طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.
يناير 29, 2014
نحن هنا وصف اثنين من المقايسات لقياس تفعيل مكملا الناجم عن أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء. وميزة كبيرة على المقايسات الحالي الكمي وطبيعة السهل تفسير ل.
الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم تنشيط المتممة بواسطة الأجسام المضادة ضد خلايا الدم الحمراء أو RBCs في مصل المريض. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحضين خلايا الدم الحمراء مع مصل المريض في وجود جسم مضاد حاجب لـ C five لتحفيز ترسب C four و C3 على سطح RBC. بعد ذلك، يتم صبغ RBC باستخدام أجسام مضادة لـ C four و C3 موسومة بفلورسنت، ومن ثم يمكن تحليل كمية ترسب المتممة على RBC عن طريق قياس التدفق الخلوي في طريقة بديلة.
تُحضن كرات الدم الحمراء مع مصل المريض في غياب anti C five لتحفيز التحلل بوساطة المتممة. ويمكن بعد ذلك تحديد نسبة كرات الدم الحمراء المتحللة عن طريق قياس كمية الهيموجلوبين التي تفرزها الخلايا باستخدام القياس الطيفي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية الجديدة مقارنة بالطرق الحالية مثل اختبار التحلل أو اختبار مضاد الجلوبيولين المستخدم في التشخيص الروتيني في كونها كمية بطبيعتها، مما يتيح لنا الكشف عن الفروق الطفيفة في تنشيط المتممة.
ستقوم إليزابيث بروك، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبرنا، بشرح الإجراءات. ابدأ بغسل كريات الدم الحمراء من الفصيلة O ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم قم بتحضين الراسب في محلول Roma lane بتركيز 0.5% بنسبة 1:2 لمدة 10 دقائق عند 37 °C. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات إضافية، قم بتخزينها كمحلول بتركيز 3% في PBS طازج عند 4 °C لتحليل ترسب المتممة على كريات الدم الحمراء باستخدام قياس التدفق الخلوي. أولاً، قم بتعطيل الكمية المطلوبة من مصل المريض حرارياً لمدة 30 دقيقة عند 56 °C. وأثناء المعالجة الحرارية للمصل، اغسل كريات الدم الحمراء المعالجة بـ brola ثلاث مرات في محلول Roal المنظم بعد الغسلة النهائية.
أعد تعليق الراسب في vbg plus plus بتخفيف 0.5%. بعد ذلك، أضف في خرزة زجاجية 25 microliters من RBCs بتركيز 0.5% و37.5 microliters من مصل AB الطازج و37.5 microliters من anti C five بتركيز 200 micrograms per milliliter إلى كل بئر من آبار لوحة ذات قاع مستدير تحتوي على 96 بئراً. ثم أضف مصل المريض المعطل حرارياً إلى كل بئر بالتركيز المناسب، مع الاستكمال بمصل AB المعطل حرارياً حسب الضرورة، وتضمين ضابط سلبي أيضاً.
استخدم VBG plus plus لرفع الحجم النهائي في كل بئر إلى 150 µL، ثم قم بحضن اللوحة مغطاة برقائق EIA لمدة ساعة ونصف إلى ساعتين عند 37 °C مع الرج. بعد انتهاء فترة الحضن، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS مكمل بـ 0.5% BSA، ثم قم بوسم الخلايا باستخدام 1 µg/mL من أجسام مضادة أحادية النسيلة مضادة لـ C3 ومضادة لـ C4 مmarked بفلوروسنت. احضن الخلايا لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف، وبعد غسل اللوحة ثلاث مرات، أعد تعليق RBCs في 150 µL من PBS مضاف إليه 0.5% BSA لكل بئر.
سننقل معلقات الخلايا إلى طبق جديد بـ 96 بئراً ذات قاع مستدير، ثم نضع الطبق في جهاز قياس التدفق الخلوي، ونفصل الخلايا المفردة عن المزدوجات باستخدام مخطط التشتت الأمامي. يتم ضبط البوابة على خلايا RBCs المفردة، ثم نختار قناة الكشف المناسبة للإشارات الفلورية. نُكمّم النتائج باستخدام متوسط شدة الفلورة لإجراء تحليل تحللي كمي، ثم نقوم بتسخين مصل المريض وتنشيطه وغسل خلايا RBCs المعالجة بالرومين كما تم توضيحه للتو.
بعد ذلك، وبعد تحضين كرات الدم الحمراء (RBCs) مع المتمم ومصل المريض كما تم توضيحه للتو، ولكن بدون anti C five، يتم تدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 664 GS مع تقليل التباطؤ. بعد ذلك، انقل بعناية 90 µL من المادة الطافية إلى طبق معايرة دقيق جديد، مع الحرص على عدم نقل الخلايا السليمة وتجنب تكوين فقاعات هوائية، ثم قم بقياس الامتصاص عند 414 إلى 690 في جهاز مطياف الامتصاص الضوئي. يتم التعبير عن انحلال الدم كنسبة مئوية من تحلل عينة من كرات الدم الحمراء (RBCs) المحضنة في ماء نقي.
