Name: تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T18:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: استكشف تصوير انقسام الخلايا العصبية في أجنة Caenorhabditis elegans باستخدام المجهر الضوئي الحي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة آليات الانقسام السيتوبلازمي والجينات المسؤولة عنه.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن نعترف بأن هذا العمل كان مدعوما من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) منحة.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worming+secrets+from+the+C.+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Worming secrets from the C. elegans genome.</a> Science. 282, 1972-1974 (1998).</li>
<li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rde-1+gene%2C+RNA+interference%2C+and+transposon+silencing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99, 123-132 (1999).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChisholm%2C+AD+%22Epidermal+morphogenesis.+WormBook.+The+C.+elegans+Research+Community%22">Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community</a>. , 1-22 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+morphogenesis%3A+how+multiple+cells+cooperate+to+generate+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).</li>
<li>Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+the+power+of+the+purse+string%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing: the power of the purse string.</a> Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).</li>
<li>Ikegami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+and+Eph+receptor+signaling+guide+a+series+of+cell+movements+for+ventral+enclosure+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans.</a> Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ephrin+VAB-2%2FEFN-1+functions+in+neuronal+signaling+to+regulate+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).</li>
<li>Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Ephrins+Control+Cell+Organization+in+C.+elegans+Using+Kinase-Dependent+and+-Independent+Functions+of+the+VAB-1+Eph%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph.</a> Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+divergent+C.+elegans+ephrin+EFN-4+functions+in+embryonic+morphogenesis+in+a+pathway+independent+of+the+VAB-1+Eph+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor.</a> Development. 129, 5499-5510 (2002).</li>
<li>Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VAB-1+Eph+receptor+tyrosine+kinase+and+SAX-3%2FRobo+neuronal+receptors+function+together+during+C.+elegans+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Development. 132, 3679-3690 (2005).</li>
<li>Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-40%2FDCC%2C+SAX-3%2FRobo%2C+and+VAB-1%2FEph+polarize+F-actin+during+embryonic+morphogenesis+by+regulating+the+WAVE%2FSCAR+actin+nucleation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex.</a> PLoS Genet. 8, (2012).</li>
<li>Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis%3A+welcome+to+the+Rho+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis: welcome to the Rho zone.</a> Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).</li>
<li>Piekny, A. J., Maddox, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myriad+roles+of+Anillin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The myriad roles of Anillin during cytokinesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).</li>
<li>Zhao, W. M., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+substrate+of+anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+%28APC%2FC%29+that+controls+spatial+contractility+of+myosin+during+late+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis.</a> J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).</li>
<li>Piekny, A. J., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+scaffold+protein+that+links+RhoA%2C+actin+and+myosin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis.</a> Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).</li>
<li>Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+control+of+anillin+behavior+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22Immunohistochemistry.+WormBook%2C+The+C.+elegans+Research+Community%22">Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community</a>. , 1-61 (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+two+C.+elegans+anillins+in+the+gonad+and+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo.</a> Development. 132, 2837-2848 (2005).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+of+the+worm%3A+genetics+of+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> Trends Genet. 16, 544-551 (2000).</li>
<li>Zhang, H., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+mechanical+inputs+%E2%80%93+a+coordinated+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling through mechanical inputs – a coordinated process.</a> J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).</li>
<li>Guenther, C., Garriga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+the+C.+elegans+HAM-1+protein+in+neuroblasts+enables+daughter+cells+to+adopt+distinct+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates.</a> Development. 122, 3509-3518 (1996).</li>
<li>Audhya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+the+Sm+protein+CAR-1+and+the+RNA+helicase+CGH-1+is+required+for+embryonic+cytokinesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans.</a> J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+and+the+septins+promote+asymmetric+ingression+of+the+cytokinetic+furrow%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow.</a> Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).</li>
<li>Dorn, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tube+formation+in+polar+body+cytokinesis+requires+Anillin+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans.</a> Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).</li>
<li>Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول استخدام أنواع مختلفة من المجهري إلى انقسامات الخلية صورة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. على وجه الخصوص، وهذا يسلط الضوء على البروتوكول كيفية تقسيم الصورة neuroblasts، الخلايا التي قد تسهل البشرة التشكل. الاتصالات خلية خلية المهم لتشكيل الأنسجة أثناء تطوير metazoan وC. ايليجانس هو نموذج ممتاز لدراسة تشكيل الأنسجة في الجسم الحي. حدث واحد أن يصور بشكل رائع تفاعل أنسجة البشرة هو التشكل، والتي تغطي الجنين في طبقة من الخلايا الظهارية. على وجه الخصو...

