اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المراحل التي يتأثر فيها التعبير الجيني الفيروسي بالعلاج الكيميائي. للقيام بذلك ، يتم طلاء خلايا زراعة الأنسجة واحتضانها. حتى التقاء الخلايا ، تصاب الخلايا إما بفيروس لقاح مراسل ثلاثي أو فيروس قائمة مروج التحكم.

بعد ذلك ، يتم تطبيق مركبات العلاج ويتم تحضين الخلايا لمدة 18 ساعة للسماح بإكمال جميع مراحل التعبير الجيني الفيروسي. ثم يتم تحديد التألق الناتج باستخدام قارئ لوحة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح التغيرات النسبية في التعبير التي تسببها المركبات التجريبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الإصابة بفيروس يعبر عن بروتين اندماج فلوري واحد هي أن هذه المجموعة من الفيروسات توفر مزيدا من المعلومات حول مكان عمل دواء علاجي معين في دورة حياة الفيروس ، مما يوفر نظرة ثاقبة لآلية عمله. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد مثبطات العدوى الفيروسية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا للكشف عن مرحلة تكاثر الفيروس المكتملة في خطوط الخلايا غير المسموح بها أو في شاشات RNAi ، وتحديد العوامل الخلوية اللازمة للعدوى. يستخدم هذا البروتوكول الفيروس الثلاثي أو فيروس المراسل متعدد المراحل Trip V ، حيث يتم دمج ثلاثة أرباع فلورو متميزة طيفيا في الجينوم المزدوج الذي تقطعت به السبل لفيروس وريد واحد.

يتم التحكم في كل من هذه الأربعة الفلورية بواسطة مروج محدد جيدا للمرحلة المحددة. مروج C 11 R للتعبير المبكر عن كوكب الزهرة ، والمروج الوسيط G eight R للتعبير عن الكرز m ومحفز F 17 R للتعبير في المرحلة المتأخرة عن علامة BFP. وبالتالي ، يتم التعبير عن Venus m Cherry و علامة BFP بالتتابع أثناء الإصابة.

كعنصر تحكم ، يتم استخدام فيروس قائمة المروجات. يحتوي PLV على بنية وريدية مماثلة لتلك الموجودة في Trip V.ومع ذلك ، فإنه لا يحتوي على محفز نسخ وظيفي. ابدأ هذا البروتوكول بالانفصال.

خلايا هيلا التي تنمو على طبق 10 سم ، تخفف الخلايا في وسط النمو إلى حوالي 2.0 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. ثم قم بتوزيع 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة مسطحة شفافة ذات جدران سوداء 96 ، تحتضن الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتلاقى لتخفيف إذابة الفيروسات Tripp V و PLV في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم صوتنة لمدة خمس دقائق لتفكيكها. بعد ذلك ، قم بتخفيف مخزون الفيروس إلى 1.0 في 10 إلى سابع PFU لكل مليلتر في وسط العدوى الذي تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية لإصابة الخلايا.

استبدل وسائط النمو ب 50 ميكرولترا من الفيروس المخفف لكل بئر لكل علاج. قم بإصابة ثلاثة آبار مكررة ب Tripp V وثلاثة أخرى ب PLV لحساب مضان الخلفية الخاص بكل علاج. يعرف هذا بأنه الوقت يساوي صفر ساعة.

بعد الإصابة ، على سبيل المثال ، اصنع 350 ميكرولترا ل 6 96 بئرا مع 50 ميكرولترا لكل منها. يجب تخفيف كل مركب إلى ضعف التركيز النهائي ، حيث سيتم إضافته إلى حجم اللقاح الموجود بالفعل في البئر. بعد ذلك ، لكل حالة علاج ، قم بعمل مزيج رئيسي اثنين عن طريق تخفيف المركبات التجريبية أو مذيبات التحكم في السيارة مثل PBS أو DMSO إلى ما يكفي من وسط العدوى لجميع التكرارات.

بالإضافة إلى واحد ، لاحظ أن تركيز المذيب في كل من عناصر التحكم التجريبية والمتجهة فقط يجب أن يكون هو نفسه. على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم IBT بمعدل ميكرولتر واحد لكل مل في DMSO ، فيجب عليك أيضا استخدام DMSL وحده بمعدل ميكرولتر واحد لكل مل كعنصر تحكم في النواقل. مباشرة بعد إضافة الفيروس ، أضف 50 ميكرولترا من وسط العدوى الذي يحتوي على مركبات العلاج والمكافحة المطلوبة إلى كل بئر كما هو موضح في هذا الرسم التوضيحي.

لاحظ أنه يتم اختبار كل مركب باستخدام Tripp V و PLV في ثلاث نسخ ، ويتم تشغيل التحكم في السيارة بثلاث نسخ لكل فيروس. احتضن لمدة 18 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الألدهيد البارافورم بنسبة 8٪ إلى وسط العدوى الموجود بالفعل في كل بئر ، احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.

