تفاعل البلمرة سلسلة: البروتوكول الأساسي زائد استراتيجيات حل المشكلات والتحسين

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الخطوات المتبعة في تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والذي يستخدم لإنتاج إمدادات وافرة من جزء معين من الحمض النووي من كمية صغيرة من المواد الأولية. أولا ، قم بتجميع الكواشف والمواد التي سيتم استخدامها في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم قم بإعداد خليط التفاعل ، بما في ذلك الريبونوكليوتيدات الأربعة ديوكسي ، وقالب الحمض النووي ، والبادئات ، وبوليميراز الحمض النووي. البرنامج التالي ، ظروف التدوير الحراري وتشغيل تفاعل PCR.

بعد هذا. تحقق من النتائج لتحديد ما إذا كان التفاعل ناجحا أم لا. في النهاية ، يجب أن ينتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل أمبليكون محدد لحجم المنتج المطلوب.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذا البروتوكول قليلا في إعداد حسابات كل من الكواشف المتغيرة ، وأحيانا يواجهون مشاكل في سحب العينات ، والأحجام الصحيحة ، خاصة مع البوليميراز الذي يحتوي على الجلسرين. ابدأ التجربة بدلو ثلج مملوء حديثا. ارتد قفازات لتجنب تلويث التفاعل.

خليط وكواشف. رتب مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد لتذوب تماما. وتشمل هذه بادئات قالب الحمض النووي ، وبوليميراز الحمض النووي 10 × المخزن المؤقت للتفاعل مع أو بدون كلوريد المغنيسيوم ، ونيوكليوتيدات الديوكسي ، والماء المعقم ، وكلوريد المغنيسيوم.

كلوريد المغنيسيوم مطلوب في حالة استخدام المخزن المؤقت بدون كلوريد المغنيسيوم. ضع لوح بئر 96 في دلو ثلج كحامل لأنابيب PCR ذات الجدران الرقيقة سعة 0.2 مل. الآن قم بتجهيز طاولة العمل بأنابيب وأغطية PCR.

رف أنبوب PCR ، وعلامة مقاومة للإيثانول ، ومجموعة من الماصات الدقيقة. قم دائما بإنشاء جدول من الكواشف يوضح بالتفصيل خليط التفاعل بالماء المقطر المعقم الكمي للحصول على الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولترا. على سبيل المثال ، باستخدام خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت بدون المغنيسيوم ، وميكرولتر واحد من 10 ملليمولار DN NTPs ، ومغنيسيوم 4.0 مللي مولار محسن.

ميكرولتر واحد من كل 20 ميكرومولار أولي ، 0.5 ميكرولتر من نانوغرام لكل قالب ميكرولتر. وسيتطلب 0.5 ميكرولتر من البوليميراز 33 ميكرولترا من الماء المعقم فقط. أضف كلوريد المغنيسيوم إذا لم يكن موجودا في المخزن المؤقت 10 × أو إذا لزم الأمر لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تابع تسمية أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل بعلامة مقاومة للإيثانول لكل أنبوب تفاعل. أولا ، أضف الكميات المحسوبة من الماء المعقم ، ثم أضف 10 × عازلة و 10 مللي مولار DN NTPs. في هذا التفاعل، نقوم بإجراء معايرة بالتحليل الحجمي باستخدام كلوريد المغنيسيوم.

نظرا لأن تركيز المغنيسيوم لن يكون ثابتا ، يضاف كلوريد المغنيسيوم إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل فردي ، ويتم تطبيع الحجم إلى 10 ميكرولتر بالماء المعقم ، بحيث يتم إضافة 40 ميكرولترا من المزيج الرئيسي النهائي إلى كل أنبوب PCR. لإكمال تفاعل 50 ميكرولتر وكلوريد المغنيسيوم ، استمر في إضافة قالب الحمض النووي والبادئات. أخيرا ، أضف 0.5 إلى 2.5 وحدة من بوليميراز الحمض النووي لكل تفاعل 50 ميكرولتر في أنبوب فوج دقيق سعة 1.8 ملليلتر.

قم بإعداد محلول خلط رئيسي بما يكفي لاستيعاب أدوات التحكم بالإضافة إلى فقدان نقل الماصة. اضبط ماصة صغيرة على حوالي نصف الحجم الكلي للمحلول واخلطها برفق عن طريق سحب العينات. لكل عينة اختبار ، مزيج رئيسي بليغ في أنبوب PCR.