في حين أن هناك بروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلية الصورة في أوائل C. ايليجانس الجنين، ويصف هذا البروتوكول كيفية انقسام الخلية صورة داخل الأنسجة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. كان واحدا من التحديات الرئيسية في التصوير الحية خلال تطوير حساسيتها للالضيائية. ومع ذلك، فقد سمحت زيادة إمكانية الوصول إلى الغزل المجاهر القرص أو متحد البؤر المجهر حقل اجتاحت تطبيقات التصوير أكثر انتشارا. كلا النظامين استخدام الليزر في الحالة الصلبة والضوء المتناثرة، مما يحد من مستويات الأشعة فوق البنفسجية التي يتعرض لها الكائنات الحية ل. ومع ذلك، وتقف widefield ما زال بالإمكان استخدام للتصوير في الجسم الحي، وخاصة إذا تم تجهيزه أنهم مع الكاميرات مع حساسية عالية (على سبيل المثال EMCCD)، والتحكم في الفتحة والتحكم في الإضاءة (مثل المصابيح أو مصابيح الزئبق قابل للتعديل). يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إما نظام متحد البؤر مقرها أو نظام widefield لانقسام الخلايا الصورة داخل النامية C. ايليجانس &lt;م /&gt; الأجنة. كمثال على ذلك، ونحن تصف كيفية صورة انقسام الخلية أرومة عصبية. Neuroblasts قد تسهل البشرة التشكل من خلال توفير الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية للخلايا البشرة المغطي، وتوفر مثالا ممتازا على أهمية التواصل بين الخلايا في تشكيل الأنسجة. انواع معينة ايليجانس هو كائن النموذج المثالي للدراسات المجهر مقرها نظرا لشفافيته وتنظيم الأنسجة بسيطة 1. وعلاوة على ذلك، C. ايليجانس هو قابل للطرق وراثية ورني، ولأن العديد من جيناته ديك المتماثلات الإنسان، فإنه يمكن استخدامها لتحديد آليات الحفظ لتكوين الأنسجة 2-5. في C. ايليجانس، تشكيل البشرة يحدث خلال مرحلة التطور الجنيني منتصف، حين يكون الجنين لديه&gt; 300 الخلايا. تتكون البشرة التشكل من عدة مراحل رئيسية، حيث يتم وضع الجنين في طبقة من خلايا البشرة التي تؤدي إلى انقباض وتمدد إلى تحويل EMBRيو من نموذج بيضوي الشكل في شكل ممدود من دودة 6. يصف الضميمة بطني واحد من هذه الأحداث التخلق، عندما تهاجر خلايا البشرة بطني نحو خط الوسط بطني لتغطية السطح البطني للجنين (الشكل 1). الأولى، اثنين من أزواج من الخلايا الأمامية تقع حافة الرائدة تهاجر نحو خط الوسط بطني، حيث تلتزم والصمامات مع الجيران المقابل لها 6. ويعقب ذلك من خلال هجرة الخلفي تقع خلايا جيب، والتي تشكل إسفين مثل الأشكال خلق جيب بطني 6-7. ليست مفهومة جيدا الآلية التي يغلق الجيب. واحد الاحتمالات هو أن هيكل الأكتين الميوسين مقلص supracellular تربط الخلايا معا في جيب سلسلة محفظة مثل الأزياء، على غرار التئام الجروح 8. ومن المثير للاهتمام، يتم بوساطة هجرة بعض الخلايا جيب من قبل مجموعات فرعية معينة من neuroblasts الكامنة 9 (السلائف الخلايا العصبية التي توجد تحت epidermiق؛ الشكل 1B). وأظهرت دراسات سابقة أن neuroblasts تنظيم الهجرة الخلية البشرة بطني والعلبة بطني. يتم التعبير عن VAB-1 (Ephrin مستقبلات) وVAB-2 (Ephrin يجند) غاية في neuroblasts وتسهيل فرز الأمامي والخلفي neuroblasts عن بعضها البعض، و الطفرات في VAB-1-2 أو VAB قضية الضميمة بطني الظواهر 10-13. ومع ذلك، أظهرت التجارب الانقاذ المروج ما هو مطلوب أيضا VAB-1 في خلايا البشرة المغطي بطني ومستقبلات للالعظة التوجيه الأخرى التي يفرزها neuroblasts يتم التعبير عنها في خلايا البشرة بطني 9. على الرغم من الطفرات في أي من هذه المستقبلات يسبب الظواهر الضميمة بطني، فإنه ليس من الواضح ما إذا كانت العيوب تنشأ بسبب مشاكل في أرومة عصبية لتحديد المواقع أو بسبب فشل خلايا البشرة بطني للرد على توجيهات جديلة 14. تغيير تقسيم neuroblasts وايthout تؤثر على قدرتهم على إفراز العظة التوجيه يمكن أن تسلط الضوء على دور neuroblasts وقدرتها على توفير المدخلات الميكانيكية خلال البشرة التشكل. