عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر
ديسمبر 16, 2021
هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.
هنا ، نوضح بروتوكولنا الخاص بعزل الخلايا الجيبية الأولية لكبد الفأر أو عزل LSECs. يتكون البروتوكول من تروية كولاجيناز الكبد والطرد المركزي الفائق السرعة منخفض السرعة لتنقية الخلايا غير المتنية واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. طريقة عزل LSEC الخاصة بنا فعالة للغاية وقابلة للتطبيق على كبد الفأر الصحي والمريض.
تعرض LSECs المعزولة نقاء عاليا وتحافظ على الهيكل والوظيفة. تعتبر LSECs المعزولة باستخدام هذا البروتوكول مثالية للدراسات الوظيفية والجزيئية وتوليد البيانات متعددة الأوميك. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لدراسة الاتصال بين الخلايا في الكبد.
ابدأ بطلاء أطباق الثقافة التي يبلغ طولها 10 سنتيمترات بثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجين. ثم ، احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة ، قم بإزالة السائل الزائد من السطح المطلي.
اغسل الأطباق باستخدام PBS ثلاث مرات واتركها لتجف في الهواء. قم بإعداد جهاز إعادة التدوير الساخن والرطب. شطف نظام التروية باستخدام 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق.
ثم اشطف النظام مرة أخرى بالماء المعقم لمدة 10 دقائق أخرى. صفي سائل الشطف قدر الإمكان قبل دمجه بمحلول الكولاجيناز. غرس محلول الكولاجيناز من خلال نظام التروية لتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
اضبط معدل المضخة على سرعة واحدة على قرص التحكم في السرعة. حافظ على السرعة كما هي طوال الإجراء بأكمله. وزن الماوس لهذا الإجراء.
ثم قم بتأمينه على السطح الجراحي. رش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق يبلغ طوله حوالي خمسة سنتيمترات بدءا من الجزء السفلي من البطن حتى عملية الخنازير.
بعد ذلك ، قم بإجراء قطعتين جانبيتين باستخدام مقص قزحية صغير على كل جانب من جوانب البطن لكشف أعضاء البطن بالكامل. ضع غمد القسطرة الوريدية تحت ظهر الحيوان لرفع البطن وتسويته. باستخدام ملقط ضمادة منحني منتظم ، اسحب الأمعاء والمعدة بلطف إلى يسار الحيوان.
ثم ، ضع خياطة جراحية 5-0 تحت الوريد الأجوف السفلي ، أو IVC ، أسفل الكلى اليسرى المكشوفة مباشرة. اربط وصلة فضفاضة في الخياطة. بعد ذلك ، ضع خياطة جراحية أخرى 5-0 حول الوريد البابي الكبدي.
ضع الخيط فوق نقطة تفرع الوريد الطحالي مباشرة في الوريد البابي الكبدي. مرة أخرى ، اربط عقبة فضفاضة في الخياطة. باستخدام خياطة الوريد البابي كشد ، أدخل القسطرة الوريدية ذات المقياس 20 في الوريد البابي الكبدي على بعد سنتيمتر واحد أدناه حيث تتفرع إلى الوريد البابي الكبدي الأيمن والأيسر.
ثم، حرك القسطرة لأعلى الوريد، ولكن احتفظ بها أسفل منطقة التفرع. اسمح للدم بالانتقال إلى أسفل القسطرة حتى يبدأ في التنقيط. قم بتأمين القسطرة الوريدية باستخدام خياطة الوريد البابي.
استخدم خطا IV لتوصيل زجاجة IV مع المخزن المؤقت A بالقسطرة. ثم اغسل الكبد بهذا المحلول مع تجنب دخول الهواء إلى النظام. اربط الخيط حول IVC أسفل الكلى.
بعد ذلك ، قم بقطع IVC أسفل الخيط للسماح للحيوان بالنزيف. بمجرد التعطير ، اقطع المعدة والأمعاء والطحال والأحشاء الأخرى المرتبطة بالكبد. ثم ، قطع الحجاب الحاجز والأوعية الرئيسية من التجويف الصدري.
إزالة الكبد من الحيوان ووضعه على صينية التروية. قم بإزالة الخط الوريدي بعناية وقم بتوصيل محلول الكولاجيناز في غرفة إعادة التدوير. اسمح للكبد بالنفاذ حتى تصبح الكبسولة نموذجية وتبدو طرية.
يجب أن يستغرق هذا عادة من 10 إلى 15 دقيقة. بمجرد هضمه ، قم بإزالة الكبد من الغرفة وضعه على طبق بتري بطول 10 سم مع حوالي 20 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل. اختر الكبد بلطف مع اثنين من نصائح الماصة وتخلص من الشجرة الصفراوية.
بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الكبد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 50 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ثم ، جمع supernatant التي تحتوي على خلايا كبدية غير متني.
جهاز الطرد المركزي الفائق عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بجمع حبيبات الخلية وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من العازلة المؤقتة. حدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية تلقائي باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
بعد ذلك ، الطرد المركزي تعليق الخلية. قم بشفط السوبرناتانت بالكامل وإعادة تعليق الكريات مع 90 ميكرولتر من العازل العازل لكل 10 ملايين خلية. أضف 10 ميكرولترات من CD146 MicroBeads لكل 10 ملايين خلية إجمالية.
اخلطيها جيدا واحتضنيها لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لغسل الخلايا ، أضف واحدا إلى ملليلترين من العزل العازل لكل 10 ملايين خلية. الطرد المركزي الحل في 300 مرات G لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، قم بشفط supernatant بالكامل وإعادة تعليق ما يصل إلى مليار خلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل. بعد ذلك ، قم بإعداد عمود الفصل عن طريق شطفه بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للعزل. ضع تعليق الخلية على العمود المكدس بمرشحات الفصل المسبق التي تبلغ سعتها 70 ميكرومتر.
