اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المراحل التي يتأثر فيها التعبير الجيني الفيروسي بالمعالجة الكيميائية. وللقيام بذلك، يتم زرع خلايا الزرع النسيجي وتحضينها حتى تصل إلى مرحلة الاندماج الكامل. بعد ذلك، يتم إصابة الخلايا إما بفيروس فاكسينيا ثلاثي المراسل أو بفيروس ضابط يفتقر إلى المحفز.

بعد ذلك، تُضاف مركبات العلاج وتُحضن الخلايا لمدة 18 ساعة للسماح باكتمال جميع مراحل التعبير الجيني الفيروسي. ثم يتم تحديد الفلورة الناتجة باستخدام قارئ الأطباق. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح التغيرات النسبية في التعبير التي سببتها المركبات التجريبية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالعدوى بفيروس يعبر عن بروتين اندماجي فلوري واحد في أن هذه المجموعة من الفيروسات توفر معلومات أكثر حول المرحلة التي يعمل فيها عقار علاجي معين خلال دورة حياة الفيروس، مما يعطي رؤية أعمق لآلية عمله. ورغم إمكانية استخدام هذه الطريقة لتحديد مثبطات العدوى الفيروسية، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً للكشف عن مرحلة التكاثر الفيروسي المكتملة في الخطوط الخلوية غير المسموح بها أو في فحوصات RNAi، مما يساهم في تحديد العوامل الخلوية الضرورية للعدوى. يستخدم هذا البروتوكول فيروس المراسل متعدد المراحل الثلاثي أو TrpV، حيث يتم دمج ثلاثة فلوروفورات متميزة طيفياً في الجينوم مزدوج الشريط لفيروس vaccinia واحد.

يتم التحكم في كل من هذه الفلوروفورات بواسطة محفز محدد بدقة لكل مرحلة. حيث يعمل المحفز C 11 R على التعبير المبكر عن Venus، والمحفز الوسيط G eight R للتعبير عن m-cherry، والمحفز F 17 R للتعبير في المرحلة المتأخرة عن tag BFP. وبذلك، يتم التعبير عن Venus وm-Cherry وtag BFP بشكل تتابعي أثناء العدوى.

كعينة ضابطة، يُستخدم فيروس يفتقر إلى المحفز. يحتوي PLV على بنية Venus مماثلة لتلك الموجودة في TrpV، ومع ذلك، فإنه لا يمتلك محفز نسخ وظيفي.

ابدأ هذا البروتوكول بفصل خلايا Hela المنماة في طبق قطر 10 سنتيمتر، خفف الخلايا في وسط النمو لتصل كثافتها إلى 2.0 × 10⁵ خلية/مل تقريبًا. بعد ذلك، وزع 100 µL في كل بئر من بئر لوحة 96 بئر ذات جدران سوداء وقاع مسطح شفاف. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة عند 37 °C مع 5% carbon dioxide حتى تصل إلى مرحلة الاندماج. لتخفيف الفيروسات، قم بإذابة TrpV و PLV في حمام مائي عند 37 °C، ثم استخدم الموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق للتفكيك. بعد ذلك، خفف المخزون الفيروسي إلى 1.0 × 10⁷ PFU/مل في وسط عدوى تم تسخينه مسبقًا إلى 37 °C.

لإصابة الخلايا، استبدل وسط النمو بـ 50 µL من الفيروس المخفف في كل بئر. لكل معاملة، يتم إصابة ثلاثة آبار مكررة بـ TrpV وثلاثة آبار أخرى بـ PLV لحساب الفلورية الخلفية الخاصة بكل معاملة. يتم تعريف هذه اللحظة بأنها الوقت يساوي صفر ساعة بعد الإصابة. على سبيل المثال، قم بتحضير 350 µL لـ 6 آبار من أطباق 96 بئرًا بواقع 50 µL لكل منها. يجب تخفيف كل مركب إلى ضعف التركيز النهائي، حيث سيتم إضافته إلى حجم اللقاح الموجود بالفعل في البئر. بعد ذلك، ولكل حالة معاملة، قم بتحضير مزيج رئيسي بتركيز 2x عن طريق تخفيف المركبات التجريبية أو مذيبات التحكم الناقلة مثل PBS أو DMSO في كمية كافية من وسط الإصابة لجميع المكررات، زائد واحد. لاحظ أن تركيز المذيب في كل من الضوابط التجريبية وضوابط الناقل فقط يجب أن يكون متماثلاً. على سبيل المثال، إذا كنت تستخدم IBT بتركيز 1 µL/mL في DMSO، فيجب عليك أيضاً استخدام DMSO وحده بتركيز 1 µL/mL كضابط ناقل. فور إضافة الفيروس، أضف 50 µL من وسط الإصابة الذي يحتوي على مركبات المعاملة والضوابط المطلوبة إلى كل بئر كما هو موضح في هذا التوضيح.

لاحظ أنه يتم اختبار كل مركب مع TrpV وPLV في ثلاث مكررات، كما يتم إجراء تحكم بالناقل في ثلاث مكررات لكل فيروس.

تُحضن الخلايا لمدة 18 ساعة في حضانة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، يتم تثبيت الخلايا بإضافة 100 µL من 8% paraformaldehyde إلى وسط العدوى الموجود مسبقاً في كل بئر. تُحضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع حمايتها من الضوء.