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن الجين انقسام الخلايا، العاني-1 (anillin) ويعبر عن درجة عالية في neuroblasts (الشكل 2A) واستنزافها يسبب تشوهات الانقسام أرومة عصبية. ومن المثير للاهتمام، وعرض هذه الأجنة الظواهر الضميمة بطني (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة). مطلوب Anillin لانقسام الخلايا، وخاصة بالنسبة الانقسام السيتوبلازمي، الذي يصف عملية حيث يقسم الخلية الأم إلى خليتين جسديا ابنة. هو الدافع وراء الانقسام السيتوبلازمي قبل تشكيل عصابة مقلص أكتوميوزين، الذي يحتاج الى رقابة مشددة في المكان والزمان لضمان أن يقترن بشكل صحيح مع الكروموتيد العزل. المنظم سيد الانقسام السيتوبلازمي metazoan هو RhoA (RHO-1 في C. ايليجانس)، وGTPase الصغيرة التي هيالتفاعلية الذي نظمه في شكل محدد GTP لها. مرفق البيئة العالمية Ect2/ECT-2 ينشط RhoA، وبعد ذلك يتفاعل RhoA-GTP مع المستجيبات المصب التي تشكل حلقة مقلص والتوسط في ingression 15. Anillin هو بروتين المجال متعددة التي تربط لRhoA عبر لمحطة سي والأكتين والميوسين لها عبر N-محطة. مطلوب Anillin لتحقيق الاستقرار في الموقف من الحلبة مقلص في خلايا الثدييات أو ذبابة الفاكهة S2 16. استنزاف Anillin يسبب حلقات مقلص للخضوع التذبذبات الجانبية، والانقسام السيتوبلازمي في نهاية المطاف فشل تشكيل خلايا متعدد النوى 17-19. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من C. ايليجانس العاني-1 إحداثيات أكتوميوزين انقباض في الجنين في وقت مبكر، فإنه ليس من الضروري لالحرائك الخلوية. ومع ذلك، كما هو موضح أعلاه، مطلوب العاني-1 لأرومة عصبية الانقسام السيتوبلازمي خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة). ان الفشل الانقسام السيتوبلازمي تغيير عدد وموقف neuroblasts ويمكن أن تؤثر على الموضعأوجه من العظة التوجيه الكيميائية، أو أنها يمكن أن يغير من الخواص الميكانيكية للأنسجة. تسليط الضوء على دور كلا النموذجين nonautonomous من neuroblasts لالضميمة بطني، وأهمية التواصل الأنسجة الأنسجة أثناء التطور الجنيني. يصف هذا البروتوكول التجريبي كيفية انقسام الخلية خلال الصورة C. ايليجانس منتصف مرحلة التطور الجنيني باستخدام المجهر مضان. وقد أجريت غالبية التجارب دراسة آليات انقسام الخلايا في الخلايا واحد داخل أطباق الثقافة (على سبيل المثال. هيلا أو خلايا S2) أو في الأجنة في وقت مبكر مع عدد محدود من الخلايا (على سبيل المثال جيم ايليجانس الجنين خلية واحدة، القيطم، أو شوكي الأجنة). ومع ذلك، فمن المهم دراسة أيضا انقسام الخلايا داخل الأنسجة، كما أن هناك منبهات الخارجية التي يمكن أن تؤثر على توقيت ووضع الطائرة الانقسام. علاوة على ذلك، يمكن أن توفر الخلايا الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية للتأثير على نمو أنسجة المجاورةق، وأنه من المهم أن نفهم كيف تساعد على التواصل بين الخلايا الأنسجة لتشكيل خلال التنمية.

