عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير سلوك الخلية داخل الأنبوب العصبي الجنيني بدقة عالية لفترات طويلة من الزمن. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الأنبوب العصبي المبكر أولا بتعبير يقود بناء لبروتين الفلورسنت المفضل لتمييز الخلايا المفردة. الخطوة التالية هي عمل شرائح من الجنين المبكر وتركيبها على أطباق ذات قاع زجاجي.

بعد التعافي في حاضنة ، يتم تصوير شرائح الجنين على مجهر ميداني واسع على فترات منتظمة. في النهاية ، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة سلوك الخلية داخل الظهارة العصبية النامية على مدى فترات طويلة من الزمن بدقة مكانية وزمانية عالية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لتصوير الأنسجة الحية هي أنها تسمح لنا بمراقبة سلوك الخلية الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن بدقة مكانية وزمانية عالية.

تتيح لك هذه الطريقة معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب التنموي ، مثل دور توجيه المغزل الانقسامي في اختيار الكبريتات ، أو كيف يمكن أن تنظم ديناميكيات الإشارات سلوك الخلية قبل التثقيب الكهربائي للبلازميدات في الأنبوب العصبي. يتم تحضير الإبر الزجاجية باستخدام مجتذب شعري دقيق تحت مجهر تشريح. استخدم ملقطا دقيقا لقطع طرف الإبرة.

يجب أن تكون نهاية الإبرة حادة بما يكفي لاختراق الأنبوب العصبي بينما لا تكون ضيقة جدا بحيث تعيق حقن محلول الحمض النووي. تم احتضان X لهذه التجربة عند 37 درجة مئوية لمدة 36 ساعة تقريبا إلى هامبرغر هاميلتون. المرحلة 10.

لبدء هذا الإجراء ، قم بحقن الحمض النووي في الأنبوب العصبي والبويضة ووضع الأقطاب الكهربائية على جانبي الجنين على جانبي الجنين. يتم تلوين الحمض النووي بكمية صغيرة من اللون الأخضر السريع للتصور. قم بتطبيق تيار من 12 إلى 17 فولت وطول نبضة 50 مللي ثانية ثلاث مرات مع 950 مللي ثانية بين النبضات.

يتم استخدام تركيزات منخفضة من الحمض النووي والجهد الكهربائي المنخفض لتحقيق التعبير عن الفسيفساء بحيث يمكن متابعة الخلايا الفردية. أخيرا ، قم بتغطية النافذة في قشر البيض بشريط قبو ، وتأكد من إغلاقها. اسمح للأجنة بالتعافي لمدة ثلاث إلى أربع ساعات أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

يجب تحضير خليط الكولاجين ووسط زراعة الشرائح قبل حوالي ساعة من تقطيع الأجنة. لتحضير خليط الكولاجين عند 100 ميكرولتر من محلول حمض الأسيتيك 0.1٪ إلى 300 ميكرولتر من الكولاجين والدوامة من النوع الأول جيدا ، أضف 100 ميكرولتر من خمس مرات L 15 ، متوسطة ودوامة جيدا. مرة أخرى ، يجب أن يتحول المحلول إلى اللون الأصفر.

بعد ذلك ، أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من بيكربونات الصوديوم 7.5٪ ، ودوامة جيدا. يجب أن يصبح المحلول ورديا قليلا. ابق على الجليد.

يجب تحضير مزيج الكولاجين هذا طازجا في كل مرة. لتحضير وسط زراعة الشرائح عند ما يلي إلى 10 ملليلتر من الوسط القاعدي العصبي ، ومحلول الغذاء B 27 كحد أقصى ومحلول جنتاميسين ، ضع الوسط في حاضنة 37 درجة مئوية ، مخزنة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون. اترك الجزء العلوي من الحاوية فضفاضا للسماح له بالتوازن مع ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة على الأقل.

لبدء هذا الإجراء ، استخدم مقصا صغيرا لقطع الجنين. أخرج الجنين من البيضة بغسل الملقط L 15 متوسط. ضع الجنين في طبق زراعة الأنسجة مع طبقة من واقي السيل في الأسفل.

قم بتثبيت الجنين من خلال الأغشية الجنينية الإضافية المحيطة بحيث يتم شد الأغشية مشدودة. باستخدام سكين صغير ، قم بتقطيع الجنين بشكل مستقيم قدر الإمكان عبر منطقة الاهتمام. بالنسبة لشرائح الحبل الشوكي ، يجب أن تكون بين شريحة إلى شريحتين سميكة من الجسيدات ، متصلة بالأنسجة الجانبية للجنين ، حتى لا تضيع أثناء تقطيع الأجنة الأخرى.

هناك حاجة إلى طرف صغير مخصص لنقل شرائح الحبل الشوكي إلى الطبق السفلي الزجاجي. لتحضير هذا ، قم بإرفاق طرف 200 ميكرولتر ب P اثنين أو P 10 perman واقطع ملليمترا واحدا تقريبا من نهاية الحافة. قم بترميز الجزء الداخلي من الطرف بالكولاجين عن طريق تحضير ميكرولتر واحد من مزيج الكولاجين الذي تم تحضيره مسبقا.