سيؤدي إضافة 2x أو 8% paraformaldehyde مباشرةً إلى وسط العدوى إلى منع تطاير الفيروس في الهواء، وهو ما قد يحدث في حال سكب الفيروس غير المُثبّت مباشرةً في وعاء النفايات. بعد مرور 15 دقيقة، قم بإزالة المادة المثبّتة عن طريق قلب الطبق في وعاء النفايات. ثم أضف 100 µL من PBS بدرجة حرارة الغرفة وأغلق الطبق بغشاء لاصق شفاف بصرياً.

إذا لم يتم قراءة اللوحة فوراً، تُحفظ في درجة حرارة 4 °C. تأكد من إعادة اللوحات المختومة إلى درجة حرارة الغرفة قبل قراءتها لمنع التكثف من تشويه قياسات spectrophotometer.

لقياس نمو الفيروس كمياً، استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس الفلورة النهائية. قم بأخذ أربع قياسات لكل بئر باستخدام إعدادات كسب محسنة لكل قناة. يقوم قارئ الأطباق TECAN Infinite M 1000 Pro المستخدم في هذا الفيديو بتصدير قياسات الفلورة الخام إلى ملف Microsoft Excel. بعد الحصول على القراءات، افتح البيانات الخام في برنامج Microsoft Excel.

ثم قم بنسخها ولصقها في ورقة نتائج برنامج GraphPad prism. حدد في برنامج Prism المتوسط الحسابي لآبار TrpV وPLV المكررة. بعد ذلك، اطرح متوسط قيمة PLV من متوسط قيمة TrpV لكل معاملة. ولتسهيل المقارنة مع التجارب المكررة، قم بتطبيع البيانات عن طريق قسمة البيانات التي تم طرح الخلفية منها على آبار TrpV التي تحتوي على الناقل فقط. بمجرد تكرار التجربة عدة مرات، قم بإجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه أو اختبار one-way ANOVA واختبار مقارنات متعددة لاحق لتحديد ما إذا كانت أي من المعاملات تختلف اختلافاً جوهرياً عن معاملة DMSO لكل قناة. لإجراء المقايسات الحركية، قم بإصابة الخلايا وتطبيق المركبات المختبرة كما سبق، ومن المهم بشكل خاص استخدام وسط منظم للحفاظ على pH مناسب دون إضافة 5% من ثاني أكسيد الكربون.

بعد إغلاق اللوحة بغشاء لاصق، ضعها في حجرة قارئ الألواح الموازنة عند 37 degrees Celsius. يجب توخي عناية خاصة للحفاظ على الألواح باستمرار عند 37 degrees Celsius؛ وذلك لمنع إجهاد الخلايا غير المبرر ومنع التكثف.

اضبط كسب قارئ الأطباق يدويًا لمنع حدوث التشبع في النقاط الزمنية اللاحقة. قم بأخذ قراءات كل ساعة لمدة تتراوح من 8 إلى 24 ساعة بعد العدوى، ثم قم بإجراء عملية التسوية (normalize) كما هو متبع في مقايسة النقطة النهائية. ويمكن تحليل النقاط الزمنية الفردية للتأكد من الدلالة الإحصائية باستخدام طرق مشابهة لتلك المستخدمة في مقايسة النقطة النهائية الموصوفة سابقًا.

لمقارنة نقاط التثبيط، تم استزراع خلايا HeLa المصابة بفيروسات vaccinia من نوع TrpV أو PLV في وجود مثبطات فيروسات الجدري: AraC وIBT وRifampicin وST 246. يظهر هذا الفيلم المسرع التعبير المتسلسل للفلوروفورات الخضراء والحمراء والزرقاء أثناء نمو الفيروس في الخلايا الضابطة. أما عند الإصابة في وجود عقار AraC الذي يمنع تضاعف DNA، فإن الفلوروفور الأخضر المبكر يتم إنتاجه كما سبق، ولكن لا يحدث الإنتاج المتوسط والمتأخر للفلورة الحمراء والزرقاء.

أظهر التحليل الكمي باستخدام القياس الطيفي زيادة بنسبة 210% في التعبير الجيني المبكر، ولكن مع غياب التعبير المتوسط والمتأخر في الخلايا المعالجة بـ araC. أما الخلايا التي تم إصابتها بوجود IBT، والذي يُعتقد أنه يعزز عملية نسخ القراءة المتصلة (read through transcription)، فقد أظهرت مستويات تعبير متوسطة ومتأخرة بلغت 24.7% و 2.9% من مستويات المجموعة الضابطة. ولم تختلف الخلايا المصابة بوجود ST246 والريفامبيسين، اللذين يثبطان التعبير الجيني بعد المرحلة المتأخرة أثناء تجميع الفيريونات ونضجها، بشكل ملحوظ عن المجموعات الضابطة. وتتوافق هذه النتائج مع آلية العمل المفهومة لهذه المركبات، وتشير إلى إمكانية استخدام الفيروس المراسل TrpV لتحديد المرحلة المحددة للتثبيط الفيروسي للمركبات غير المعروفة.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إدراج الضوابط المناسبة؛ حيث لا يسمح ذلك بالتطبيع الصحيح للنتائج فحسب، بل يساعد أيضاً في تحديد الآلية المحتملة للمركب التجريبي الخاص بك. ولا تنسَ أن العمل مع فيروس vaccinia يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة واتباع تقنيات الاحتواء الموصى بها لمستوى السلامة البيولوجية الثاني BSL-two.