<table><tbody><tr><td>شركة أجار</td><td>بيو شوب كندا</td><td>#AGR001.1</td><td>لصنع لوحات C. elegans NGM و RNAi</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio Basic Inc.</td><td># 9002-18-0</td><td>لصنع لوحات البكتيريا LB أجار</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة للفأر Alexa Fluor 488</td> Life <td>Technologies Corporation (Invitrogen)</td> <td>#A11029</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة المضادة للفأر المضادة ل GFP</td><td>Roche Applied Science</td> <td># 11814460001</td><td></td></tr><tr><td>المضادة للأرانب Alexa Fluor 568 Antibody</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td> <td>#A11011</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AMP201.5</td><td>يخزن المسحوق عند 4 درجات ؛ C والأمبيسلين المذاب عند -20 درجة ؛ ج</td></tr><tr><td>باكتوبيتون&nbsp; (البيبتون أ)</td><td>شركة بيو بيسك</td><td>#G213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2 (كلوريد الكالسيوم) BioShop</td> <td>Canada Inc.</td><td>#C302.1</td><td></td></tr><tr><td>شركة الكوليسترول</td><td>بيوشوب كندا</td><td>#CHL380.25</td><td>يذوب في الإيثانول</td></tr><tr><td>DAPI &nbsp ؛</td><td>سيجما ألدريتش</td> <td>#D9542</td><td>استخدم لتلطيخ الأحماض النووية (DNA)</td></tr> <tr><td>Glycerol</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropylthio-&beta;-galactoside)Bio</td> <td>Basic Inc.</td><td># 367-93-1</td><td>تخزين المسحوق و IPTG المذاب عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>KH2PO4 (فوسفات البوتاسيوم، أحادي القاعدة)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPM666.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (فوسفات البوتاسيوم، ثنائي الأساسي)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPD303.1</td><td></td></tr><tr><td>L4440&nbsp; (ناقل التغذية)</td><td>Addgene</td> <td># 1654</td><td>احتفظ بمخزون الجلسرين عند -80 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; &nbsp; (كبريتات المغنيسيوم)</td><td>شركة BioShop Canada Inc.</td><td>#MAG511.500</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)</td><td>شركة Bio Basic Inc.</td><td># 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Na 2HPO4 (فوسفات الصوديوم ، ثنائي الأساسي) شركة</td> <td>Bio Basic Inc.</td><td># 7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>مصل الحمار العادي (NDS)</td><td>Wisent Bioproducts</td> <td># 035-110</td><td></td></tr><tr><td>n-Propyl-3،4،5-trihydroxybenzoate (بروبيل غالات) Alfa</td> <td>Aesar</td> <td>#A10877</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8920</td><td>للحصول على أفضل النتائج ، قم بتغطية شرائح المجهر ثلاث مرات &nbsp ؛</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#STP101.50</td><td>تخزين المسحوق عند 4 درجات ؛ C والستربتومايسين المذاب عند -20 درجة ؛ سي</td></tr><tr><td>تتراسيكلين</td><td>بيوشوب كندا</td><td>#TET701.10</td><td>تخزين المسحوق عند 4 درجات ؛ C والتتراسيكلين المذاب عند -20 درجة ؛ سي</td></tr><tr><td>توين -20</td><td>بيو بيسك إنك.</td><td>CAS # 9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#TRP402.500</td><td></td></tr><tr><td>مستخلص الخميرة</td><td>Bio Basic Inc.</td><td># 8013-01-2</td><td></td></tr></tbody></table>

