العزلة وتوصيف هويشت ^منخفضة CD45 ^{السلبية} ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة الوسيطة الرئوية منخفضة القرص المضغوط 45 المضيف. الخلايا الجذعية الوسيطة رنين الأنسجة أو الخلايا الجذعية الجذعية هي منظمات مهمة لإصلاح الأنسجة أو تجديدها والتليف والالتهاب وتكوين الأوعية. أولا ، يتم تشريح الرئتين من فأر مضحى.

يتم هضم أنسجة الرئة للحصول على معلق خلية واحدة. يتم تلطيخ الخلايا بقالب خدعة و CD 45 ويتم فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي للحصول على المضيف منخفض CD 45 الخلايا الجذعية الجذعية للرئة السلبية. ثم يتم توسيع الخلايا الجذعية الجذعية للرئة في الثقافة ويتم إجراء اختبار تشكيل مستعمرة لتقييم قدرات تمايز MSC.

يمكن بعد ذلك إجراء مزيد من الدراسات لفحص دور الخلايا الجذعية الجذعية أثناء توازن الأنسجة والمرض. يمكن استخدام الطريقة التي نعرضها هنا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة للفأر أو الرئة البشرية ويمكن تطبيقها على هذه الدراسة لأمراض الرئة مثل التليف الرئوي وارتفاع ضغط الدم الرئوي ومرض الانسداد الرئوي المزمن. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب تنوع الطرق المتاحة لإعداد الأنسجة ، بالإضافة إلى إعداد مقياس التدفق الخلوي والضوابط والتحليل المناسبين.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه من الصعب وصف التقنية المناسبة لفرم وهضم أنسجة الرئة من أجل البقاء الأمثل للخلايا بالكلمات وحدها. أيضا ، من الأفضل توصيل أداة قياس التدفق الخلوي التي تم إعدادها والتحليلات من خلال العرض التوضيحي. ابدأ هذا البروتوكول بإزالة الرئتين اللتين سيتم استخدامهما للحصول على الخلايا الجذعية الوسيطة من فأر بالغ مضحى.

استخدم زوجا صغيرا من المقصات الحادة لقطع القفص الصدري بشكل جانبي على كل جانب من جوانب الماوس. افتح تجويف الصدر ، ثم قم بإزالة الحجاب الحاجز. أدخل حقنة سعة 10 ملليلتر بإبرة قياس 20 ونصف في بطين القلب الأيمن واضغط برفق على المكبس لنقعه بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من PBS ، مما يؤدي إلى طرد الدم من الرئتين.

بعد ذلك ، باستخدام المقص ، قم بقص القصبة الهوائية والشعب الهوائية الكبيرة وتخلص منها. ثم باستخدام الملقط. التقط فصوص الرئة البيضاء الصغيرة وضعها في طبق بتري مليء بمحلول ملحي من هانك أو HBSS.

ثم قم بإزالة القلب وفصل فصوص الرئة. كرر هذه العملية لجميع الفئران في الدراسة. انقل فصوص الرئة إلى غطاء الطبق.

بلل الأنسجة بما يكفي من HBSS لمنعها من الجفاف. ثم باستخدام مشرط يمكن التخلص منه ، قم بفرم فصوص الرئة للحصول على نخاع العظم لاستخدام التحكم المستدام لقياس التدفق الخلوي. استخدم مقصا حادا لقص الكاحل وأعلى عظم الفخذ.

ضع الطرف في طبق بتري جديد. ثم قطع الركبة ، تاركا قطعة خطية من عظم الفخذ وقطعة ثانية تحتوي على الظنبوب والشظية. باستخدام الملقط ، اسحب العضلة للكشف عن الساق والشظية وعظم الفخذ.

الآن خذ حقنة خمسة ملليلتر بإبرة قياس 26 ونصف وأدخل الإبرة في فتحة نخاع العظم. في أحد طرفي الظنبوب ، أمسك العظم مع توجيه الطرف الآخر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مملوء ب 15 مل HBSS والضغط على المكبس لتوزيع HBSS وتدفق نخاع العظم في الأنبوب. كرر هذه العملية مع الشظية وعظم الفخذ.