الآن بالنسبة للتحكم السلبي بدون قالب الحمض النووي ، أضف جميع الكواشف واستخدم الماء المعقم للتعويض عن حجم الحمض النووي المفقود. ثم بالنسبة للتحكم الإيجابي ، استخدم مجموعة من قالب الحمض النووي والبادئات التي تضخم جزءا معروفا في نفس ظروف عينات تفاعل البوليميراز المتسلسل التجريبية. تقوم الدراجات الحرارية PCR بتسخين وتبريد خليط التفاعل بسرعة ، مما يسمح بتمسخ الازدواج الناجم عن الحرارة ، وركوع الحمض النووي للبادئات إلى خيوط زائد وناقص لقالب الحمض النووي واستطالة منتج PCR.

أوقات ركوب الدراجات على حجم القالب ومحتوى GC للحمض النووي للصيغة العامة. ابدأ بتمسخ أولي للقالب ، ثم ابدأ من 25 إلى 35 جولة من برنامج دورة درجة الحرارة المكون من ثلاث خطوات. الخطوة الأولى من هذه الدورات لتغيير طبيعة قالب الحمض النووي.

ثم قم ببرمجة الركوع الأمثل ، على ركوع البادئات بحوالي خمس درجات مئوية تحت درجة حرارة الانصهار الظاهرة للبادئات ، متبوعة بخطوة الاستطالة لإحضار البوليميراز إلى قالب الحمض النووي وتصنيع منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أدخل الآن عدد الدورات. البرنامج التالي.

خطوة استطالة ممتدة لإكمال توليف مكبرات الصوت. أخيرا ، قم بتضمين خطوة الإنهاء ، مع تبريد الخليط إلى أربع درجات مئوية. إذا لم تسفر ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية عن المضبوطات المطلوبة ، فإن تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل ضروري لتحقيق نتائج أفضل.

لذلك إذا لم تنجح ردود الفعل في المرة الأولى ، فأنت تريد محاولة استكشاف الفعل وإصلاحه. ولذا أولا ، تريد التأكد من أن المشكلة لم تكن خطأ بشريا. ويمكن أن يحدث ذلك إذا كان لديك خطأ في سحب العينات أو إذا نسيت إضافة كاشف إلى الاختبار ، إذا نسيت إضافة كاشف إلى الاختبار.

بعد ذلك ، يمكنك محاولة تغيير بعض صرامة الحالة حتى تتمكن من تغيير إعداد الجهاز الحراري ، أو يمكنك تغيير تركيز المغنيسيوم هو طريقة بديلة أخرى. يمكنك أيضا محاولة إضافة بعض الإضافات إلى الكاشف لاستكشاف المشكلات وإصلاحها. بالتناوب ، ضع في اعتبارك بدء تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل على أنه تعديل متعدد الاستخدامات يتم فيه زيادة وقت التمسخ الأولي بشكل كبير.

ثم يتم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام AROS لحل تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين GAL الثلاثة من الحمض النووي الجيني ل S seia لتحديد تركيز أيون المغنيسيوم الأمثل لهذه المجموعة من الكواشف ، لاحظ ، منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالحجم المتوقع. يظهر 2098 زوجا أساسيا بدءا من تركيز المغنيسيوم البالغ 2.5 ملليمولار مع تركيز مثالي عند أربعة مللي مولار على تضخيم قالب الحمض النووي المختلف لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوب كنطاق منفصل يتطلب اثنين ملي مولار المغنيسيوم. يؤدي تقليل صرامة التفاعل إلى ظروف تضخيم دون المستوى الأمثل بشكل فعال إلى تشويه منتجات غير محددة.

علاوة على ذلك ، مع الصرامة الإجمالية لتقليل التفاعل ، يلزم وجود كمية أقل من أيون المغنيسيوم لتشكيل رمز أمبليكون. وبالتالي ، فإن تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل مع مراعاة المتغيرات يمكن أن ينتج المنتج المنفصل المطلوب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الهدف هو فهم متغيرات كل تفاعل البوليميراز المتسلسل وكيف يمكن التلاعب بها لإنشاء المضطرب المطلوب.