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; c. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

يصف هذا البروتوكول استخدام مضان المجهري لصورة تقسيم الخلايا داخل تطوير انواع معينة ايليجانس الأجنة. على وجه الخصوص، يركز هذا البروتوكول على كيفية تقسيم الصورة neuroblasts، والتي توجد تحت خلايا البشرة وربما يكون من المهم للالبشرة التشكل. تشكيل الأنسجة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التنمية metazoan وتعتمد على الإشارات الخارجية من الأنسجة المجاورة. C. ايليجانس هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة التشكل الأنسجة في الجسم الحي بسبب شفافيته وتنظيم بسيط، مما يجعل من السهل الأنسجة لدراسة عبر المجهر. الضميمة بطني هو عملية حيث يتم تغطية السطح البطني للجنين من قبل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية. ويعتقد أن هذا الحدث إلى أن تيسره neuroblasts الكامنة، والتي توفر التوجيه العظة الكيميائية للتوسط هجرة الخلايا الظهارية الفوقية. ومع ذلك، فإن neuroblasts هي التكاثري للغاية وأيضا قد تعملباعتبارها الركيزة الميكانيكية للخلايا البشرة بطني. الدراسات التجريبية باستخدام هذا البروتوكول يمكن الكشف عن أهمية التواصل بين الخلايا أثناء تكوين الأنسجة، ويمكن استخدامها للكشف عن أدوار الجينات المسؤولة عن انقسام الخلايا في الأنسجة النامية.

يصف هذا البروتوكول التجريبي كيفية انقسام الخلايا في صورة C. ايليجانس الأجنة خلال مرحلة التطور الجنيني منتصف. على وجه الخصوص، فهو يصف كيفية neuroblasts الصورة، التي قد تسهل البشرة التشكل. البشرة التشكل يحدث نتيجة لمزيج من التغييرات شكل الخلية البشرة، والهجرة والالتصاق، ولكن أيضا تعتمد على الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية من neuroblasts الكامنة (الشكل 1B). وneuroblasts تفرز العظة التوجيه التي يتم تلقيها من قبل المستقبلات على سطح خلايا البشرة بطني، الذي ين...