في هذا الشكل الأول، تظهر مخططات تشتت تمثيلية لخلايا الدم الحمراء المعالجة بـ brola، ويمكن رؤية التحديد المناسب للخلايا الحمراء الفردية هنا. عادةً، تقع حوالي 95% من خلايا الدم الحمراء ضمن بوابة الخلية الواحدة هذه. وفي هذه المخططات البيانية، تظهر النتائج التمثيلية لتأثير فقر الدم الانحلالي المناعي الذاتي أو aha.
تظهر ترسبات C4 وC3 في مصل المريض كما هو متوقع، حيث يؤدي زيادة مصل المريض إلى زيادة ترسب المتممة. ومن المثير للاهتمام أن ترسب المتممة يحدث في قمتين موجبتين متمايزتين. ومن المرجح أن هذا لا ينتج عن عدم تجانس في مجموعة كريات الدم الحمراء بما أن كريات الدم الحمراء سُحبت من متبرع واحد، وبالرغم من أن سبب هذه الظاهرة لا يزال قيد البحث، إلا أنه تم تمثيل متوسطات كثافة الفلورة للعينات في هذه الرسوم البيانية الخطية لإظهار مدى تكرارية فحوصات ترسب C4 وC3.
لاحظ التباين الواسع في ترسب عينات المرضى المختلفة المصابين بـ AH H. وأخيراً، يمكن ملاحظة البيانات المستمدة من مقايسة تحللية لعينة مصل مريض ahha تحتوي على أجسام مضادة ذاتية لخلايا RBCs في هذه الرسوم البيانية. ويؤدي المعايرة باستخدام عينة المصل إلى الحصول على منحنى واضح وقابل للتكرار عند استخدام مثبط متمم مناسب مثل anti C five.
يمكن معايرة الإشارة الانحلالية حتى تتلاشى كما هو موضح في هذا الرسم البياني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تنشيط المتممة بواسطة الأجسام المضادة النوعية لخلايا الدم الحمراء، إما عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي لترسيب C3 أو C4 أو عن طريق مقايسة الانحلال الدموي الكمية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة اختبارين لقياس تنشيط المتممة الناتج عن الأجسام المضادة ضد خلايا الدم الحمراء (RBCs). وتعد هذه الاختبارات كمية وسهلة التفسير، مما يوفر مزايا مقارنة بالطرق الحالية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم المناعة
- علم أمراض الدم
- قياس التدفق الخلوي
خلفية علمية
- يعد تنشيط النظام المتمم أمراً بالغ الأهمية في الاستجابات المناعية.
- يمكن أن تؤدي الأجسام المضادة ضد خلايا RBCs إلى حالات سريرية متنوعة.
- قد تفتقر المقايسات الحالية إلى الدقة الكمية.
- تهدف الطرق الجديدة إلى تحسين الكشف عن تنشيط النظام المتمم.
الغرض من الدراسة
- لتقييم تنشيط المتممة بواسطة الأجسام المضادة ضد خلايا الدم الحمراء.
- لتطوير مقايسة كمية من أجل تفسير أفضل للنتائج.
- لمقارنة التقنيات الجديدة مع طرق التشخيص الحالية.
الطرق المستخدمة
- تحضين كريات الدم الحمراء مع مصل المريض والأجسام المضادة الحاجبة.
- صبغ كريات الدم الحمراء باستخدام أجسام مضادة موسومة فلورياً.
- تحليل ترسب المتمم عبر قياس التدفق الخلوي.
- قياس تحرر الهيموجلوبين لتحديد تحلل كريات الدم الحمراء.
النتائج الرئيسية
- توفر المقايسات الجديدة بيانات كمية عن تنشيط المتممة.
- يمكن الكشف عن الفروق غير المثالية في التنشيط.
- تظهر النتائج تحسناً في الحساسية مقارنة بالطرق التقليدية.
- يتيح تحليل قياس التدفق الخلوي تفسيراً مفصلاً.
الاستنتاجات
- تعزز المقايسات الجديدة من فهم عملية تنشيط المتممة.
- وهي توفر بديلاً موثوقاً للاختبارات التشخيصية الحالية.
- وقد تساهم التطبيقات المستقبلية في تحسين تشخيص المرضى وعلاجهم.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُعد التقييم الكمي لتنشيط المتممة الناجم عن الأجسام المضادة على خلايا الدم الحمراء أمراً بالغ الأهمية لتقييم فعالية مثبطات المتممة وفهم آليات التحلل الدموي في الاضطرابات المناعية الذاتية والمناعية الخيفية. توفر مقايسات قياس التدفق الخلوي والقياس الطيفي الموصوفة قراءات كمية قابلة للتكرار تتيح الكشف عن الاختلافات الطفيفة في تنشيط المتممة، مما يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية في التطوير العلاجي. وتعزز هذه الطرق الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تحويل الملاحظات النوعية إلى مؤشرات حيوية قابلة للقياس والترجمة لاتخاذ القرارات في المراحل قبل السريرية والسريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس ترسب المتممة (C3/C4) الذي تحفزه الأجسام المضادة الذاتية أو الأجسام المضادة الغريبة على خلايا RBCs.
