تلطيخ H& E لأقسام الأنسجة المضمنة في البارافين: تقنية تلطيخ تفاضلي لتصور أقسام أنسجة الكبد باستخدام مزيج من أصباغ الهيماتوكسيلين والإيوزين

ابدأ تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين عن طريق أخذ شريحة زجاجية تحتوي على قسم الأنسجة المضمنة في البارافين. اغمس الشريحة في محلول إزالة البارافين الذي يحتوي على الزيلين - وهو مذيب عضوي يذيب طبقة البارافين حول الأنسجة ، مما يجعلها في متناول البقع في الخطوات اللاحقة.

عالج قسم الأنسجة بالكحول المطلق لإزالة الزيلين. اغمر الأنسجة في تركيزات متناقصة من الكحول. تعمل هذه الخطوة على ترطيب الأنسجة عن طريق استبدال الكحول بالماء لتحسين التوافق مع الأصباغ القابلة للذوبان في الماء.

تلطخ الأنسجة بالهيماتوكسيلين الأساسي ، والذي يرتبط في شكله المؤكسد بكاتيون معدني. يرتبط هذا المركب إلكتروستاتيكيا بالأحماض النووية في الجينوم ، مما يؤدي إلى تلطيخ النواة الأرجواني.

اغمر القسم الملون في محلول تمايز حمضي لإزالة الهيماتوكسيلين الزائد من السيتوبلازم ، مما يجعل النواة التي تحتفظ بالصبغة تبدو مميزة. عالج الأنسجة بعامل أزرق قلوي لتحييد الأحماض الحرة. يؤدي هذا إلى تراجع لون الصبغة الأرجواني إلى اللون الأزرق ، مما يعزز التفاصيل النووية.

اغمر الشريحة في محلول اليوزين الحمضي لتلطيخ مكونات البروتين الأساسية في السيتوبلازم وألياف النسيج الضام بظلال من الأحمر إلى الوردي. عالج الأنسجة بالكحول للتخلص من اليوزين الزائد. استخدم تركيزات متزايدة من الإيثانول لتجفيف الأنسجة. اغمس الشريحة في الزيلين لمسح أي كواشف متبقية.

عند التصوير ، تظهر الخلايا الموجودة في قسم الأنسجة نوى زرقاء صافية ومناطق سيتوبلازمية وردية.

بإزالة الشرائح عن طريق غمرها في الزيلين بنسبة 100٪ ، مرتين ، لمدة 15 دقيقة في كل مرة. ثم أعد ترطيب الشرائح من خلال تدرج الإيثانول. لكل محلول ، اغمس من 8 إلى 10 مرات ، لمدة ثانيتين لكل غمس ، حتى يتدفق السائل بشكل نظيف من الشرائح. ضع الشرائح في هيماتوكسيلين هاريس المصفى بنسبة 100٪ لمدة أربع دقائق.

بعد أربع دقائق ، انقلها بسرعة إلى وعاء الماء منزوع الأيونات. قم بتشغيل الماء منزوع الأيونات في الزاوية الخلفية للحاوية بعيدا عن الأقسام. أفرغ الحاوية بشكل دوري حتى يختفي الماء من اللون الأرجواني.

تحقق بسرعة من شدة الهيماتوكسيلين على مجهر تشريح باستخدام مصابيح معقوفة. أعد الشرائح إلى الهيماتوكسيلين بنسبة 100٪ لمدة دقيقة واحدة ، إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التلوين.

بمجرد الحصول على تلطيخ الهيماتوكسيلين المطلوب ، اغمس الشرائح مرتين في حمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.05٪ ، ثم انقلها على الفور مرة أخرى إلى الحاوية بماء نظيف منزوع الأيونات. أفرغ الحاوية وأعد تعبئتها بالماء مرتين.

انقل الشرائح إلى حاويتين من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 30 ثانية لكل منهما. ضع الشرائح في محلول الإيوزين Y الفلوكسين B لمدة دقيقتين.

بعد دقيقتين ، انقل الشرائح مرة أخرى إلى حاوية الإيثانول السابقة بنسبة 95٪ ، ثم تحقق من شدة اللون تحت مجهر التشريح. إذا لم يكن التلوين كافيا ، فارجع إلى محلول اليوزين لمدة 30 ثانية. كرر حسب الضرورة.

عندما يتم الحصول على تلطيخ الكثافة المطلوبة ، انقل الشرائح إلى 100٪ الأيزوبروبانول لمدة 15 ثانية. استبدلها بالأيزوبروبانول الطازج بنسبة 100٪ ، ثم ضع الشرائح مرة أخرى في الأيزوبروبانول لمدة 15 ثانية أخرى. كرر هذه العملية ليصبح المجموع ستة غسلات من الأيزوبروبانول.

بعد الغمر في 100٪ زيلين لمدة ثلاث دقائق ، قم بإزالة شريحة واحدة ، وأضف وسيطا تثبيت كافيا لتغطية الأقسام ، ثم اغمس الشريحة في 100٪ زيلين.

ضع غطاء على الشريحة وامسح أي وسيط تثبيت زائد على منشفة ورقية حتى يظهر خط رفيع فقط. بعد ذلك ، اغمس منديلا في الزيلين وامسح الجزء الخلفي من الشريحة لإزالة أي وسيط متساقط.

ضع الشريحة بشكل مسطح على سطح قوي ولكنه متحرك ، مثل قطعة من الورق المقوى ، واترك الزيلين يتبخر في الغطاء لمدة 10 دقائق. اترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للسماح لوسط التثبيت بالتصلب قبل التصوير.