عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد وتشغيل 384 لوحة فحص بئر لتحليل الإنتاجية العالية لمجموعة متماثلة للغاية من الجينات ، مثل النوع الأول والنوع الثالث من الإنترفيرون. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد التخفيف التسلسلي القياسي المستخدم لتشغيل لوحات الفحص. بعد ذلك ، يتم تحضير المسبار التمهيدي وخلطات مخزون العمل التي لا توجد في القالب للتحكم في القالب المستخدمة في صنع الألواح.

ثم يتم تحضير ألواح فحص البئر 384 باستخدام ماصة آلية متعددة القنوات ويتم تجفيفها للتخزين. أخيرا ، يتم تشغيل وتحليل لوحات فحص البئر 384. في نهاية المطاف ، يتم استخدام اختبار RT PCR R الكمي عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي لتحديد توقيعات تعبير الإنترفيرون في نماذج زراعة الأنسجة ، أو دراسة مسببات الأمراض أو في العينات السريرية في سياق الأمراض المعدية أو الالتهابات الذاتية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل R two PCR الكمي ، باستخدام المجسات الخطية القياسية أو cyberg green ، هي أنه يمكن استخدام المنارة الجزيئية ومجسات الفلورسنت الحمضية النووية للتمييز بين اختلافات زوج القاعدة المفردة بين التسلسلات المتشابهة للغاية بعد الذوبان والدوامة والطرد المركزي لفترة وجيزة لحيوانات منوية قياسية وسمك السلمون أو S-S-D-N-A. قم بإعداد مزيج الماء SSD NA لمجموعة التخفيف القياسية ال 17 عن طريق خلط 51 ميكرولتر من S-S-D-N-A مع 20.3 مل من الماء. قم بتوزيع 190 ميكرولترا من مزيج ماء SS DNA على الأنبوب الأول من شريط PCR بثمانية أنابيب و 180 ميكرولترا إلى الأنابيب الخمسة التالية.

قم بإجراء تخفيف من واحد إلى 20 عن طريق نقل 10 ميكرولتر من مخزون Picomolar القياسي 50 إلى الأنبوب مع 190 ميكرولتر من دوامة مزيج المياه S-S-D-N-A وأجهزة الطرد المركزي بسرعة. يقوم شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل بإجراء تخفيف من واحد إلى 10 عن طريق نقل 20 ميكرولترا من الأنبوب المخفف مؤخرا إلى الأنبوب التالي في دوامة السلسلة ويقوم بالطرد المركزي لشريط تفاعل البوليميراز المتسلسل بسرعة. كرر التخفيف من واحد إلى 10 حتى يتلقى الأنبوب الأخير في السلسلة المعيار.

بعد وضع ملصقات على ما يصل إلى 17 أنبوبا ملليلتر، استخدم ماصة إلكترونية متعددة القنوات سعة 12.5 ميكرولتر لإضافة ميكرولترين من S-S-D-N-A إلى كل أنبوب باستخدام بادئات ومجسات معدة وفقا لبروتوكول النص. أضف التمهيدي الأمامي المناسب والتمهيدي العكسي والمسبار إلى كل برايمر. قم بتعيين أنبوب مخزون العمل لإعداد عدم وجود عنصر تحكم في القالب أو خلطات مخزون العمل NTC.

انقل 14.3 ميكرولتر من كل مسبار أولي إلى أنبوب مزيج مخزون العمل NTC المناسب وفقا لهذا الجدول. بعد إزالة Eloqua من مجموعات المسبار التمهيدي المطلوبة لمخزون العمل NTC ، يمزج 1.5 مل من الماء لرفع الحجم النهائي لكل مسبار أولي ، قم بتجميع أنبوب مخزون العمل إلى 1.7 ملليلتر. لإعداد 96 لوحة مصدر بئر من مجموعات المسبار التمهيدي وخلطات NTC.

ضع لوح 96 بئر جديد في كتلة تبريد 96 بئر مبردة وقم بتعيين الآبار بمجموعة المسبار التمهيدي الصحيحة أو مزيج NTC باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات سعة 250 ميكرولتر. أضف 66 ميكرولترا من الماء إلى كل مجموعة مسبار أولي. بئر توزيع 82.5 ميكرولتر من الماء على الأربعة المستهدفة 17 بئرا.

قم بتوزيع 27.5 ميكرولتر من الماء في كل مزيج مضاد للسي. حسنا ، بعد ذلك ، أضف 54 ميكرولترا من مجسات التمهيدي الصحيحة في مخزون العمل إلى مجسات التمهيدي المخصصة عند توزيع الآبار. 67.5 ميكرولتر من مجموعة عمل المسبار التمهيدي المستهدف 17 إلى الهدف المحدد 17 مجسات أولية في الآبار.

أضف 22.5 ميكرولتر من مزيج مخزون NTC الصحيح إلى الآبار المخصصة. ثم استخدم ختم لوحة لاصقة لإغلاق لوحة البئر 96 وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 700 جي ثانية للتأكد من أن المحتويات في قاع الآبار باستخدام محول 96 جيدا. ضع الطبق في الخلاط الدوامي واخلطه على حرارة 1000 روبية لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم بالطرد المركزي للوحة عند 700 Gs لمدة خمس دقائق. لإعداد لوحات فحص البئر 384 ، قم بتشغيل الماصة الآلية متعددة القنوات وانقر نقرا مزدوجا على أيقونة البرنامج لفتح البروتوكول لصنع لوحات فحص الإنترفيرون لإعداد النظام الأساسي. ضع صندوق طرف ماصة ممتلئ بالكامل في موضع المنصة الأول، ولوحة مصدر البئر 96 في الموضع الرابع ولوحة بئر جديدة 384 في الموضع السادس.

