عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير سلوك الخلايا داخل الأنبوب العصبي الجنيني بدقة عالية ولفترات زمنية طويلة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قطع الأنبوب العصبي المبكر باستخدام بنية جينية تحفز تعبير بروتين فلوري مختار لتمييز خلايا مفردة. وتتمثل الخطوة التالية في عمل شرائح من الجنين المبكر وتثبيتها على أطباق ذات قاع زجاجي.

بعد فترة التعافي في الحاضنة، يتم تصوير شرائح الأجنة باستخدام مجهر المجال الواسع على فترات زمنية منتظمة. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة سلوك الخلايا داخل الظهارة العصبية النامية على مدار فترات زمنية طويلة وبدقة مكانية وزمنية عالية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لتصوير الأنسجة الحية في أنها تسمح لنا بمراقبة سلوك الخلايا الفردية لفترات زمنية طويلة بدقة مكانية وزمنية عالية.

تسمح لك هذه الطريقة بمعالجة أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا العصبية التطورية، مثل دور توجيه المغزل الميتوزي في اختيار الكبريتات، أو كيف يمكن لديناميكيات الإشارات أن تنظم سلوك الخلية قبل إجراء التثقيب الكهربائي للبلازميدات في الأنبوب العصبي. يتم تحضير الإبر الزجاجية باستخدام ساحب الشعيرات الدقيقة تحت مجهر تشريحي. استخدم ملقطاً دقيقاً لكسر طرف الإبرة.

يجب أن يكون طرف الإبرة حاداً بما يكفي لاختراق الأنبوب العصبي، دون أن يكون ضيقاً لدرجة تعيق حقن محلول DNA. تم تحضين X في هذه التجربة عند 37 درجة Celsius لمدة 36 ساعة تقريباً للوصول إلى المرحلة 10 من تصنيف Hamilton.

لبدء هذا الإجراء، يتم فتح نافذة في البيضة ووضع الأقطاب الكهربائية على مسافة خمسة مليمترات من كلا جانبي الجنين، ثم يُحقن DNA في الأنبوب العصبي. يُلون DNA بكمية صغيرة من صبغة fast green لغرض التصوير. يتم تطبيق تيار يتراوح من 12 إلى 17 فولت وبطول نبضة قدره 50 millisecond ثلاث مرات، مع فاصل زمني قدره 950 milliseconds بين النبضات.

تُستخدم تركيزات منخفضة من DNA وجهود منخفضة في عملية التثقيب الكهربائي (electroporation) لتحقيق تعبير فسيفسائي بحيث يمكن تتبع الخلايا الفردية. أخيرًا، قم بتغطية الفتحة الموجودة في قشرة البيضة بشريط لاصق، مع التأكد من إغلاقها بإحكام. اترك الأجنة لتتعافى لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات أو طوال الليل عند 37 °C.

يجب تحضير خليط الكولاجين ووسط زراعة الشرائح قبل تقطيع الأجنة بنحو ساعة واحدة. لتحضير خليط الكولاجين، أضف 100 µL من محلول حمض الأسيتيك بتركيز 0.1% إلى 300 µL من كولاجين النوع الأول وقم بالمزج جيداً باستخدام جهاز Vortex، ثم أضف 100 µL من وسط L 15 بتركيز خمسة أضعاف (5×) وقم بالمزج جيداً مرة أخرى. عندها يجب أن يتحول لون المحلول إلى الأصفر.

بعد ذلك، أضف من 15 إلى 20 µL من بيكربونات الصوديوم بتركيز 7.5%، ثم قم بالرج جيداً باستخدام جهاز الفورتيكس. يجب أن يصبح لون المحلول وردياً فاتحاً. يُحفظ على الثلج.

يجب تحضير هذا المزيج من الكولاجين حديثاً في كل مرة. لتحضير وسط استزراع الشرائح، أضف 10 milliliters من وسط neuro basal medium مكملاً بـ B 27 وglut max ومحلول Gentamycin، ثم ضع الوسط في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C، وموازنة بـ 5% carbon dioxide. اترك غطاء الوعاء غير محكم الغلق للسماح للوسط بالتعادل مع carbon dioxide لمدة ساعة على الأقل.

لبدء هذا الإجراء، استخدم مقصاً صغيراً لاستئصال الجنين. أخرج الجنين من البيضة باستخدام ملقط مع الغسل بوسط L 15. ضع الجنين في طبق زراعة أنسجة يحتوي على طبقة من syl guard في القاع.

قم بتثبيت الجنين باستخدام الدبابيس عبر الأغشية المحيطة خارج الجنين بحيث تكون الأغشية مشدودة. وباستخدام سكين دقيق، قم بتقطيع الجنين بشكل مستقيم قدر الإمكان عبر المنطقة المستهدفة. بالنسبة لشرائح النخاع الشوكي، يجب أن يتراوح سمكها بين واحد إلى اثنين من القطع الجسدية (somites)، ويتم لصق الشرائح في الأنسجة الجانبية للجنين لضمان عدم فقدانها أثناء تقطيع أجنة أخرى.

يلزم استخدام طرف ماصة دقيق مخصص لنقل شرائح النخاع الشوكي إلى طبق ذي قاع زجاجي. ولتحضير ذلك، قم بتثبيت طرف سعة 200 µL بماصة P2 أو P10، ثم اقطع حوالي 1 mm من نهاية الطرف. قم بطلاء الجزء الداخلي من الطرف بالكولاجين عن طريق تحضير 1 µL من خليط الكولاجين الذي تم تحضيره مسبقاً.

