بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم

تم تصميم هذه الطريقة لمساعدة العلماء على عزل الخلايا الأحادية المشتقة من الخلايا الأحادية من دم وأورام الفئران الحاملة للورم من أجل دراسة خصائصها المنبهة للمناعة. أعتقد أن الميزة الرئيسية لهذا الإجراء مقارنة بالطريقة الأخرى هي أن التيار المستمر المشتق من الخلايا الأحادية التي تم الحصول عليها يعكس بشكل أفضل حالة تنشيطها في الورم والدم. ربما يكون أصعب شيء هو التأكد من أن جميع الكواشف والأدوات الخاصة بك معقمة وأنك لن تدخل التلوث أثناء هذا الإجراء.

لقد كنت أعزل الخلايا النخاعية والخلايا المتغصنة عن الأورام لأكثر من 15 عاما حتى الآن ، وكانت لدي فكرة عن هذه الطريقة عندما لاحظت أن بروتوكولات العزل المختلفة أدت إلى أنماط مختلفة من تنشيط الخلايا. ستظهر الإجراء السيدة سانتانا ماجال ، وهي طالبة دراسات عليا في مختبري.

بعد القتل الرحيم للفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون داخل غطاء التدفق الرقائقي ، قم باستخراج الأورام ووضعها في وسط RPMI بدون مصل الأبقار الجنينية. ثم استخدم مقص الجراحة لتقطيع الورم إلى قطع صغيرة. انقل جميع قطع الورم من فأر واحد إلى أنبوب مسطح القاع سعة 30 مليلتر يحتوي على عازلة HBSS مكملة بالكولاجيناز IV و DNase I جنبا إلى جنب مع قضبان التحريك المغناطيسية.

احتضان الأنبوب مع قطع الورم على شاكر عند 37 درجة مئوية مع محرك مغناطيسي بالداخل بسرعة 200 إلى 400 دورة في الدقيقة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، أضف 1.5 مل من محلول المخزون المتوسط المتدرج الكثافة إلى 8.5 مل من HBSS. ثم امزج وسط تدرج الكثافة بقوة. بعد ذلك ، ماصة الخليط إلى الحبيبات.

الطرد المركزي معلق الخلية عند 400 مرة جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صب المادة الطافية بعد انتهاء الطرد المركزي. بعد غسل الخلايا المحببة مرتين ، أعد تعليقها في مليلتر واحد من عازلة العزل.

أضف تعليق الخلية إلى 30 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المترافق CD11b. بعد ذلك ، احتضن الخليط على أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من عازلة العزل.

ضع تعليق الخلية على عمود مغناطيسي مغسول مسبقا. بعد ذلك ، استخدم ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل لغسل العمود مرتين. ثم قم بإزالة العمود من المغناطيس.

بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل في العمود. ادفع بمكبس لطرد الخلايا ذات العلامات المغناطيسية في أنبوب تجميع معقم. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد إعادة تعليق الخلايا وتلطيخها ، قم بفرز الخلايا عن طريق بوابات الخلايا الصغيرة ، باستخدام جانب صغير ومبعثر أمامي صغير. بعد القتل الرحيم للماوس ، رش 70٪ من الإيثانول عليه. ثم استخدم مقصا جراحيا لإزالة الجلد الذي يغطي القلب تحت الغطاء الرقائقي.

بعد ذلك ، قم بتنظيف المقص بالإيثانول. اغسل التجويف باستخدام 20 ملليمولار EDTA HBSS ، واستخدم المقص لقطع الأذين الأيمن للقلب. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة 10 مليلتر بإبرة قياس 25 لشطف البطين الأيمن للقلب ببطء باستخدام 20 ملليمولار EDTA HBSS.

ثم استخدم حقنة معقمة لسحب الدم من التجويف الجنبي. نقل الدم في أنبوب يحتوي على كبريتات الهيباران و EDTA. بعد ذلك ، قم بماصة الدم على وسط تدرج الكثافة.

الطرد المركزي لخلايا الدم بمعدل 400 مرة جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع فرامل منخفضة. بعد الطرد المركزي ، اجمع الخلايا أحادية النواة في أنبوب. قم بإذابة الخلايا في 10 ملليلتر من عازلة العزل لغسل الخلايا.

مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لتحديد خلايا CD11b ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للعزل. احتضن لمدة 15 دقيقة مع 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المترافق CD11b عند أربع درجات مئوية.

جهاز طرد مركزي عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للعزل.

بعد ذلك ، قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود مغناطيسي مغسول مسبقا. اغسل العمود بمخزن مؤقت للعزل مرتين. قم بإزالة العمود من المغناطيس ، وأضف ستة ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل على العمود.

بعد ذلك ، قم بإخراج الخلايا المصنفة مغناطيسيا في أنبوب تجميع معقم عن طريق دفع المكبس. الطرد المركزي للخلايا عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في عازلة معزولة وصمة عار بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور.

قم بفرز الخلايا عن طريق بوابات الخلايا الصغيرة باستخدام جانب صغير ومبعثر أمامي صغير. أولا ، قم بإصلاح الخلايا في 1.8٪ بارافورمالدهيد مخزن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بزرع معلق الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئرا على شكل حرف U.

بعد ذلك ، أضف تخفيفات مختلفة من الأجسام المضادة المرتبطة بالورم في كل بئر. بعد ذلك ، احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، طرد المادة الطافية وغسل الخلايا مرتين. قم بإذابة الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور.

بعد ذلك ، احتضن الطبق على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد 15 إلى 20 دقيقة ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت لغسل الخلايا. الطرد المركزي للوحة عند 400 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق.

صب المادة الطاففة. إجراء قياس التدفق الخلوي لتحليل ارتباط الورم وتحديد الحد الأدنى من تركيز الغلوبولين المناعي G المطلوب لتغطية الخلايا. بمجرد أن يتم طلاء الخلايا بأقل تركيز من الغلوبولين المناعي G ، أضف المركب المناعي للورم المسمى CFSE إلى الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية بنسبة واحد إلى خمسة.

ثم احتضن الخليط لمدة 12 إلى 16 ساعة طوال الليل في وسط كامل. إجراء تحليل FACS لتنشيط الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلية الأحادية. يتم حساب متوسط شدة التألق بعد تحليل التدفق الخلوي لدراسة وجود الأجسام المضادة IgG و M التي تربط الخلايا السرطانية LMP خارج الجسم الحي.

تظهر النتائج أن الأجسام المضادة IgG من الفئران الخيفية C57-Black / 6 تربط الخلايا السرطانية بشكل أقوى بكثير من الأجسام المضادة من الفئران الزاوية 129S1. بعد ذلك ، يتم حساب متوسط شدة التألق لقدرة الارتباط للخلايا السرطانية B16F10 باستخدام IgG. يظهر IgG الذي تم الحصول عليه من الفئران الخيفية 129S1 كثافة تلطيخ أعلى بمقدار 10 أضعاف مع ورم B16F10 مقارنة ب IgG المتزابقي من C57-Black / 6 فئران.

بعد ذلك ، يتم التقاط صور مجهرية DIC لإظهار الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة المرتبطة بالورم من أورام B16F10. هنا ، يتم التقاط صور DIC لإظهار الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية الالتهابية والمعزولة من دم الفئران الحاملة للورم B16F10. يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي أيضا لمقارنة أنماط تنشيط الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة من الطحال ونخاع العظم مع أنماط الورم والدم عند الحضانة مع المركب المناعي.

تظهر النتيجة زيادة في تعبير CD86 و MHC II بواسطة نخاع العظام والخلايا المتغصنة الطحالية مع المجمعات المناعية. بعد ذلك ، يتم إجراء الكيمياء المناعية متحدة البؤر ، والتي تظهر امتصاص الورم وتعبير معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني عندما يتم تحضين الخلايا المتغصنة بمركب مناعي الورم المسمى CFSE. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذا الإجراء في غضون ساعات قليلة اعتمادا على عدد الفئران التي تستخدمها.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تحافظ على جميع الكواشف والأدوات معقمة في جميع الأوقات. فرو الفأر هو مصدر رئيسي للتلوث. تأكد من عدم ملامسة أي من الشعيرات أنسجتك.

نأمل أنه بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل DCs المشتقة من الخلايا الوحيدة من دم الفئران والأورام وكيفية تنشيطها لاحقا بالخلايا المناعية المعقدة مع تجنب تنشيطها المبكر.