيل الرقم الهيدروجيني.

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

يقدم بروتوكول لتوليف عالية النقاء ديالكيلفوسفينيك نونسيميتريك حمض اكستراكتانتس، أخذ (2، 3-ديميثيلبوتيل) (2.4، 4 '-) حمض فوسفينيك كمثال.

توليف لدرجة نقاء عالية نونسيميتريك ديالكيلفوسفينيك حمض اكستراكتانتس

يصف لنا طريقة بسيطة للقياس الكمي السريع من وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا المتنوعة، بما في ذلك الأنواع المتفطرات إيجابية وسلبية الغرام.

المعايرة وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا

ويرد بروتوكول لتوليف في37P20(O2C14H27)51 التكتلات وتحويلها إلى النقاط الكم الهندية indipاخفاؤ.

توليف في37P20(س2CR)51 التكتلات وتحويلها إلى النقاط الكمية inp

يركز هذا البروتوكول على تحديد البروتينات التي تربط فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. ويستخدم الكروماتوغرافيا تقارب مع فوسفات الإينوزيتول biotinylated أو فوسفوينوسيتيدات التي يتم تعطيلها عن طريق streptavidin إلى أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم تحديد فوسفات الإينوزيتول أو البروتينات الملزمة phosphoinositide عن طريق النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي.

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

هنا نحن وصف قوية anion تبادل عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة من [3H]-ميو-الإينوزيتول- التسمية الشتلات التي هي طريقة حساسة للغاية للكشف عن وقياس البولي فوسفات إينوزيتول في النباتات.

استخراج واستخلاص كمي للذوبان, المشع الإينوزيتول بولي فوسفات من أنواع النباتات المختلفة باستخدام SAX-HPLC

تم وصف إجراء لقياس الطيف الكتلي للتأين الكهربائي بالشعيرات الدموية من أجل الكمية المطلقة لإينوزيتول بيروفوسفات من مستخلصات خلايا الثدييات.

الكمية المطلقة للإينوزيتول بيروفوسفات بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري الكهربائي قياس الطيف الكتلي للتأين

تعلم إعداد وعزل البيروفوسفات إينوسيتول عالية الجودة باستخدام تفاعلات إنزيمية والهجرة الكهربائية على الهلام. يتيح هذا البروتوكول دراسة آليات الإشارة الخلوية والأدوار البيولوجية لـ IP7 في الأمراض البشرية.

إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة

استكشف المزيد من الفيديوهات