يصف هذا البروتوكول كيفية تقسيم الصورة الخلايا داخل الأنسجة في انواع معينة ايليجانس الأجنة. بينما العديد من البروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلايا في صورة الجنين في وقت مبكر، ويصف هذا البروتوكول كيفية صورة انقسام الخلايا داخل الأنسجة النامية خلال منتصف أواخر مرحلة التطور الجنيني.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة الخلايا المنقسمة داخل نسيج نامٍ أثناء التخلق الجنيني لـ C elegance. ومن أجل دراسة الجينات التي تتحكم في انقسام الخلايا، يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء أو الحصول على سلالة C elgan تعبر بشكل مستقر عن علامات ترانسجينية تصبغ الخلايا المستهدفة. وكخطوة ثانية، يتم تثبيط جين معين بشكل انتقائي عن طريق إطعام D-S-R-N-A ليرقات L four لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة.يتم جمع أجنة RNAI من الخناث الرسومية ونقلها إلى وسادة aros للتصوير الحي. بعد ذلك، وباستخدام المجهر ذو المجال الواسع أو المجهر البؤري، يتم تصوير الأجنة لمعاينة أنماط انقسام الخلايا. ستوضح النتائج كيفية انقسام الخلايا العصبية الأولية أثناء التكون الجنيني لـ sea elgin، ودور الجينات المطلوبة لانقسامها.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا التطور والخلية. على سبيل المثال، يمكن لهذه الطريقة أن تكشف عن الجينات والآليات المشاركة في تنظيم الانقسام الفتيل خلال تطور الأنسجة، أو التواصل الخلوي، أو هجرة الخلايا، أو القطبية الخلوية. استخدم ديدان معدلة وراثياً تعبر عن العلامات المناسبة، مع الاحتفاظ بها في أطباق تحكم أو أطباق RNAI لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة.اختر من أربعة إلى ستة من البالغين الحوامل وانقلهم إلى 20 إلى 30 µL من محلول M9 المنظم في شريحة ذات تجويف. ولتحرير الأجنة، استخدم مشرطاً معقماً لقطع الديدان على كلا الجانبين من السبييرماثيكا (المستودع المنوي) أو الفرج. بعد ذلك، اجمع الأجنة باستخدام أنبوب شعري مسحوب، يكون متصلاً ببصيلة ماصة وواسعاً بما يكفي لمرور الأجنة. انقل الأجنة إلى وسادة agar freshly prepared باستخدام رمش عين ملصق بعود أسنان.قم بتكوين مجموعات تتكون من 5 إلى 10 أجنة عن طريق دفع الأجنة لتكون متجاورة. غطِّ الشريحة بغطاء الشريحة وأضف المزيد من M nine buffer إذا لزم الأمر، ثم أحكم إغلاق غطاء الشريحة باستخدام liquid valla المسخن مسبقاً. استخدم مجهر epi fluorescent wide field يتضمن مرشحات مؤتمتة.الأهداف، وكاميرا CCD عالية الدقة، ومنصة آلية للغاية. يتم التحكم في جميع هذه المكونات بواسطة برنامج تشغيل. وعلى الرغم من أن هذا النظام لا يحتوي عليها، فإن استخدام مصابيح LEDs وكاميرا E-M-C-C-D سيقلل من السمية الضوئية للجنين عند استخدام تكبير منخفض.قم بضبط التركيز يدوياً على الأجنة لتصوير الخلايا العصبية الأولية (neuroblast). زد قوة التكبير واختر الأجنة التي تمر بمرحلة الالتصاق الظهري (dorsal inter collation) أو الإغلاق البطني المبكر باستخدام المجهر ذو المجال الواسع (widefield microscope). اختر مرشحات GFP و Texas red وحدد مستويات Z المثلى على نظام المجهر ذو المجال الواسع.سيؤدي استخدام عدد أقل من الـ Z-stacks ونقاط زمنية أقل إلى تقليل السمية الضوئية، كما أن إغلاق الفتحة إلى 30%، وتقليل شدة الضوء إن أمكن، سيقلل من السمية الضوئية بشكل أكبر. وكبديل لذلك، يمكن استخدام مجهر confocal ذو مجال مسح أو قرص دوار للمسح الحي، مع برنامج للتحكم في أهداف ليزر المسح، وكاميرا E-M-C-C-D، ومنصة آلية للغاية. والآن بعد تحسين إعدادات الاستحواذ، قم بتصوير الأجنة باستخدام مجهر المجال الواسع.يُوصى بتصوير الأجنة الضابطة أولاً قبل أجنة RNAI. وباستخدام نظام المسح الميداني (swept field system)، يتم ضبط ليزرات 4 88 و 5 61 بقدرة 100 milliwatt على نسبة 40% من القوة، مع فتحة شق (slit) بمقدار 50 وزمن تعريض قدره 300 milliseconds.من المهم ملاحظة أن هذه الإعدادات ستختلف بالنسبة للمجاهر الأخرى. ضع الشريحة على منصة المجهر، ثم استخدم عدسة شيئية ذات تكبير منخفض للعثور على الأجنة. بعد ذلك، انتقل إلى العدسة الشيئية الغاطسة في الزيت بقوة 60 أو 100 x.