اتركيه لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم اشطفيه ب L 15 متوسط. سيمنع ذلك الأنسجة من الالتصاق بداخل الحافة. الآن افصل شريحة عن الجنين باستخدام سكين صغير وقم بإزالة الشريحة من الطبق باستخدام P two أو P 10 المزود بطرف 200 ميكرولتر.

حاول أن تأخذ أقل قدر ممكن من المتوسط. قم بتدوير مزيج الكولاجين وقم بإسقاط خمسة إلى ثمانية ميكرولترات منه على طبق زجاجي مطلي بالبوليول ليسين مع زلة غطاء كقاعدة ، ضع شريحة الجنين على الفور في الكولاجين وضعها بزوج من الملقط الناعم. يجب وضع LICs بحيث يكون الجانب المراد تصويره متدفقا مع زلة الغطاء.

يجب أن تلتصق الأنسجة بطلاء بوليول ليسين على زلة الغطاء. كرر هذا حتى تحصل على عدة شرائح على زلة الغطاء. عادة ما توضع ست إلى تسع شرائح في طبق واحد.

عندما تكون جميع الشرائح في مكانها ، أضف ليلترين إلى ثلاثة ميكرولتر من L 15 ، متوسط إلى أقرب مكان من الكولاجين وقم بتغطية الطبق. اترك الكولاجين يتماسك لمدة 20 دقيقة. بمجرد ضبط الكولاجين بعناية ، أضف ملليلترين من وسط زراعة الشرائح الذي تم موازنته لمدة ساعة على الأقل في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية.

يجب الحرص على عدم إخراج الكولاجين من مكان انزلاق الغطاء في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪ والسماح للشرائح بالتعافي لمدة ثلاث ساعات على الأقل قبل التصوير. يعد تصوير سلوك الخلايا داخل الأنسجة لفترات طويلة من الزمن بدقة زمنية ومكانية عالية أمرا صعبا. يعد الجمع بين ظروف الاستزراع المثلى واستخدام الفحص المجهري للحقل الأبيض أمرا ضروريا للحصول على نتائج جيدة.

يتم استخدام مجهر المجال العريض ذو قلب دلتا للرؤية المزود بغرفة بيئية لمحطة الطقس لتصوير الشرائح. يتم الحفاظ على الغرفة باستمرار عند 37 درجة مئوية مع جهاز نضح ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على مرحلة المجهر عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ يتم إجراء التصوير الجوي عادة باستخدام عدسة غمر الزيت 40 مرة 1.30 NA ويتم التقاط الصور باستخدام قلب المفاجئ HQ اثنين يسمى كاميرا CCD Z يتم التقاطها كل 1.5 ميكرون من خلال 45 ميكرون من التعرض للأنسجة. يجب أن يظل الوقت منخفضا قدر الإمكان ، على سبيل المثال ، من خمسة إلى 50 مللي ثانية.

لكل قسم مذكور يتم التقاط الصور كل سبع دقائق. يمكن زيارة ما يصل إلى تسع شرائح باستخدام أنظمة رؤية دلتا. وظيفة زيارة النقطة الدقيقة الموضحة هنا هي مثال على تسلسل الفاصل الزمني لخلية سلف من الحبل الشوكي تم نقلها ببنية تعبر عن GFP بدأ تصوير ألفا توبولين على شريحة من الحبل الشوكي من جنين المرحلة 12 من HH عمره يومين.

خلال هذه المرحلة المبكرة ، تخضع الخلايا السلفية العصبية في الغالب لأقسام وضع السلف السلفي التي تنقسم خلالها الخلايا لتوليد خليتين سلفيتين أخريين. يوضح هذا الشكل الإطارات المحددة من تسلسل الفاصل الزمني المبين للتو. في غضون ساعتين و 20 دقيقة ، تنقسم الخلية بمستوى انقسام عمودي على السطح القمي يولد خليتين ابنتيتين.

تنقسم هاتان الخليتان مرة أخرى في 24 ساعة و 23 دقيقة و 25 ساعة و 54 دقيقة. هذا التسلسل المتتابع التالي هو خلية منقولة باستخدام G-F-P-G-P-I بتمييز غشاء الخلية. تخضع هذه الخلية لانقسام تنقسم خلاله العملية القاعدية إلى قسمين يشار إليهما الأسهم البيضاء وتورثها الخلايا الوليدة بالتساوي.

تظهر الإطارات المحددة من تسلسل اللقطات المتتابعة هذا أن انقسام الخلية يحدث عند صفر ساعة و 49 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحضير شرائح الحبل الشوكي وتصويرها. تذكر ، إذا كنت جديدا على هذه التقنية ، فقد تكافح في البداية نظرا لوجود عدد من الخطوات الصعبة تقنيا التي تحتاج جميعها إلى الالتقاء معا حتى ينجح ذلك.