تلطخ نخاع العظم مع المضيف 3 3 3 4 2 يموت بتركيز نهائي من خمسة ميكروغرام لكل مليلتر في DMEM عالي الجلوكوز المكملة. بعد ذلك ، سيتم إنشاء معلق خلية واحدة من أنسجة الرئة من الأنسجة المعزولة. ضع كل رئة في أنبوب يحتوي على التدفئة المبكرة.0.2٪ ورثينجتون.

النوع الثاني من الكولاجيناز محضر في HBSS معقم ، ثم اغمر الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، استخدم الماصة سعة 10 ملليلتر لتقشير العينة حتى يتدفق الهضم بسهولة عبر الماصة. ما يقرب من 10 تكرارات تحتضن لمدة 15 دقيقة إضافية ، 37 درجة مئوية لإكمال هضم الأنسجة.

بمجرد اكتمال الهضم ، قم بتخفيف معلق الخلية باستخدام HBSS واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر للخلية مرة أخرى لتفريق أي شظايا أنسجة متبقية. بعد ذلك ، لإزالة شظايا الأنسجة غير المهضومة ، اسكب المعلق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومولار في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف المعلق قليلا في كل مرة للسماح للعينة بالتدفق عبر مصفاة الخلية.

إذا كانت شظايا الأنسجة غير المهضومة تمنع تماما تدفق تعليق الخلية. صب من خلال مصفاة خلوية جديدة في أنبوب جديد. بيليه تعليق الخلية لمدة 10 دقائق عند 450 RCF.

بعد صب الدوران ، قم بصب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق في درجة حرارة الغرفة. مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء ، احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم أضف حجما متساويا من HBSS لتعطيل المخزن المؤقت للتحلل.

صب معلق الخلية في مصفاة خلية 40 ميكرومولار لإزالة الحطام ومجاميع الخلايا ، وجمع التدفق من خلال أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. بعد ذلك ، باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، حدد أرقام الخلايا لكل من عينات الرئة ونخاع العظام. سجل التركيز والحجم الكلي لتعليق الخلية.

ثم قم بتكسير معلق خلية الرئة المفردة عن طريق الطرد المركزي عند 450 RCF لمدة 10 دقائق. للحفاظ على الخلايا ، قم بإعادة تعليق كل من خلايا الرئة ونخاع العظام في وقت واحد. 10 إلى الخلايا الست في المليلتر في التسخين المكمل نسبة عالية من الجلوكوز DMEM.

لتلطيخ الحمض النووي ، أضف صبغة HOAXED 3 3 3 4 2 إلى التركيز النهائي البالغ خمسة ميكروغرام لكل لتر. بعد ذلك ، امزج الخلايا عن طريق الانعكاس اللطيف واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة بالضبط. ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 جيجابايت عند أربع درجات مئوية بعد الدوران.

استمر في تلطيخ أنسجة الرئة ونخاع العظام باستخدام مضاد CD 45 ويوديد البروبيديوم استعدادا للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. بمجرد تلطيخ الخلايا ، قم بتخزين الأنابيب على الجليد المحمي من الضوء حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. استعد لقياس التدفق الخلوي من خلال التأكد من محاذاة أجهزة الليزر وإعدادها لفرز الخلايا.

يجب أن تكون الأداة المستخدمة مجهزة بالليزر الأزرق 488 نانومتر الأحمر 635 نانومتر والأشعة فوق البنفسجية 350 إلى 355 نانومتر مع كاشفين على مسار ليزر الأشعة فوق البنفسجية باللون الأزرق 45 على 65 والأحمر 6 75 على 50 مرشحا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتمتع كاشف الأشعة فوق البنفسجية الأحمر بحساسية عالية للإشارة الحمراء ويجب أن يكون الجهاز مزودا بوحدة تبريد للحفاظ على العينة عند 10 درجات مئوية. في برنامج الأداة ، قم بإعداد مخططات الرسم البياني لعرض التشتت الخطي الأمامي مقابل التشتت الجانبي ، وهو مخطط تمييز مزدوج مناسب للأداة.