اتركه لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم اشطفه باستخدام وسط L 15. سيمنع ذلك الأنسجة من الالتصاق بالجزء الداخلي من الطرف. الآن قم بفصل شريحة من الجنين باستخدام سكين مجهري وأزل الشريحة من الطبق باستخدام P two أو P 10 المزود بطرف سعة 200 microliter.

حاول سحب أقل كمية ممكنة من الوسط. قم برج مزيج الكولاجين باستخدام جهاز الـ Vortex وضع من خمسة إلى ثمانية µL منه على طبق زجاجي القاع مطلي بالـ polyol lysine مع وجود شريحة تغطية كقاعدة، ثم ضع شريحة الجنين فوراً في الكولاجين وثبتها باستخدام ملقط دقيق. يجب وضع الـ LICs بحيث يكون الجانب المراد تصويره ملاصقاً لشريحة التغطية.

يجب أن يلتصق النسيج بطبقة بولي ليزين (polyol lysine) الموجودة على الشريحة الزجاجية الغطائية. كرر هذه العملية حتى تحصل على عدة شرائح على الشريحة الغطائية. وعادةً ما يتم وضع من ست إلى تسع شرائح في الطبق الواحد.

عندما يتم وضع جميع الشرائح في مكانها، أضف من 2 إلى 3 µL من وسط L 15 إلى أول مكان وُضع فيه الكولاجين ثم غطِّ الطبق. اترك الكولاجين يتصلب لمدة 20 دقيقة. وبمجرد تصلب الكولاجين، أضف بحذر 2 mL من وسط زراعة الشرائح الذي تم موازنته لمدة ساعة على الأقل في 5% من ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة 37 °C.

يجب توخي الحذر لضمان عدم إزاحة الكولاجين من شريحة الغطاء، ثم توضع في حاضنة عند 37 درجة Celsius وبنسبة 5% carbon dioxide، وتُترك الشرائح للتعافي لمدة ثلاث ساعات على الأقل قبل التصوير. يُعد تصوير سلوك الخلايا داخل الأنسجة لفترات طويلة وبدقة زمنية ومكانية عالية أمراً صعباً؛ لذا فإن الجمع بين ظروف الزرع المثالية واستخدام مجهر الحقل المضيء (white field microscopy) أمر أساسي للحصول على نتائج جيدة.

يُستخدم مجهر Delta Vision Core ذو المجال الواسع المجهز بغرفة بيئية من نوع Weather Station لتصوير الشرائح. يتم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة باستمرار عند 37 °C مع استخدام جهاز تروية بثاني أكسيد الكربون للحفاظ على منصة المجهر عند 5% carbon dioxide و 95% Air. يتم إجراء التصوير عادةً باستخدام عدسة غمر زيتية بقوة تكبير 40 times وفتحة عددية 1.30 NA، ويتم التقاط الصور بواسطة كاميرا CCD من طراز Core Snap HQ2 المبردة. يتم التقاط المقاطع العرضية (Z Sections) كل 1.5 microns عبر 45 microns من عمق الأنسجة. يجب الحفاظ على وقت التعرض عند أدنى مستوى ممكن، على سبيل المثال، من 5 إلى 50 milliseconds.

يتم التقاط الصور لكل مقطع مذكور كل سبع دقائق. ويمكن زيارة ما يصل إلى تسعة مقاطع باستخدام أنظمة رؤية Delta. تُظهر وظيفة زيارة النقاط الدقيقة هنا مثالاً لتسلسل زمني خلوي لخلية سلفية في الحبل الشوكي تم تحويلها بتركيبة تعبر عن GFP alpha Tubulin؛ حيث بدأ التصوير على مقطع من الحبل الشوكي لجنين في المرحلة HH 12 يبلغ عمره يومين.

خلال هذه المرحلة المبكرة، تخضع الخلايا السلفية العصبية بشكل أساسي لانقسامات من نمط "سلف-سلف"، حيث تنقسم الخلايا لتوليد خليتين سلفيتين إضافيتين في دورة الانقسام. يوضح هذا الشكل إطارات مختارة من تسلسل التصوير الزمني الذي عُرض للتو. عند مرور ساعتين و20 دقيقة، تنقسم الخلية بمستوى انشطار عمودي على السطح القمي، مما يؤدي إلى تكوين خليتين ابنتين.

تنقسم هاتان الخليتان مرة أخرى عند 24 ساعة و23 دقيقة، وعند 25 ساعة و54 دقيقة. تسلسل التصوير الزمني التالي لخلية تم ترانسفكشنها بـ G-F-P-G-P-I الذي يحدد الغشاء الخلوي. تمر هذه الخلية بعملية انقسام ينقسم خلالها البروز القاعدي إلى جزئين كما تشير الأسهم البيضاء، ويتم توريثهما بالتساوي للخلايا الوليدة.

تُظهر الإطارات المختارة من تسلسل التصوير الزمني هذا أن انقسام الخلية يحدث عند الساعة صفر والدقيقة 49. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحضير وتصوير شرائح النخاع الشوكي. تذكر أنه إذا كنت مبتدئًا في هذه التقنية، فقد تواجه بعض الصعوبات في البداية نظرًا لوجود عدد من الخطوات الصعبة تقنيًا والتي يجب تنفيذها جميعًا بدقة لضمان نجاح العملية.