اغسل العمود بثلاثة ملليلترات من العزل المؤقت ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. ماصة خمسة ملليلترات من العزل العازلة على العمود.
لاستعادة الخلايا الموسومة بالخرز المغناطيسي ، ادفع المكبس بقوة إلى العمود لطرد الخلايا. وأخيرا، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تم تقييم نقاء LSECs المعزولة وعلامات السطح باستخدام قياس التدفق الخلوي.
يعتمد تحليل البيانات واستراتيجية البوابات ل LSECs المسورة والمفردات على بيانات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. تم تلطيخ LSECs المعزولة بصبغة قابلة للحياة ومزيج من الأجسام المضادة CD45 و CD146 و Stabilin-2. تم وضع بوابات LSECs القابلة للحياة على السكان السلبيين CD45 وتحليلها لتعبير CD146 و Stabilin-2.
من هذه البيانات ، تم التأكيد على أن LSECs المعزولة لديها قابلية أكبر من 94٪ قابلة للحياة وأكبر من 90٪ نقاء. كما تم تأكيد النمط الظاهري الخاص ب LSEC للخلايا المعزولة باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني الماسح. تم استزراع LSECs المعزولة في وسط النمو الكامل لمدة ست ساعات وفحصها بواسطة الفحص المجهري الخفيف.
تشير الأسهم البيضاء في صورة SEM إلى LSEC fenestrae ، وهي سمة مورفولوجية مميزة ل LSECs. الخطوات الحاسمة لضمان التروية الكاملة لأنسجة الكبد هي تحديد موضع شريط القسطرة المناسب ، وتجنب إدخال الهواء في القسطرة ، والتوقيت الأمثل لهضم الكولاجيناز. إن LSEC عالي الجودة الذي تم الحصول عليه باستخدام بروتوكولنا سيسهل تحديد الآلية الجزيئية لوظيفة LSEC وسيحسن فهمنا لدورها في التواصل بين الخلايا في الكبد والصحة والمرض.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة بروتوكولًا لعزلة خلايا بطانة الجيوب الكبدية الوريدية الرئيسية للفئران بكفاءة باستخدام ترشيح الكولاجيناز الكبدي واختيار الكرات المغناطيسية. تحافظ خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية المعزولة على نقاء وقابلية بقاء عالية، مما يجعلها مناسبة لمختلف الدراسات الوظيفية والجزيئية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الخلايا
- فيزيولوجيا الكبد
- وظيفة خلايا البطانة
الخلفية
- تلعب خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية دورًا حاسمًا في بيولوجيا الكبد والتواصل بين الخلايا.
- يعد عزل خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية عالية النقاء أمرًا حيويًا لدراسة وظيفة الكبد والأمراض المرتبطة به.
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لعزل خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية من الكبد الصحي والمريض للفئران.
الطرق المستخدمة
- ترشيح الكولاجيناز الكبدي متبوعًا بفصل طرد مركزي فائق منخفض السرعة.
- كبد الفأر كمنظومة بيولوجية.
- قياس التدفق الخلوي ومجهر المسح الإلكتروني لتمييز الخلايا.
النتائج الرئيسية
- ينتج البروتوكول خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية بنسبة نقاء تزيد عن 90٪ وقابلية بقاء تزيد عن 94٪.
- تحتفظ خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية المعزولة بهياكلها ووظائفها المناسبة للتحليلات اللاحقة.
- يسهل هذا الأسلوب الدراسات المتقدمة على وظيفة الكبد والتفاعلات الخلوية.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة طريقة فعالة لعزل خلايا بطانة الجيوب الكبدية الرئيسية من كبد الفأر.
- يساهم البروتوكول بشكل كبير في فهم بيولوجيا الكبد وآليات الأمراض.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-purity isolation and characterization of mouse liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) enables robust investigation of liver microenvironment mechanisms relevant to metabolic, inflammatory, and fibrotic disease models. This protocol supports predictive confidence in early discovery and target validation by providing standardized, reproducible access to primary LSECs from both healthy and disease states. The approach facilitates translational continuity for multi-omics and functional studies across the preclinical pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LSEC-specific pathways implicated in liver disease mechanisms.
- Supports biological de-risking by providing functionally validated primary endothelial cells.
- Facilitates mechanistic studies of intercellular communication within the hepatic niche.
- Improves predictive confidence for target selection in metabolic and fibrotic disease models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated source of primary LSECs for quantitative adhesion and permeability assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through high-purity cell preparations.
- Supports downstream screening workflows requiring disease-relevant endothelial systems.
- Facilitates platform reuse for multi-omics and pathway-specific analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant model systems for NAFLD and chronic liver injury studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using primary cell-based assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into LSEC function.
- Facilitates biomarker discovery and validation in translational liver research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality LSECs for hypothesis testing, pathway analysis, and multi-omics profiling.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking and pathway clarification in liver disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for functional and molecular assays.
- Analytics: Enables flow cytometry and electron microscopy-based characterization for comparative studies.
- Translational Research: Provides primary cell systems for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for LSEC isolation across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver research.
- Operational Value: Standardizes LSEC isolation for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion techniques and primary cell isolation.
- Needs access to flow cytometry, electron microscopy, and magnetic bead separation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for consistent cell purity and viability metrics.
- Adaptable to both healthy and disease model systems for broad research applicability.
- Dependent on precise perfusion and digestion timing for optimal cell yield and quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Preparation of Collagen-Coated Culture Dish or Plate
1:25
Equipment Setup
2:01
Surgical Procedure
4:50
Separation of Nonparenchymal Hepatic Cells and LSECs Purification
6:29
Results: Assessment of Purity and Morphology of Isolated LSECs
7:37
Conclusion