مخطط رسم بياني ل PI باستخدام إشارة سجل ، وساحل أحمر مقابل أزرق باستخدام إشارات خطية ومخطط رسم بياني ل CD 45 A PC باستخدام إشارة السجل. بمجرد أن تصبح الأداة جاهزة ، ضع عينة نخاع العظم الملون في منفذ تحميل الجهاز. تستخدم هذه العينة كعنصر تحكم في إعداد التلوين والأداة.

ابدأ في جمع الأحداث واضبط الإشارات الخطية المبعثرة الداخلية الأمامية. لتصور مجموعة الخلايا بوضوح ، يجب أن تتواجد الخلايا تقريبا في المركز السفلي من التشتت الأمامي للمؤامرة كمحور x. نظرا لأن البقعة النووية PI هي منفذة الغشاء IMP ، استبعادها من الخلايا الحية.

ارسم منطقة مشية على الخلايا الميتة الموجبة PI في الرسم البياني PI. اطلب من برنامج الأداة تلوين الخلايا الميتة. في هذه البوابة الحمراء.

من المفيد استخدام الخلايا الميتة ذات الفتحات الملونة كملاح لتحديد مجموعة المضيف G صفر G واحدة. يتم إثارة صبغة PI أيضا بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية ويجب أن تكون غالبية الخلايا الميتة خارج نطاق واسع. على الجانب الأيمن من مؤامرة التألق المخادعة باللون الأحمر مقابل الأزرق ، يجب أن ينظر إلى مجموعة G zero G واحدة من نخاع العظام على أنها مجموعة ضيقة من الأحداث في المؤامرة المخادعة باللون الأحمر مقابل الأزرق المخادعة.

اضبط جهد الكاشف لوضع مجموعة G zero G في الجزء العلوي الأيمن من المركز على قطعة الأرض. قد يكون جزء من المرحلة S و G اثنين بأكملها من دورة الخلية خارج نطاق واسع. في الجزء العلوي الأيمن من المخطط المخادع الأحمر مقابل الأزرق ، سيظهر عدد المضيفين الجانبيين منخفضين يتخلفون من الجانب الأيسر من G صفر G مجموعة واحدة إلى الزاوية اليسرى السفلية من المؤامرة.

الآن ارسم بوابة حول مجموعة الخلايا في FSC مقابل SSC. ارسم المجموعة المفردة المحددة في المخطط المزدوج والخلايا الحية في الرسم البياني PI. ثم قم بتعيين مخطط الخادعة لعرض هذه المجموعات السكانية المسورة فقط.

بعد بوابات المؤامرة المضيفة ، ارسم منطقة حول السكان الجانبيين. قم بتعيين هذه المنطقة كبوابة للرسم البياني للكمبيوتر المضغوط 45 A جنبا إلى جنب مع مفردة مبعثر الضوء وبوابات الخلية الحية. الآن بعد إعداد النظام ، قم بإزالة العينة من منفذ التحميل وضع عينة الرئة في منفذ التحميل.

يجب عدم الحاجة إلى ضبط إعدادات الجهاز مرة أخرى لهذه العينة. ابدأ في جمع الأحداث على مؤامرة الخدعة الحمراء مقابل الزرقاء. عادة ما تظهر مجموعة G zero G لعينة الرئة أكثر استطالة في اتجاه المحور x وتشبه رمز تيلدا على لوحة المفاتيح.

يجب أن تكون خدعة المشية الجانبية المنخفضة في وضع مشابه لتلك المحددة لعينة نخاع العظم. قد تكون هذه التعديلات الطفيفة لأعلى أو لأسفل ضرورية لضمان دقة دقيقة للسكان الجانبيين. حافظ على فرق الضغط المنخفض أثناء الفرز عن طريق التأكد من عدم فتح صمام تدفق العينة بعيدا جدا.