ستؤدي إضافة اثنين من الألدهيد الطلائق أو 8٪ مباشرة إلى وسط العدوى إلى منع رذاذ الفيروس ، والذي يمكن أن يحدث إذا تم قلب الفيروس غير المثبت مباشرة في طبق النفايات. بعد مرور 15 دقيقة ، قم بإزالة المثبت عن طريق قلب اللوحة في طبق النفايات. ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة وأغلق اللوحة بغشاء لاصق شفاف بصريا.

إذا لم تتم قراءة اللوحة على الفور ، فقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. تأكد من إعادة الألواح محكمة الغلق إلى درجة حرارة الغرفة قبل قراءتها لمنع التكثيف من تشويه قياسات مقياس الطيف الضوئي. لتحديد نمو الفيروس ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس مضان نقطة النهاية.

خذ أربعة قياسات لكل بئر باستخدام إعدادات الكسب المحسنة لكل قناة. يقوم قارئ الألواح TAN Infinite M 1000 Pro المستخدم في هذا الفيديو بتصدير قياسات التألق الخام إلى ملف Microsoft Excel. بعد الحصول على القراءات ، افتح البيانات الأولية في Microsoft Excel.

ثم انسخه والصقه في منشور GraphPad. تحدد ورقة النتائج في بريزم متوسط تكرار آبار Tripp v و PLV. ثم اطرح متوسط قيمة PLV من متوسط قيمة Tripp V لكل علاج.

لتسهيل المقارنة مع التجارب المكررة ، قم بتطبيع البيانات عن طريق قسمة البيانات المطروحة في الخلفية على السيارة فقط Tripp v Wells. بمجرد تكرار التجربة عدة مرات ، قم بإجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين أو اختبار NOVA أحادي الاتجاه واختبار لاحق للمقارنة المتعددة لتحديد ما إذا كان أي من العلاجات يختلف اختلافا كبيرا عن علاج DMSO. لكي تقوم كل قناة بإجراء فحوصات حركية تصيب الخلايا وتطبق مركبات الاختبار كما كان من قبل ، من المهم بشكل خاص استخدام وسيط مخزن للحفاظ على درجة الحموضة المناسبة دون إضافة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

بعد إغلاق اللوحة بغشاء لاصق ، ضعها في غرفة قارئ اللوحة بحيث تتوازن إلى 37 درجة مئوية. يجب توخي الحذر بشكل خاص للحفاظ على الألواح باستمرار عند 37 درجة مئوية. سيمنع ذلك إجهاد التكثيف والتكثيف غير المبرر.

اضبط كسب قارئ اللوحة يدويا لمنع تشبع النقاط الزمنية اللاحقة. احصل على قراءات كل ساعة لمدة ثماني إلى 24 ساعة بعد الإصابة وقم بتطبيعها. بالنسبة لمقايسة نقطة النهاية ، يمكن تحليل النقاط الزمنية الفردية من أجل الدلالة الإحصائية باستخدام طرق مماثلة لمقايسة نقطة النهاية الموصوفة سابقا.

لمقارنة نقاط التثبيط ، نمت خلايا الكعب المصابة بلقاح TPV أو PLV في وجود مثبطات فيروس الجدري ، Aris و CIBT و Rifampicin و ST 2 46. هذه المرة ، يظهر فيلم الفاصل تعبيرا متسلسلا عن أربعة الفلورو الأخضر والأحمر والأزرق أثناء نمو الفيروس في الخلايا الضابطة عند الإصابة في وجود تكرار الحمض النووي الذي يمنع الدواء AEE. يتم إنتاج الفلورو الأربعة الأخضر المبكر كما كان من قبل ، ولكن لا يحدث الإنتاج المتوسط والمتأخر للتألق الأحمر والأزرق.

أظهر التحليل الكمي عن طريق قياس الطيف زيادة بنسبة 210٪ في التعبير الجيني المبكر ، ولكن عدم وجود تعبير وسيط ومتأخر في الخلايا المعالجة بخلايا C المصابة في وجود IBT ، والذي يعتقد أنه يعزز ذلك. كان للنسخ القابل للقراءة مستويات تعبير متوسطة ومتأخرة كانت 24.7٪ و 2.9٪ من مستويات التحكم ، ولم تكن الخلايا المصابة في وجود ST 2 46 و rifampicin ، والتي تمنع بعد التعبير الجيني المتأخر أثناء تجميع الفيروسات والنضج ، مختلفة بشكل كبير عن الضوابط. تتوافق هذه النتائج مع آلية عمل هذه المركبات المفهومة وتشير إلى أنه يمكن استخدام فيروس مراسل Trip V لتحديد المرحلة المحددة من تثبيط الفيروس للمركبات غير المعروفة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تضمين عناصر التحكم المناسبة. ليس هذا يسمح فقط للتطبيع الصحيح للنتائج, ولكن أيضا لتحديد آلية محتملة لمركب التجريبية الخاص بك. لا تنس أن العمل مع فيروس اللقاح يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة واتبع BSL الموصى به.

تقنيتان للاحتواء.