بمجرد ضبط التركيز، قم بجمع 20 مجموعة من الصور المتتابعة (Z stacks) بدقة 0.2 ميكرون كل دقيقتين لمدة إجمالية تصل إلى 10 دقائق. ومن المرجح أن يتطلب وقت التعريض بعض الضبط. يجب مراعاة السمية الضوئية عند تصوير الأجنة الحية عبر المجهر الفلوري عن طريق إغلاق الفتحة، أو اختيار عدد أقل من مجموعات Z stacks أو نقاط زمنية أقل.يمكن لتقليل وقت التعرض أن يحد من السمية الضوئية إن أمكن ذلك. كما يمكن أن يساعد استخدام مجال SW أو مجهر بؤري قرصي دوار (spinning disc confocal microscope) في تحسين هذه المشكلة. حدد الوقت والنقاط ومستويات Z المطلوبة باستخدام برنامج الحصول على الصور.قم بتصدير الصور المطلوبة كعدة ملفات بتنسيق tiffs. افتح المستويات Z المطلوبة لكل نقطة زمنية والقناة ذات الصلة في برنامج معالجة مثل Image J وقم بإنشاء مكدس (stack)؛ حيثما أن الخلايا العصبية الأرومية (neuroblast) غالباً ما تمتد عبر مستويات قليلة فقط. قم بتكديس مستويات Z لكل نقطة زمنية وأنشئ مساقط لمكدس Z (Z stack projections).كرر هذه العملية للقنوات الإضافية. وبمجرد الانتهاء من جميع مساقط Zack للنقاط الزمنية المطلوبة، افتح المساقط لإنشاء تسلسل زمني. قم بذلك لكل قناة على حدة.قم بإجراء التعديلات اللازمة على السطوع والتباين لكل قناة. قم بتدوير الصور إذا لزم الأمر، ثم اختر المنطقة المراد دراستها (region of interest) وقم بقص الصور.قم الآن بإنشاء صورة مدمجة باستخدام وظيفة دمج القنوات (merged channels)، مع اختيار لون مختلف لكل قناة. احفظ الصورة المدمجة كملف RGB لتصور الصور بشكل أكثر وضوحاً.استخدم صور TIFF بدقة 16 بت واختر وظيفة العكس (invert) الموجودة تحت قائمة تحرير (edit) لإنشاء صور بتدرج رمادي لكل قناة. ولتحديد حجم الجسم المراد دراسته بالميكرونات، ارسم خطاً ثم اضرب طوله في حجم البكسلات، والذي يتم تحديده بناءً على معاملات التصوير. والآن، قم بإنشاء شريط مقياس يمثل نسبة من الطول المحسوب بالميكرونات.في النهاية، احفظ الصور النهائية بتنسيق tiffs ثمانية البتات. وإذا رغبت في ذلك، قم بتحويل ملفات tiffs إلى مقاطع فيديو باستخدام image J. يحدث التشكيل المورفولوجي للبشرة في C elegance نتيجة لمزيج من التغيرات في شكل الخلايا البشرية، والهجرة والالتصاق بمساعدة الخلايا العصبية البدائية التكاثرية الموجودة تحتها.تهاجر الخلايا البشرية إلى الخط المتوسط البطني وتُشكل طبقة واحدة من الخلايا؛ ولدراسة انقسام الخلايا العصبية في الأجنة، تم تصوير أجنة تعبر بشكل مستقر عن واسمة محددة للخلايا العصبية مرتبطة بـ GFP وواسمة غشائية مدفوعة بأم مرتبطة بـ m cherry خلال الإغلاق البطني بتكبير عالٍ. تم رصد الخلايا العصبية وهي تمر بعملية الانقسام، حيث تظهر نويات الخلايا العصبية باللون الأخضر والأغشية المحيطة باللون الأحمر. تم التقاط صور زمنية متتابعة لخلايا عصبية تنقسم ومحددة بمسبار الغشاء mCherry في جنين تحكمي باستخدام مجهر المجال الواسع لتحسين رؤية الخلايا العصبية المنقسمة في أجنة التحكم. تم الإبقاء على كل قناة بالتدرج الرمادي وعكست الصور باستخدام مجهر كونفوكال ذو المجال الممسوح لأجنة التحكم.تم تصوير Coex التي تعبر عن ham-GFP و M-cherry-pH في منطقة تحتوي على أرومة عصبية منقسمة. كما تم تصوير الأجنة ذاتها التي عولجت بـ RNAI لخفض تعبير ill باستخدام مجهر المجال الواسع. وعلى عكس الأجنة الضابطة، توقفت العديد من الأرومات العصبية عن الانقسام أو تراجعت أثناؤه وأصبحت متعددة النوى عند الفحص باستخدام مجهر المجال الممسوح.كما اتضح أيضاً أن العديد من الخلايا العصبية البدائية قد تعثرت أو تراجعت أثناء الانقسام وأصبحت متعددة النوى. ويمكن استخدام هذه التقنية أيضاً لتصوير الخلايا المهاجرة أثناء تكوين الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، إذا استُخدمت الـ Zacks للسماح بتصوير أسرع، فيمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول الديناميكيات تحت الخلوية.علاوة على ذلك، وباستخدام المعدات المناسبة، يمكن استخدام هذه التقنية لتنشيط المجسات القابلة للضبط ضوئياً لإجراء علم البصريات الوراثي (optogenetics). كما يمكن تطبيق تقنيات المجهر مثل FRET أو FRET لدراسة البروتينات، أو التفاعلات البروتينية-البروتينية، أو ديناميكيات البروتين.

