تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة الخلايا المنقسمة داخل الأنسجة النامية أثناء التطور الجنيني Celegance. من أجل دراسة الجينات التي تتحكم في انقسام الخلايا ، يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء أو الحصول على سلالة C elgan التي تعبر بثبات عن العلامات المعدلة وراثيا التي تصنف الخلايا ذات الأهمية. كخطوة ثانية ، قم بإسقاط جين مثير للاهتمام بشكل انتقائي عن طريق إطعام D-S-R-N-A إلى L أربع يرقات لمدة 24 إلى 48 ساعة.

يتم جمع أجنة RNAI من خنثى رسومية ونقلها إلى وسادة aros للتصوير الحي. بعد ذلك ، باستخدام الفحص المجهري الواسع أو الفحص المجهري متحد البؤر ، يتم تصوير الأجنة لتصور الأنماط الظاهرية لانقسام الخلايا. ستظهر النتائج كيف تنقسم الخلايا العصبية أثناء التطور الجنيني للجنين البحري ، ودور الجينات المطلوبة لتقسيمها.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النمو والخلية. على سبيل المثال ، يمكن أن تكشف هذه الطريقة عن الجينات والآليات التي تشارك في تنظيم الانقسام أثناء نمو الأنسجة أو اتصال الخلايا الخلوية أو هجرة الخلايا أو قطبية الخلية. استخدم الديدان المعدلة وراثيا التي تعبر عن العلامات المناسبة المحفوظة تحت السيطرة أو لوحات RNAI لمدة 24 إلى 48 ساعة.

اختر أربعة إلى ستة بالغين خطيرين وانقلهم إلى 20 إلى 30 ميكرولترا من M تسعة عازلة في شريحة اكتئاب لتحرير الأجنة ، استخدم مشرطا معقما ، وقطع الديدان على جانبي المنوية أو الفرج. بعد ذلك ، اجمع الأجنة باستخدام الشعيرات الدموية المسحوبة ، والتي يتم توصيلها بلمبة ماصة وتكون عريضة بما يكفي لتمرير الأجنة. انقل الأجنة إلى وسادة أروس معدة حديثا باستخدام رمش ملتصق بعود أسنان.

قم بإنشاء مجموعات من خمسة إلى 10 أجنة عن طريق دفع الأجنة بجانب بعضها البعض. قم بتغطية الشريحة بقلة غطاء وأضف المزيد من المخزن المؤقت M nine إذا لزم الأمر ، ثم أغلق زلة الغطاء بفالا سائل مسخن مسبقا. استخدم مجهر واسع المجال الفلوري epi الذي يتضمن مرشحات آلية.

الأهداف, كاميرا CCD عالية الدقة ومرحلة عالية المحركات. كل شيء يتم التحكم فيه باستخدام البرنامج. على الرغم من أن هذا النظام لا يستخدمها مصابيح LED و E-M-C-C-D سيحد من السمية الضوئية للجنين بتكبير منخفض.

ركز يدويا على الأجنة لتصوير الخلايا العصبية. قم بزيادة التكبير واختر الأجنة التي تخضع للترتيب البيني الظهري أو أو الإغلاق البطني مبكرا على المجهر واسع المجال. اختر مرشحات GFP و Texas الحمراء وحدد مستويات Z المثلى على نظام المجال العريض.

سيؤدي استخدام عدد أقل من Zacks وعدد أقل من النقاط الزمنية إلى تقليل السمية الضوئية أيضا إغلاق الفتحة إلى 30٪ وإذا أمكن ، فإن تقليل شدة الضوء سيقلل من السمية الضوئية. بدلا من ذلك ، استخدم مجال مسح مباشر أو مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مع برنامج يتحكم في أهداف ليزر المسح الضوئي ، وكاميرا E-M-C-C-D ، ومرحلة عالية المحركات. الآن بعد أن تم تحسين إعدادات الاستحواذ ، قم بتصوير الأجنة على مجهر المجال الواسع.

يوصى بتصوير أجنة التحكم أولا قبل أجنة RNAI. مع نظام المجال المكتسح. اضبط ليزر 4 88 و 5 61 100 مللي واط على 40٪ من الطاقة مع شق 50 ووقت تعريض ضوئي يبلغ 300 مللي ثانية.

المهم ملاحظة أن هذه الإعدادات ستكون مختلفة بالنسبة للمجاهر الأخرى. ضع الشريحة على مرحلة المجهر ، ثم استخدم هدف تكبير منخفض للعثور على الأجنة. ثم قم بالتبديل إلى هدف الغمر بالزيت 60 أو 100 ×.

بمجرد التركيز ، اجمع 20 مكدسا من Z بمعدل 0.2 ميكرون كل دقيقتين لمدة 10 دقائق. من المحتمل أن يتطلب وقت التعرض التغيير والتبديل. يجب مراعاة السمية الضوئية عند تصوير أجنة التصوير الحي عبر المجهر الفلوري لإغلاق الفتحة ، واختيار عدد أقل من Zacks أو النقاط الزمنية.