بجانب عزل MSC ، ضع لوحة تجميع 96 بئر في غرفة الفرز وقم بإعداد بوابات الفرز على الرسم البياني CD 45 A PC لفصل السكان الإيجابيين والسالبين. أخيرا ، اجمع الخلايا إما كمجموعة مختلطة في أنبوب أو خلايا مفردة لعزل المستنسخة في صفيحة 96 بئر بعد جمع الخلايا الجذعية الجذعية عن طريق فرز الخلايا ، يتم طلاء الخلايا في أطباق 30 ملم باستخدام MEM مكمل بنسبة 20٪ FBS. أولا ، تظهر الخلايا التي تم فرزها صغيرة ومستديرة ومشرقة بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع تقريبا.

تصبح المستعمرات ذات النمط الظاهري لللحمة المتوسطة واضحة ويكون الانتشار أكثر وضوحا لكل مستحضر خلية. تقييم قدرة MSC للرئة على التمايز إلى سلالات وسيطة تقليدية من بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية وتعبيرها على سطح الخلية عن علامات اللحمة المتوسطة المقبولة. إجراء تحليل الحظر الوراثي الخلوي لتأكيد عدم وجود تشوهات كروموسومية جسيمة.

بعد العزل عن طريق قياس التدفق الخلوي وتوليد استنساخ خلية واحدة ، يتم إجراء اختبار تشكيل مستعمرة لتوصيف خلايا MSC وقدرات التمايز. ابدأ بالخلايا المخففة إلى ثلاثة أضعاف 10 من الخلايا الأربع لكل مليلتر. وسط غير مكتمل في أطباق 100 ملم ، قم بإجراء تخفيف الحبوب مرتين ، ستة مرات 10 من الأربعة ، ثلاث مرات 10 من الأربعة ، 1.5 مرة 10 إلى أربعة و 0.75 مرات 10 إلى الخلايا الأربع لكل طبق في 10 ملليلتر من الوسائط في ثلاث نسخ.

ثم ضع الألواح في الحاضنة بعد 10 أيام من الثقافة ، واسكب الوسط واشطف الخلايا باستخدام PBS. ثم قم بإصلاحها بإضافة 100٪ ميثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، اسكب الميثانول.

ثم للكشف عن تكوين المستعمرة ، أضف 0.4٪ من الوزن حسب الحجم gza المخفف من واحد إلى 20 مع احتضان الماء المتأين لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم اسكب البقعة واشطفها بالماء المتأين. اسمح للعينات بالجفاف في الهواء وتحديد عدد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 25 خلية لكل مستعمرة باستخدام مجهر مقلوب أو تصور.

المستعمرات كبيرة وتتكون من بضع مئات من الخلايا كما هو موضح هنا وتعرض نمطا ظاهريا لللحمة المتوسطة. تم عزل MSC كما هو موضح في هذا الفيديو وتم طلاؤه في 96 لوحة بئر تحاكي النمو. ثم تمت إضافة الخلايا العارضة للمستضد المعتمد CFSE إلى الخلايا الجذعية الجذعية للرئة.

ثم تم قياس تكاثر الخلايا الجذعية الجذعية المعزولة على أنه انخفاض في متوسط شدة التألق ل CFSE مقارنة بالخلفية ، والتي تم تسميتها CFSE بالخلايا التائية وحدها كما هو موضح في هذا الشكل ، في حالة عدم وجود SC للرئة ووجود خلايا مقدمة للمستضد ، تظهر A PC plus ناقص O الألبومين CD 40 الخلية التائية الفعالة الإيجابية انخفاضا في شدة CFSE ، مما يشير إلى الانتشار المحاط بدائرة باللون الأحمر. تنخفض شدة مضان CFSE لغشاء الخلية التائية اقتصاديا مع كل انقسام خلوي IE نصف مع كل انقسام في وجود الرئة M-S-C-A-P-C بالإضافة إلى ناقص OVA CD 40 تظهر الخلايا التائية المصابة الإيجابية أي تغيير كبير في شدة CFSE ، مما يشير إلى عدم التكاثر بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية الرئوية لاستكشاف دور الخلايا الجذعية الوسيطة في أمراض الرئة مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي والتليف الرئوي.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي خمس ساعات بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات التمايز من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، بما في ذلك ما إذا كانت الخلايا الجذعية الوسيطة الرئوية المفترضة تظهر تمايزا مناسبا متعدد السلالات ، وإمكانية حدوث دهون العظام والغضاريف.