تنشيط في الجسم الحي للبلاعم البريتونية استجابة للأجسام المضادة في نموذج الفئران

البلاعم البريتونية الموجودة في التجويف البريتوني تبتلع مسببات الأمراض وتفرز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات لتعديل الاستجابة المناعية.

لدراسة تنشيط البلاعم البريتونية في الجسم الحي ، ابدأ بتقييد الفأر لتقليل حركته. خذ مزيجا من عديدات السكاريد الدهنية — المستضدات المشتقة من مسببات الأمراض والغلوبولين المناعي الوريدي وحقنها داخل الصفاق.

بعد الحقن ، ترتبط عديدات السكاريد الدهنية بمستقبلات التعرف على أنماط البلاعم ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك IL-12.

في المقابل ، تتفاعل الغلوبولين المناعي مع مستقبلات Fc الضامة ، مما يقلل من تنظيم الاستجابة المناعية عن طريق قمع إنتاج IL-12 وتعزيز إطلاق السيتوكينات المضادة للالتهابات ، بما في ذلك IL-10. هذا التحفيز المشترك بواسطة عديدات السكاريد الدهنية والغلوبولين المناعي ينشط الضامة البريتونية إلى البلاعم المضادة للالتهابات.

قم بتأمين الفأر القتل الرحيم وقم بعمل شق طولي على طول تجويف البطن. سحب الجلد من عضلة البطن. حقن عازلة في التجويف البريتوني. تحريك لإخراج الخلايا من التجويف البريتوني.

اجمع السائل البريتوني المحتوي على البلاعم المنشط.

استزراع هذه البلاعم المنشطة في وسط يحتوي على جزيئات تحفيز مشترك - الغلوبولين المناعي وعديدات السكاريد الدهنية لتمكين إنتاج السيتوكين. اجمع الوسط المستهلك وحدد مستويات السيتوكين باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم.

تركيز IL-10 الأعلى من IL-12 تنشيط البلاعم البريتوني المضاد للالتهابات الناجح.

قم بإعداد حقنة سعة 1 مليلتر مع الكمية المطلوبة من الغلوبولين المناعي الوريدي و LPS ، وقم بإرفاق إبرة قياس 26. بالنسبة لعناصر التحكم، استخدم PBS plus LPS بدلا من ذلك.

أمسك بالماوس من قفصته مع تأمين مؤخرته وذيله بيد واحدة. استهدف الربع السفلي الأيمن من البطن ، وأدخل الإبرة بزاوية 30 إلى 40 درجة مع وضع الشطبة لأعلى ، وأدخلها حوالي 1.5 سم. ثم حقن البلعة. بعد ساعة ، حصاد البلاعم البريتونية بعد القتل الرحيم للفأر.

في غطاء معقم ، قم بتثبيت الفأر القتل الرحيم على لوح رغوي مع انتشار الأطراف ، وقم بتعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم قم بعمل شق ضحل بطول 2 ملم على طول خط الوسط ، واسحب جلد البطن. تجنب ثقب الجدار البريتوني.

بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة سعة 5 ملليلتر بالكامل مع PBS معقم عند درجة الحموضة 7.4 ، وحقن الماوس باستخدام إبرة قياس 25 أو 27 في الجزء العلوي من التجويف البريتوني من كلا الجانبين باتجاه خط الوسط مع شطبة الإبرة لأعلى. بعد سحب الإبرة للخارج ، قم بتدليك الصفاق لمدة 10 ثوان لطرد الخلايا.

الآن ، أدخل الإبرة مرة أخرى في التجويف ، واجمع حوالي 3.75 مل من سائل الغسيل. انقل سائل الغسيل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر على الجليد. كرر الحقن والتدليك وجمع سائل الغسيل ثلاث مرات أخرى ، وقم بتجميع جميع المجموعات في نفس الأنبوب.

أثناء التجميع النهائي ، قد يكون من الأسهل سحب سائل الغسيل من الجانب البعيد من الماوس. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا ، وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من وسط الطلاء. بعد ذلك ، عد البلاعم القابلة للحياة ، وأعد تعليقها عند 1 مليون لكل ملليلتر. الآن ، ضع 100 ميكرولتر من التعليق في آبار صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة ساعة.

سوف تلتصق البلاعم البريتونية باللوحة. بعد ذلك ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة ، واشطف كل بئرة مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من IMDM الدافئ. بعد كل غسلة ، انتظر 10 ثوان ، وقم بإمالة اللوحة ببطء لتجميع محلول الشطف. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الطلاء وضع الطبق في الحاضنة.

بالنسبة ل ELISA ، استمر في احتضان الخلايا دون تحفيز لمدة 24 ساعة. ثم ، قم بجمع وتوضيح الوسط المكيف لتحليل السيتوكين.