يمكن أن يؤدي تقليل وقت التعرض إلى الحد من السمية الضوئية إن أمكن. يمكن أن يساعد استخدام مجال SW أو مجهر متحد البؤر للقرص الدوار في تحسين هذه المشكلة. حدد وقتك ونقاطك وطائرات Z التي تهمك باستخدام برنامج الاستحواذ.

تصدير الصور المطلوبة كملفات متعددة. افتح مستويات Z المطلوبة لكل نقطة زمنية وقناة ذات أهمية في معالجة البرامج مثل Image J وإنشاء مكدس الخلايا العصبية غالبا ما تمتد على عدد قليل من المستويات. قم بتكديس مستويات Z لكل نقطة زمنية وقم بإنشاء إسقاطات مكدس Z.

كرر هذا للقنوات الإضافية. بمجرد اكتمال جميع إسقاطات Zack للنقاط الزمنية المطلوبة ، افتح الإسقاطات لعمل تسلسل زمني. افعل ذلك لكل قناة على حدة.

لكل قناة، قم بإجراء تعديلات على السطوع والتباين حسب الحاجة. قم بتدوير الصور إذا لزم الأمر. ثم حدد منطقة الاهتمام واقتصاص الصور.

الآن قم بعمل صورة مدمجة باستخدام وظيفة القنوات المدمجة. تحديد لون مختلف لكل قناة. احفظ الصورة المدمجة كملف RGB لتصور الصور بشكل أكثر وضوحا.

استخدم صور TIFF 16 بت وحدد وظيفة العكس ضمن التحرير لإنشاء صور ذات حجم رمادي لكل قناة. لتحديد حجم كائن يهم الميكرونات ، ارسم خطا واضرب طوله في حجم وحدات البكسل ، والذي تحدده معلمات التصوير. الآن ، قم بعمل شريط مقياس يمثل نسبة من الطول المحسوب بالميكرون.

في النهاية ، احفظ الصور النهائية كثماني بتات متداخلة. إذا رغبت في ذلك ، قم بتحويل الأخطاء إلى أفلام باستخدام الصورة J للبشرة. يحدث تكوين شكلي أناقة C بسبب مزيج من تغيرات شكل خلايا البشرة والهجرة والالتصاق بمساعدة الخلايا العصبية التكاثرية الأساسية.

تهاجر خلايا البشرة إلى خط الوسط البطني وتشكل طبقة واحدة من الخلايا لدراسة أجنة انقسام الخلايا العصبية ، وتم تصوير علامة معبر الأكسيد بثبات وعلامة خاصة بالخلايا العصبية الموسومة ب GFP وعلامة غشاء مدفوعة بالأم الموسومة ب m cherry أثناء العلبة البطنية عند زيادة التكبير. تم تصور الخلايا العصبية وهي تخضع لانقسام نوى الخلايا العصبية تظهر باللون الأخضر وتظهر الأغشية المحيطة باللون الأحمر بفاصل زمني للخلايا العصبية المنقسمة الموضحة باستخدام مسبار غشاء mCherry في جنين التحكم باستخدام مجهر مجال واسع لتصور الخلايا العصبية المنقسمة بشكل أفضل في الأجنة الضابطة. تم الاحتفاظ بكل قناة بمقياس رمادي وتم عكس الصور باستخدام أجنة التحكم في الفحص المجهري متحد البؤر في المجال المكتسح.

تصوير Coex الذي يعبر عن لحم الخنزير GFP واحد ودرجة الحموضة الكرز M في منطقة بها انقسام الخلايا العصبية. تم تصور نفس الأجنة التي عولجت ب RNAI لإسقاط التعبير السيئ باستخدام الفحص المجهري واسع المجال. على عكس أجنة التحكم ، توقفت العديد من الخلايا العصبية أو تراجعت أثناء الانقسام وأصبحت متعددة النوى باستخدام الفحص المجهري الميداني المكتسح.

كان من الواضح أيضا أن العديد من الخلايا العصبية توقفت أو تراجعت أثناء الانقسام وأصبحت متعددة النوى. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتصوير الخلايا المهاجرة أثناء تكوين الأنسجة. أيضا ، إذا تم استخدام Zacks للسماح بتصوير أسرع ، فيمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول ديناميكيات الخلايا تحت الخلوية.

علاوة على ذلك ، مع المعدات المناسبة ، يمكن استخدام هذه التقنية لتنشيط المجسات القابلة لضبط الصور لأداء البصريات الوراثية. أيضا ، يمكن تطبيق تقنيات الفحص المجهري مثل الحنق أو الحنق لدراسة البروتين أو تفاعلات البروتين أو ديناميكيات البروتين.