نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية

الهدف من هذا الإجراء هو تعريض الخلايا المزروعة في 3D لتدفق السائل الخلالي ، وتحديد تأثيرات التدفق بوساطة على غزو الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير محلول هلام أولا يتكون من النوع الأول من الكولاجين والماتريجل. الخطوة الثانية هي إضافة تركيز محدد من الخلايا إلى محلول الجل.

بعد ذلك ، يضاف معلق الخلية إلى قطر 12 ملم ، وحجم المسام ثمانية ميكرون ، ويتم تحضنه عند 37 درجة مئوية حتى المواد الهلامية المصفوفة. تتمثل الخطوة الأخيرة في إعداد الفحص في إضافة كميات محددة من الوسائط إلى الآبار لإنشاء ظروف ثابتة وتدفق. بعد 24 ساعة ، يتم إصلاح أغشية الويل وتلطيخها وتصورها لتقدير عدد الخلايا التي تم غزوها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل غرف التدفق الخلالي الدقيقة ، هي أنها لا تتطلب مضخات أو معدات متخصصة ، وتسمح للباحثين باختبار حالات أو علاجات متعددة بسهولة وسرعة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للهجرة الخلوية والغزو ، إلا أنه يمكن استخدامها أو تطبيقها لدراسة تأثير تدفق السائل الخلالي على السلوك الخلوي الآخر ذي الصلة ، مثل التعبير عن البروتين ، وتكاثر الخلايا ، والتغيرات في إشارات الخلية. وإظهار هذا الإجراء سيكون ليما اثنين من تشا.

طالب دراسات عليا في مختبري ابدأ هذا الإجراء برمي كمية صغيرة من هلام ماتري على الجليد عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد وصفة الجل بالماء المعقم PBS ، وهيدروكسيد الصوديوم ، والماتريجيل ، والكولاجين من نوع ذيل الفئران. ثم امزج مكونات الجل على الجليد بنفس التسلسل واحتضان المحلول النهائي لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

الآن ضع إدخالات ثقافة خلايا دقيقة بقطر 12 ملم في صفيحة 12 بئر باستخدام زوج من الملقط المعقم. ثم عد الخلايا وأعد تعليقها في وسائط خالية من المصل بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 900 ميكرولتر من محلول الجل. بعد ذلك ، امزجها جيدا عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من الخليط النهائي إلى كل إدراج. ثم انقل الحضانات إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪ لمدة 30 دقيقة حتى يتبلمر الجل. بالنسبة للحالة الثابتة ، أضف 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل أعلى الجل و 1 ، 200 ميكرولتر ميكرولتر أسفل الحشو.

يجب أن تكون مستويات السوائل داخل وخارج الإدخال في البئر متساوية تقريبا ، مما يؤدي إلى اختلاف ضغط ضئيل عبر الجل وعدم وجود تدفق خلالي. لحالة التدفق ، أضف 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل أسفل الملحق و 650 ميكرولتر فوق الجل. في الوقت نفسه ، حاول تجنب تكوين أي فقاعات هواء أسفل الملحق لأنها ستمنع الخلايا من الهجرة عبر الغشاء في هذه المواقع.

ثم ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في هذه الخطوة ، أضف 500 ميكرولتر من مرة واحدة في PBS لكل بئر في صفيحة جديدة 24 بئرا لغسل الإدخالات. ثم قم بإزالة الوسط المتبقي في الجزء العلوي من آبار اتجاهات التدفق.

بعد ذلك ، استخدم مسحات قطنية لإزالة الجل من الإدخالات. امسح الجزء العلوي من سطح الغشاء لإزالة الخلايا غير VA. ثم اغسل الإدخالات عن طريق وضعها في صفيحة 24 بئر تحتوي على مرة واحدة PBS لمدة 15 ثانية.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBS وأضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارا فورمالديهايد أسفل كل إدخال. احتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا المهاجرة. ثم قم بإزالة PFA واشطفها مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر مرة واحدة في PBS لإزالة المثبت المتبقي.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول 0.5٪ Triton X 100 أسفل الإدخالات واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لاختراق الخلايا ، قم بقص الأغشية من الملحق باستخدام شفرة حلاقة. ثم ضعها في 100 ميكرولتر من ميكروغرام لكل مليلتر DPI في محلول PBS مرة واحدة.

الحرص على وضع الجانب السفلي من الغشاء متجها لأسفل. يجب تحضير محلول DPI قبل بضع دقائق من الاستخدام وحفظه في الظلام. الآن لف اللوحة بورق الألمنيوم.

ضعه على شاكر بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة من درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأغشية في 500 ميكرولتر مرة واحدة PBS وضعها مرة أخرى على الخلاط لمدة 10 دقائق. لإزالة jy الحر ، كرر الغسيل مرتين أخريين.

الخطوة التالية هي وضع الأغشية على شرائح زجاجية مع توجيه الخلايا المهاجرة لأعلى. أضف محلول التركيب إلى الأغشية. ثم قم بتغطيتها بزلات غطاء.

بعد ذلك ، عد البقعة الرقيقة إلى النوى واحسب عدد الخلايا التي تم غزوها وفقا للمخطوطة المصاحبة. يوضح هذا الشكل خلايا MDA MB 4 35 s المهاجرة على الغشاء. تم إصلاح الخلايا التي تم غزوها بعد مقايسة غزو تدفق السائل الخلالي وتلطيخها ب DPI و Alexa Fluor 4 88 مترافق لتسهيل عد الخلايا التي تم غزوها.

هذا هو الغشاء الموجود أسفل الحقل الساطع وهنا نوى البقعة الرقيقة. يظهر هنا أليكسا فلور 4 88 فويد ملطخ بالأكتين F. يوضح هذا الرسم البياني أن غزو خلايا الورم الميلانيني النقيلي MDA MB 4 35 s قد تم تعزيزه بشكل كبير عن طريق التدفق الخلالي.

بعد 24 ساعة ، يتم تطبيع النتائج إلى متوسط حالة الغزو الساكن ويتم تقديم المتوسط من ستة إدخالات لزراعة الخلايا. الفرق بين الشروط ذو دلالة إحصائية مع قيمة P تبلغ 0.003. بمجرد إتقانها ، يمكن إعداد مقايسة تدفق السائل الخلالي في غضون ساعتين ، تليها حضانة لمدة 24 ساعة ، ثم ساعتين لتثبيت وتلطيخ أغشية التحويل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخراج الخلايا أو البروتينات أو الأحماض النووية بسهولة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تغير التعبير الجيني والبروتيني استجابة لتدفق السائل الخلالي. منذ تطويره ، أصبح هذا اختبارا أساسيا للباحثين الذين يدرسون آثار التدفق الخلالي على الخلايا السرطانية.