مقايسة مبيد للجراثيم في الدم للنشاط المبيد للجراثيم بوساطة الأجسام المضادة بوساطة تكميلية

خذ عينة مصل مخففة بشكل متسلسل تحتوي على أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد عديدات السكاريد الدهنية، أو LPS — وهو مكون غشاء خارجي للبكتيريا سالبة الجرام.

إدخال البكتيريا سالبة الجرام. ترتبط الأجسام المضادة في الدم ب LPS البكتيرية.

أضف البروتينات التكميلية. يرتبط مركب C1 بالأجسام المضادة المرتبطة ب LPS ، ويشكل C1 نشطا إنزيميا.

يشق C1 المنشط C4 و C2 لتشكيل C3 convertase ، والذي يشق C3 لتشكيل C5 convertase. يشق المحول C5 لإنتاج C5b ، الذي يجند C6 و C7. يدخل المركب الناتج في الغشاء الخارجي ويرتبط ب C8 والعديد من C9 ، مكونا مسام.

يؤدي تلف الغشاء الخارجي إلى زعزعة استقرار الغشاء الداخلي ، مما يتسبب في تحلل الخلايا.

ضع الخليط في طبق أجار ووزعه. احتضان لنمو البكتيريا. قم بتراكب اللوحة بأجار يحتوي على كلوريد ثلاثي الفينيل تيترازوليوم ، أو TTC ، والذي يتم تقليله عن طريق نازعة الهيدروجين الميكروبية ، مما يضفي لونا أحمر على المستعمرات البكتيرية.

يزداد عدد المستعمرة مع تخفيف العينة ، مما يشير إلى انخفاض نشاط مبيد للجراثيم مع انخفاض تركيز الأجسام المضادة.

للبدء ، احتضان العينات في حمام ماء دافئ عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعطيل عينات الاختبار بالحرارة. احصل على لوحة فحص و 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص للأعمدة من 1 إلى 12 من الصفوف من A إلى G. أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص إلى العمودين 1 و 2 من الصف H. قم بتحميل 30 ميكرولترا من كل عينة اختبار في نسختين إلى الصف H من لوحة المقايسة.

لبدء إجراء عمليات تخفيف تسلسلية ثلاثية الأضعاف لعينات الاختبار، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة 10 ميكرولتر من الآبار من 3H إلى 12H. انقل العينات إلى الآبار المقابلة في الصف G، وقم برفع وهبوط الماصة من 8 إلى 10 مرات لخلط العينة جيدا. بعد ذلك ، قم بإزالة 10 ميكرولتر من هذه الآبار ، ونقلها إلى الآبار المقابلة في الصف F ، وقم بإزالة الماصة لأعلى ولأسفل من 8 إلى 10 مرات للخلط. استمر في عملية التخفيف التسلسلي هذه من خلال الصف أ. بعد خلط الآبار في الصف A ، قم بإزالة والتخلص من 10 ميكرولتر من الآبار من 3A إلى 12A بحيث يكون الحجم النهائي في جميع الآبار 20 ميكرولترا.

استرجع قارورة واحدة من المخزون البكتيري المستهدف المجمد ، وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتخفيف البكتيريا في 20 مل من مخزن الفحص المؤقت وفقا لعامل التخفيف الأمثل المحدد مسبقا. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 10 ميكرولترات من البكتيريا المخففة إلى كل بئر من لوحة الفحص.

استرجع قارورة واحدة من مكمل الأرانب الصغيرة المجمدة وقارورة واحدة من BRC المجمد المعطل بالحرارة. استخدم الماء الجاري البارد لإذابة القوارير إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، امزج 100 ميكرولتر من الحرارة و BRC المعطلة بالحرارة مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص. أضف 50 ميكرولترا من محلول BRC المعطل بالحرارة بنسبة 20٪ إلى جميع الآبار في العمود 1. امزج 1 مليلتر من BRC الأصلي مع 4 ملليلتر من المخزن المؤقت للفحص. أضف 50 ميكرولترا من هذا الخليط بنسبة 20٪ إلى جميع الآبار في الأعمدة من 2 إلى 12. ضع الطبق على شاكر اللوحة لمدة 10 إلى 15 ثانية لخلط لوحة الفحص برفق.

احتضان لوحة الفحص في حاضنة ميكروبيولوجية لمدة ساعتين. في هذه الأثناء ، قم بإزالة الأغطية من لوحين من أجار LB ، وضع الألواح متجهة لأعلى في خزانة أمان بيولوجية لمدة 40 إلى 60 دقيقة حتى تجف. عند اكتمال الحضانة ، انقل لوحة الفحص إلى الثلج الرطب ، واحتضانها لمدة 10 إلى 20 دقيقة لإيقاف التفاعل. باستخدام ماصة ذات 12 قناة، امزج الآبار الموجودة في الصف H والصفيحة الموضعية 10 ميكرولتر من خليط التفاعل في قاع صفيحة LBA. قم بإمالة اللوحة على الفور ، واترك البقع تعمل لحوالي 1.5 إلى 2 سم.

كرر هذا الإجراء للصفوف G و F و E، مع اكتشافها فوق الصف السابق. احتضان ألواح LBA في درجة حرارة الغرفة حتى يتم امتصاص المحلول في ألواح LBA. ثم ضع الأغطية على الأطباق ، وانقلها رأسا على عقب إلى حاضنة ميكروبيولوجية لاحتضانها طوال الليل.

في اليوم التالي ، أضف 25 مل من أجار التراكب عند 55 درجة مئوية يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من TTC و 0.1٪ أزيد الصوديوم إلى كل لوحة LBA. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للبكتيريا الباقية على قيد الحياة بتكوين لون أحمر. بعد ذلك ، استخدم كاميرا رقمية لتصوير اللوحات. انقل الصور إلى جهاز كمبيوتر ، واستخدم برنامج تعداد المستعمرات المتكامل من NIST لتحليل الصور كما هو موضح في بروتوكول النص.