ابدأ الجري بالضغط على زر التشغيل عند اكتمال التشغيل. اضغط برفق على لوحة فحص البئر 384 على سطح مستو للتأكد من وجود السوائل في قاع الآبار وقم بتطبيق ختم لوحة لاصقة بعد تدوير اللوحة عند 700 جي لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة.

ضع لوحة فحص البئر 384 في مجفف الألواح وضع مشعب البئر 384 فوق الآبار مباشرة. بمجرد أن تجف محتويات لوحات فحص البئر 384. ضع ختما جديدا للوحة لاصقة ، وملصق رقائق معدنية سريع وقم بتخزينه في الظلام عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامه لتحميل وتشغيل لوحة الفحص.

قم بإعداد اثنين من جينات التدبير المنزلي أو خلطات بئر HKG عن طريق تخفيف ميكرولترين من S-S-D-N-A في 84.9 ميكرولتر من الماء. ثم أضف ميكرولترين من SSD المخفف NA 11.8 ميكرولتر من الماء ، و 23 ميكرولتر من المزيج الرئيسي و 9.2 ميكرولتر من مسبار التمهيدي الصحيح 20 XHKG الذي تم تعيينه لكل أنبوب HKG المسمى ، والدوامة ، وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة بعد تحضير العينات والتحكم الإيجابي CDNA عند 78.8 ميكرولتر من المزيج الرئيسي و 54.8 ميكرولتر من الماء لكل عينة 24 ميكرولتر وأنبوب تحكم إيجابي. لتحضير المعايير وخلطات الآبار NTC لإضافتها إلى لوحة فحص البئر المجففة 384 ، أضف 165 ميكرولتر من الماء إلى 275 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنبوب 1.5 مليلتر لخلط بئر NTC عند 52.5 ميكرولتر من الماء إلى 52.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنبوب 1.5 ملليلتر.

قم بإزالة لوحة فحص البئر المجففة 384 المعدة مسبقا من أربع درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 700 GS لمدة دقيقة واحدة. مع الماصة الإلكترونية متعددة القنوات سعة 30 ميكرولتر ، توزع 7.5 ميكرولتر من NTC. امزج جيدا مع كل NTC.

قم بتوزيع ستة ميكرولترات من المعايير ، وخلطها جيدا ، و 1.5 ميكرولتر من المعيار لكل معيار. حسنا ، قم بتوزيع 7.5 ميكرولتر من العينة على الآبار المخصصة باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات سعة 12.5 ميكرولتر. قم بتوزيع 2.5 ميكرولتر من مزج المسبار التمهيدي HKG في الآبار المخصصة بعد استخدام فيلم لاصق بصري لإغلاق اللوحة والتحكم المركزي عند 700 Gs لمدة دقيقة واحدة دوامة صفيحة البئر المختومة 384 في الخلاط الدوامي عند 2 ، 600 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين وجهاز الطرد المركزي عند 700 جبن لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، ضع لوحة الفحص المختومة في آلة Q-R-T-P-C-R. افتح القالب الخاص بتخطيط الفحص واستخدم شروط التفاعل التالية. ابدأ التشغيل وتصدير البيانات وتحليلها وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح في هذا الشكل ، تم تحليل توقيعات تعبير الإنترفيرون من النوع البشري الأول والثالث في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو p BMCs من ستة متبرعين تم تحفيزهم باستخدام روابط مستقبلات شبيهة بالحصان.

يتم تقديم البيانات كمخططات رادارية في مقياس لوغاريتمي باستخدام طريقتين للتحليل ، بما في ذلك قيمة CQ المطلقة التي تم تطبيعها لجين التدبير المنزلي وعدد نسخ القالب لكل ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. تظهر البيانات أن توقيعات تعبير الإنترفيرون البشري المستبثقة عن ناهضات TLR هي توقيعات تعبير خاصة بالرابطة من النوعين الأول والثالث في Resus Maccas. كانت أيضا محددة ترابط TLR في هذه التجربة ، تم تحفيز PBMC من ثلاثة متبرعين بثلاثة روابط لمدة ثلاث ساعات.

كان تعبير النوع الفرعي للإنترفيرون في الخلايا غير المحفزة عند خط الأساس منخفضا كما هو موضح هنا. تم التعبير عن عدد محدود من الأنواع الفرعية للإنترفيرون ألفا استجابة ل LPS و poly ic. في المقابل ، كان تعبير الإنترفيرون استجابة لإيميكيمود مرتفعا وكان تعبير النوع الفرعي تعبيرا واسعا عن إنترفيرون بيتا وإنترفيرون.

تم تحسين Lambda one من قبل جميع ناهضات TLR الثلاثة بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحضير والتشغيل analyze. 3D أربع لوحات فحص جيدا لتحليل الإنتاجية العالية لمجموعة متشابهة للغاية من الجينات مثل النوع الأول والأنواع الفرعية الثلاثة للإنترفيرون.