- القيمة التشغيلية: توفر تحققاً وظيفياً من الهدف من خلال القياس المباشر للنشاط المؤثر بوساطة الأجسام المضادة، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في اختيار الهدف.
- القيمة التنبؤية: تدعم عملية فرز المحفظة الدوائية من خلال توليد بيانات كمية حول قوة تنشيط المتممة، مما يدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) بالنسبة للعلاجات المعدلة للمتممة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج مخرجات كمية ومعيارية (متوسط شدة الفلورة، وتحرر الهيموجلوبين) مناسبة للفحص عالي الإنتاجية لمثبطات المتممة أو الأجسام المضادة العلاجية.
- قابلية التكرار: تُظهر تباينًا منخفضًا عبر عينات مصل المرضى، مما يتيح تقييمًا موثوقًا للمركبات وتوحيدًا قياسيًا بين المختبرات.
- فائدة المنصة: تستخدم أجهزة متاحة (جهاز قياس التدفق الخلوي، وجهاز المطياف الضوئي) لإنشاء مقايسات قابلة لإعادة الاستخدام لقياس النشاط الحيوي المعتمد على المتممة في مسارات الاكتشاف.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يعمل على نمذجة الآليات الفسيولوجية المرضية في فقر الدم الانحلالي المناعي الذاتي (AIHA) والانحلال الدموي المناعي الخيفي، مما يربط بين الارتباط بالهدف وتنشيط المتممة الوظيفي.
- الاستمرارية الانتقالية: يجسّر الفجوة بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال توفير مؤشرات حيوية كمية (ترسب C3/C4، والانحلال الدموي) التي ترتبط بالقدرة الانحلالية السريرية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يتيح تقليل المخاطر الميكانيكية عن طريق قياس التحلل بوساطة المتممة، مما يوجه تقييمات السلامة ونمذجة الاستجابة للجرعة في الدراسات قبل السريرية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تتكامل هذه المقاييس ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة وتقييم السلامة قبل السريرية، مما يوفر قراءات كمية لتنشيط المتممة تساهم في تقليل المخاطر البيولوجية وتقييم المؤشر العلاجي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس مسارات تنشيط المتممة التي تحفزها الأجسام المضادة، مما يوضح آلية عمل المرشحات المعدلة للمناعة.
- الفحص: توفر مخرجات كمية جاهزة للمقايسة (شدة الفلورة، والتحلل الدموي بالمطياف الضوئي) مما يتيح مقارنة موثوقة للمركبات المختبرة أو عينات المصل.
- التحليلات: تولد قراءات قابلة للقياس (متوسط شدة الفلورة، وإطلاق الهيموغلوبين) تسهل التحليل الإحصائي والمقارنة بين الظروف المختلفة في دراسات الاستجابة للجرعة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال مخرجات ذات صلة بالمرض تعكس تنشيط المتممة المشاهد في حالات فقر الدم الانحلالي المناعي الذاتي (AIHA) وسياقات نقل الدم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قياسية وقابلة للتوسع لتقييم النشاط المعتمد على المتممة عبر العلاجات بالأجسام المضادة، والبدائل الحيوية، ومثبطات المتممة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تحويل مقايسات المتممة النوعية إلى قياسات كمية قابلة للترجمة.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي من خلال بروتوكولات محددة لتحضير خلايا RBC، وحضانة المصل، والكشف عبر قياس التدفق الخلوي أو القياس الطيفي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين الكشف المبكر عن نقاط الضعف التي تنشط المتممة، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة من برامج التعديل المناعي.
- التأثير على المحفظة: توجه عملية تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر عن طريق قياس إمكانية تنشيط المتممة كمياً، مما يدعم قرارات التقدم الموضوعية في التطوير العلاجي.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في علم المناعة، وقياس التدفق الخلوي، والتعامل مع المقاييس الطيفية لضمان دقة قياسات ترسب المتممة والتحلل الدموي.
- تعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي ذات القنوات الفلورية المناسبة، وأجهزة القياس الطيفي لتقدير كمية الهيموجلوبين عند 414/690 nm.
- تستوجب توحيد معايير تحضير خلايا الدم الحمراء (مثل: النوع صفر، أو المعالجة بالبروميلين) وتعطيل المصل حرارياً لضمان اتساق المقايسة بين مختلف المستخدمين والمواقع.
- تتطلب مراعاة اعتبارات التكيف عند التطبيق على أنواع مختلفة من خلايا الدم الحمراء، أو كثافات مستضدية مختلفة، أو مصادر متممة أخرى غير مصل AB البشري.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى نقل الراشح بعناية لتجنب انتقال الخلايا أو تكون فقاعات هوائية، مما قد يؤثر على دقة تقدير كمية التحلل الدموي.