visualizing-neuroblast-cytokinesis-during-c-elegans-embryogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

نحن تصف الإجراء الذي قام...

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في...

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

المصدر: Williams, A. L., et al. تصوير الفوتون متعدد الفوتون لتصور التطور في الوقت الفعلي: تصور خلايا القمة العصبية المهاجرة في أجنة أسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2017)}يعرض هذا الفيديو بروتوكول تصوير بفاصل زمني متعدد الفوتون لتصور هجرة خلايا القمة العصبية في جنين الزرد في الوقت الفعلي بدقة عالية.

تصور هجرة خلايا القمة العصبية في جنين الزرد باستخدام التصوير بفاصل زمني متعدد الفوتون

المصدر:  Jeong، S. تصور نمط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة . J. Vis. Exp. (2017)يوضح هذا الفيديو تصور الإسقاطات المحورية في ذبابة الفاكهة  الأجنة. يكشف وضع العلامات المناعية للخلايا العصبية الحركية ، والتشريح الدقيق لفضح الهياكل العصبية ، والفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي بشكل جماعي عن بنية عصبية مفصلة ، مع التركيز على أنماط الإسقاط المحوري.

تصور أنماط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة

العصبية السلف الانقسام هو معلمة الحرجة من تكوين الخلايا العصبية. ويستند جزء كبير من فهمنا لالعصبية السلف الانقسام على تحليل الأنسجة الثابتة. تصوير حي في شرائح المخ الجنينية هي تقنية متعددة لتقييم الانقسام مع القرار الزماني والمكاني عالية في بيئة تسيطر عليها.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

هنا يتم توضيح كيفية تتبع وقياس العمليات التنموية في C. ايليجانس. تعتمد الطرق المقدمة على أدوات مفتوحة المصدر يمكن تنفيذها بسهولة. يتم توضيح كيفية إعادة بناء نماذج شكل خلية ثلاثية الأبعاد ، وكيفية تتبع الهياكل الخلوية يدويا ، وكيفية تحليل التدفق المقلص القشري.

تتبع وقياس العمليات التنموية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أدوات المصدر المفتوح

هذا العمل تفاصيل طريقة المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . إعداد فيليه من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لمحور محور عصبي باثفيندينغ والاعتراف الهدف خلال التنمية العصبية.

التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

هنا ، نقدم نهج التوافقية باستخدام المجهر عاليه الدقة ، والاداات الحسابية ، ووضع العلامات خليه واحده في الاجنه c. ايليجنس المعيشة لفهم ديناميات خليه واحده اثناء النمو العصبي.

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

هنا ، نقدم بروتوكولات وأدوات لتصور الكالسيوم أثناء الإخصاب والتطور الجنيني المبكر باستخدام مراسل الكالسيوم المشفر وراثيا المعبر عنه في السلالة الجرثومية لنموذج الديدان الخيطية C. ايليجانس.

في الجسم الحي التصور العابرين للكالسيوم أثناء الإخصاب والتطور المبكر في C. ايليجانس

استكشف تصوير انقسام الخلايا العصبية في أجنة Caenorhabditis elegans باستخدام المجهر الضوئي الحي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة آليات الانقسام السيتوبلازمي والجينات المسؤولة عنه.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي

استكشف المزيد من الفيديوهات