القياس الكمي للإنترفيرونات النشطة بيولوجيا من النوع الأول باستخدام مقايسة مراسل الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز

لتحديد كمية الإنترفيرون النشط بيولوجيا من النوع الأول ، مثل الإنترفيرون ألفا والإنترفيرون بيتا ، في عينة اختبار ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا مراسل هندسية. تعبر هذه الخلايا عن الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز ، SEAP ، جين المراسل تحت سيطرة المحفز المحفز للإنترفيرون ألفا وبيتا.

أضف عينة الاختبار التي تحتوي على تركيز غير معروف للإنترفيرون من النوع الأول. الماصة مجموعة من تركيزات الإنترفيرون البشرية من النوع الأول إلى الآبار الأخرى ، والتي تعمل كعناصر تحكم قياسية. حضن.

يرتبط الإنترفيرون من النوع الأول في بئر الاختبار بمستقبل سطح خلية معين ، مما يؤدي إلى تنشيط كينازات Janus. هذه البروتين كينازات محولات إشارة الفوسفوريلات ومنشطات النسخ ، STAT ، البروتينات ، التي تضعف وتشكل مركبا بعامل تنظيمي محدد للإنترفيرون.

عند دخول النواة ، يرتبط المركب بتسلسل DNA محدد في المحفز المحفز للإنترفيرون ألفا وبيتا ، مما ينشط نسخ جين SEAP وينتج إنزيمات SEAP ، التي يتم إفرازها في الوسائط.

انقل الوسائط المحتوية على SEAP إلى آبار صفائح متعددة الآبار ذات الركيزة الخاصة ب SEAP. يقوم SEAP بتحلل الركيزة الوردية ، مما ينتج عنه منتج أرجواني أزرق اللون.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس امتصاص المنتج في الآبار الاختبارية والقياسية ، مما يدل على مستويات SEAP وتركيز الإنترفيرون من النوع الأول.

من منحنى الإنترفيرون القياسي من النوع الأول المرسوم ، حدد تركيز الإنترفيرون النشط بيولوجيا من النوع الأول في عينة الاختبار.

لقياس الإنترفيرون من النوع الأول النشط بيولوجيا باستخدام خلايا مراسل HEK-Blue إنترفيرون-ألفا / بيتا ، أولا ، قم بوضع خلايا المراسل بكثافة 50,000 خلية لكل بئر في صفيحة سفلية مسطحة من 96 بئرا إلى حجم نهائي يبلغ 180 ميكرولترا. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المادة الطافية للزراعة المشتركة التي تم حصادها للتو إلى كل بئر في نسختين. قم بتضمين مجموعة من أدوات التحكم القياسية الداخلية ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 إلى 22 ساعة.

لتحديد مستويات الفوسفاتيز القلوي المنبعثة من خلايا المراسل ، أضف 180 ميكرولترا من محلول QUANTI-Blue إلى كل بئر من صفيحة مسطحة القاع الجديدة. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المواد الطافية المستحثة من خلايا الإنترفيرون ألفا / بيتا المستحثة HEK-blue إلى كل بئر ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتطور اللون في آبار التحكم في الإنترفيرون القياسية.

يتغير محلول QUANTI-Blue من اللون الوردي إلى الأرجواني والأزرق في وجود الإنزيم. أخيرا ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لتقييم مستويات الفوسفاتيز القلوي المفرز عند 620 إلى 655 نانومتر وتحديد تركيز الإنترفيرون من النوع الأول عن طريق الاستقراء من الجزء الخطي من منحنى الإنترفيرون القياسي.