أدوات التحرير الأساسية بوساطة كريسبر: تقنية تحرير الجينوم للحث على استبدال القاعدة المستهدفة

لتحرير الجينوم بوساطة CRISPR ، ابدأ بثقافة HAP1-BE3 ، وهي خط خلية أحادي الصيغة الصبغية مع جين BE متكامل يشفر إنزيم محرر أساسي. إلى هذه الثقافة ، أضف نواقل الفيروسات العدسية التي تحتوي على بلازميد CRISPR-Cas9 المصمم لهدف محدد مثل جين سرطان الثدي البشري ، BRCA1.

يندمج جسيم الفيروس مع غشاء الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى إطلاق البلازميد ، والذي يندمج في النهاية في جينوم الخلية المضيفة لتشكيل مقاطع جينية CRISPR-Cas9-BE. تولد هذه الجينات gRNA الذي يستهدف BRCA1 ، وإندونوكلياز Cas9 ، وديأميناز BE-cytidin.

إن gRNA الذي يستهدف BRCA1 هو RNA يندمج مع Cas9 ويوجه المركب إلى موضع الجين BRCA1. بالقرب من هذا الجين ، يوجد موضع الشكل المجاور Protospacer ، أو PAM ، حيث يمكن أن يرسو BE بثبات ويتحرك في اتجاه المنبع للوصول إلى منطقته التحفيزية النشطة. هنا ، يتعرف BE على قاعدة السيتيدين ويحولها إلى يوريدين.

طفرة استبدال القاعدة هذه إلى تشغيل نوكلياز Cas9 لقطع خيط الحمض النووي غير المعدل. ينشط كسر خيوط الحمض النووي إنزيمات الإصلاح التي تملأ القاعدة المفقودة وتحول اليوراسيل ، وهي قاعدة غير الحمض النووي ، إلى الثايمين. بشكل عام ، تولد هذه العمليات متغيرا جينيا.

الآن ، احتضان الخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية والزراعة الفرعية لمضاعفة متغير الجين. استخراج الحمض النووي الجيني وتسلسله لتحليل كفاءة تحرير القاعدة بوساطة كريسبر.

قم بزرع 5 × 10⁵ خلايا HAP1-BE3 لكل بئر في ألواح 24 بئرا قبل يوم واحد من التعدي ، وزرعها لتصل إلى 70٪ إلى 80٪ من التقاء التعداد. الحمض النووي الريبي لتوجيه توجيه BRCA1 الشفاف باستخدام كواشف تعداء الشراء ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتوجيه BRCA1 للحث على تحويل CG إلى TA في المواقع المستهدفة BRCA1. بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية والزراعة الفرعية كل 3 إلى 4 أيام. احصد كريات الخلية بعد 3 و 10 و 24 يوما من التعداء لتحليل كفاءات تحرير القاعدة. استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجيني.