وهو الإجراء الأمثل لالإسفار تنشيط عزل الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) فرز الأسلاف العصبية الاستقلال الذاتي من الجهاز التنفسي والهضمي من الفئران الجنينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق مجموعة من أسلاف الخلايا العصبية المنقاة من العقد في الجهاز العصبي المحيطي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح العضو أو العقد المحددة ذات الأهمية من الفئران الجنينية أولا. ثم يتم فصل الأنسجة جزئيا لتحرير الخلايا الفردية في الوسائط المحيطة.

بعد ذلك ، يتم ترشيح تعليق الخلية لإزالة أي كتل نسيجية متبقية أو ركام كبير. أخيرا ، يتم فرز تعليق الخلية لعزل السكان محل الاهتمام بناء على تعبير مراسل الفلورسنت في مجموعة الخلايا هذه. في النهاية ، يمكن مقارنة أنماط التعبير الجيني بين الأسلاف ، المعزولة في مراحل مختلفة من التطور ، أو بين مجموعات منقاة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على عزل مجموعات الخلايا بناء على وضع العلامات على الأجسام المضادة هي أنه غالبا ما تكون الكواشف المناعية غير متوفرة. تتيح خلايا التسمية التي تعبر عن جين معين ، وخطوط الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج بروتين الفلورسنت في مجموعات فرعية عصبية منفصلة عزل مجموعات الخلايا هذه. بينما نوضح هذه الطريقة لعزل الأسلاف العصبية عن الأمعاء ومسار الخلايا العصبية للفم ، يمكن أيضا تطبيقها على الأنظمة النموذجية الأخرى التي تعبر عن مراسلي الفلورسنت.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم يميلون إلى الإفراط في هضم أنسجة المصدر مما يؤدي إلى فقدان صلاحية الخلية. قبل البدء في التشريح ، اعرض الأجنة عن طريق إضاءة المجال الساطع للتأكد من أن الهياكل ذات الصلة في بؤرة التركيز. ثم حدد الأجنة الإيجابية للجينات المعدلة وراثيا عن طريق فحص التعبير عن مراسل الفلورسنت باستخدام مجهر ستيريو فلورسنت.

بعد القتل الرحيم ، تبدأ الأجنة بإضافة كمية قليلة من PBS إلى طبق التشريح ، لذلك لا يطفو الجنين أثناء تشريح الأنسجة. افتح جلد الجنين على جانبي الجسم وعبر البطن على مستوى الكبد. لف الجنين على ظهره واستخدم ملقطا دقيقا لتثبيته في مكانه.

على مستوى الطرف الأمامي ، أدخل زوجا آخر من الملقط على مستوى الحجاب الحاجز ، ثم بسرعة. اسحب الأعضاء الداخلية لأسفل باتجاه الذيل وبعيدا عن جدار الجسم الظهري لإزالة الأحشاء من الكبد وصولا إلى السلبة التناسلية. إذا خرجت أي أعضاء من التجويف الصدري ، مثل القلب أو الرئتين ، متصلة بالأحشاء ، فقم بإزالتها قبل المضي قدما.

بمجرد فصل أحشاء البطن عن الذبيحة ، أدخل زوجا من الملقط أسفل الكبد ، بالقرب من المعدة ، وقم بإثارة الكبد برفق بعيدا عن الأمعاء. ثم قم بتشريح الأمعاء الخلفية بعناية بعيدا عن مجرى البول الظهري وإزالة الأمعاء من الجهاز البولي التناسلي. أخيرا ، اقلب الأمعاء حتى يظهر الطحال تحت المعدة.

إزالة الطحال والبنكرياس. اسحب حلقات القناة الهضمية عن بعضها البعض عن طريق التمسك بالمساريق. ثم قم بتجريد المساريق والأوعية الدموية المصاحبة له من الأمعاء عن طريق سحب المساريق برفق.

تجنب إمساك الأمعاء مباشرة بالملقط. إذا انكسرت الأمعاء ، فما عليك سوى تجميع القطع المنفصلة في مرحلة التفكك. قم بتجميع كل نوع من أنواع الأنسجة معا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على HBSS المثلج البارد وفقا لنوع الأنسجة ونوع النمط الظاهري للجنين.

بعد التكوير ، تستنشق الأنسجة الفرعية أكبر قدر ممكن من HBSS. ثم أعد تعليق حبيبات الأنسجة في واحد إلى عدة ملليلتر من وحدة التحكم في الوصول إلى أقصى حد. تغيير أطراف الماصة بين كل عينة.

لتجنب التلوث المتبادل لأنواع الأنسجة، ضع الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 45 دقيقة. اعتمادا على مرحلة عزل الأنسجة ، يعد تفكك الأنسجة وتصفيتها أصعب جزء من الإجراء لمنع التفكك العلني للأنسجة. ونتيجة لذلك ، انخفاض صلاحية الخلية.

قلل من وقت التفكك ولا تحاول فصل جميع قطع الأنسجة تماما في منتصف الطريق. وفي نهاية وقت التفكك ، قم بتفتيت الأنسجة يدويا عن طريق ضرب الأنبوب بقوة على جانب الحمام المائي وقذف الأنبوب لأسفل بحركة معصم مفاجئة. الآن انقل العينات المفككة إلى الجليد وأضف على الفور ملليلترا واحدا من التبريد الطازج إلى كل أنبوب باستخدام طرف ماصة جديد لكل عينة ، وقم بتقطيع العينة لأعلى ولأسفل حتى يتم فصل الأنسجة بالكامل تقريبا.

الآن باستخدام زوج من ملقط الإيثانول المعقم ، ضع مربعا بثلاثة سنتيمترات من غشاء شبكي من النايلون 38 ميكرون فوق فم أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. ثم استخدم أطراف التجويف الضيقة لتصفية محلول الخلية المعلق الفردي من خلال الشبكة عن طريق سحب العينات في وسط الغشاء. بمجرد تصفية معلق الخلية ، اشطف أنبوب العينة بملليلتر واحد من إخماد واحد إلى خمسة وقم بتصفية أي خلايا متبقية.

ثم قم بإزالة الغشاء مع الحرص على منع أي عينات من الأنسجة غير المفلترة من دخول الأنبوب. بعد التكوير ، تقوم معلقات الخلية بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من إخماد واحد إلى خمسة. ثم قم بتصفية كل معلق خلية من خلال شبكة من النايلون إلى أنابيب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر كما هو موضح للتو.

ابدأ بحجز حصة صغيرة من عينة التألق للتحكم في تعويض EGFP فقط. ثم قسم عينة الأنسجة من النوع البري إلى جزأين يصنفان نوعا واحدا من البرية فقط والسبعة الأخرى A a d.Only. الآن املأ جميع أنابيب العينة بإخماد واحد إلى خمسة ، وبعد تكوير العينات ، استنشق كل ما عدا آخر 200 ميكرولتر من المادة الطافية في كل أنبوب.

أخيرا ، أضف سبعة أ أ د إلى العينات المراد فرزها وسبعة أ أ د فقط عنصر التحكم. ثم أضف 0.75 مل من تريازول LS إلى جهاز طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. تبدأ أنابيب جمع العينات باستخدام عينات التحكم لضبط معلمات التعويض والبوابات لتجنب سبع خلايا ميتة إيجابية A a D وجمع الخلايا التي تظهر كثافة عالية من مضان GFP.

بعد ضبط معلمات التعويض ، ابدأ في الفرز بأقل ضغط ممكن باستخدام فوهة تجويف عريضة ومعدل تدفق منخفض. اجمع 25،000 خلية كحد أقصى في كل أنبوب طرد مركزي دقيق حتى لا يتم تخفيف الثلاثي LS أكثر من اللازم. مباشرة بعد الفرز دوامة ، تم التقاط كل أنبوب من الخلايا في الثلاثي ls.

في هذا الشكل الأول ، يظهر هنا جهاز تناسلی أوروبي كامل بعد 15.5 يوما من الجماع الذي تم عرضه بطنيا تحت إضاءة المجال الساطع. يتم عرض نفس العينة تحت إضاءة التألق لإثبات توزيع الخلايا الإيجابية EGFP في الغدة الكظرية والعقد البطنية الموجودة في الوسط كما هو محدد من خلال تعبير الجينات المعدلة وراثيا TH EGFP. يظهر هذا العرض الجانبي للمثانة الفرعية التي تم تشريحها بعد 15.5 يوما من cotus TH EGFP تألق من التعبير الجيني المعدل في العقد الحوضية وجدار المثانة والإحليل.

في هذا المنظر الظهري لنفس الخلايا الإيجابية EGFP ، يتضح تفكك أنسجة مجرى البول الظهري الأمامي لإنتاج معلقات الخلية لفرز التدفق هو توازن دقيق بين الهضم الأنزيمي الكافي وتجنب الهضم المفرط الذي يمكن أن يؤدي إلى تقلبات منخفضة في الخلايا. تظهر هذه الصور المجهرية السفلية للجهاز البولي التناسلي وأنسجة الأمعاء في منتصف وقت التفكك. كما هو موضح في هذه الصور للأنسجة المهضومة بشكل مناسب قبل وبعد الدليل ، لا تزال القطع الثلاثية من الأعضاء الفرعية التشريح واضحة بوضوح في الأنسجة التي يتم معالجتها إنزيميا لفترة طويلة جدا أو بتركيز مرتفع جدا من الإنزيم.

ومع ذلك ، فإن التعليق الناتج يفتقر إلى أي قطع كبيرة متبقية من الأنسجة ، وينتج عن التفكك المناسب للأنسجة والترشيح اليدوي ملفات تعريف قياس التدفق الخلوي التي تظهر عادة أكثر من 90٪ من الخلايا القابلة للحياة وتلك الخلايا التي تعبر عن المراسل في هذه المجموعة الصالحة للحياة ، تحتفظ الخلايا بتعبير EGFP عالي الكثافة. يتكون السكان السود من خلايا مفردة ميتة ومصنفة عن طريق امتصاص سبعة أ أ د يموت مضان يتكون السكان الرماديون من خلايا مفردة تعتمد على التشتت الأمامي والجانبي التي استبعدت سبعة أ أ د ، وبالتالي فهي قابلة للحياة.

السكان الخضر هم من المنطقة الإيجابية GFP المسورة وتتألف من خلايا مفردة قابلة للحياة استبعدت سبعة A a d ، والتي تظهر مضان EGFP. من خلال هذا الإجراء ، يمكن إجراء عزل الأسلاف العصبية عن الأنسجة الطرفية الأخرى مثل السلسلة الودية أو الجذر الظهري أو العقد أو الرئة من أجل الإجابة على أسئلة حول الاختلافات في ملامح التعبير الجيني بين السكان أو حول تطور سلالات متميزة.