عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

يستخدم هذا العرض التوضيحي التصوير الحي للخلايا ثنائي وثلاثي الأبعاد لفهم العلاقات المكانية والزمانية للبروتينات المشاركة في استجابة تلف DNA. أولاً، قم بنقل أو تحويل خط الخلايا المختار باستخدام بنيات تعبيرية تحتوي على علامات فلورية مناسبة، وهي هنا M Cherry وGFP، ثم احصل على سلسلة من مقاطع الفيديو الضابطة التي تظهر الخلايا المسمى فلورياً في ظروف طبيعية.

ثم يتم تطبيق معالجة مناسبة ورصد بيانات تأثيرات هذه المعالجة على عملية الخلايا الفلورية، وتحليل بيانات الفيديو لتحديد العلاقات المكانية والزمانية للبروتينات. وفي نهاية المطاف، يمكن للمجهر الفلوري للخلايا الحية توضيح الديناميكيات الخلوية مثل تكوين بؤر 53 BP one استجابةً للعوامل المسببة لتلف DNA أو سلوك 53 BP one أثناء الانقسام الفتيلي. وقد بدأ اهتمامنا بالتصوير الحيوي ثنائي وثلاثي الأبعاد عندما أردنا دراسة كيفية تأثير المعالجات المختلفة على الانقسام الفتيلي في خطوط خلوية معينة.

يتيح لنا هذا النهج التجريبي دراسة استجابة تلف DNA والحفاظ على الاستقرار الجينومي بسهولة أكبر من الطرق التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، يمكنك استخدام هذه الطريقة لدراسة كيفية تفاعل بروتينات معينة في مسارات تأشير مختلفة وسلالات خلوية متنوعة. وتكمن الميزة الرئيسية للتصوير الحي مقابل التقنيات التقليدية مثل الكيمياء الخلوية في أنه يسمح بدراسة بروتينات استجابة تلف DNA في الوقت الفعلي.

يمكن أن يكون تحسين ظروف التسجيل المناسبة أمراً صعباً. ويمكن استخدام هذا العرض التوضيحي لرؤية العديد من الخطوات الصغيرة اللازمة لضمان النجاح. تذكر أن المثابرة تؤتي ثمارها عندما يتعلق الأمر بتقليل التبييض الضوئي، وإيجاد فترات التسجيل المناسبة، ومدة التسجيل الصحيحة، وما إلى ذلك.

قم بنقل البلازميدات الخاصة بالتعبير عن البروتينات الاندماجية mCherry و GFP إلى خطوط الخلايا المناسبة عن طريق transfection أو transduction. حافظ على المزارع الخلوية تحت تأثير الانتقاء الدوائي، وتحقق بشكل دوري من التعبير عن البروتينات الفلورية في اليوم السابق لعملية الحصول على الصور. قم بحصاد الخلايا باستخدام trypsin.

بعد ذلك، قم بنثر مزارع منخفضة الكثافة على أطباق زجاجية ذات قاعدة فلورية بقطر 3.5 centimeter. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام مجهر Zeiss cell observer SD confocal ذو القرص الدوار، والمجهز بحامل axio observer Z one. أولاً، تحقق من تدفق غاز CO2 إلى وحدة CO2 في نظام التحضين. إذا كان المجهر مدعوماً بطاولة Airtable مضادة للاهتزاز، فقم بتشغيل إمدادات الهواء الخاصة بطاولة Airtable.

قم الآن بتشغيل الطاقة لوحدة القرص الدوار في حامل المجهر، والكاميرات، ووحدات التحضين، والمضيء HXP، والمنصة الآلية، وليزر argon، والكمبيوتر. قم بتشغيل مفاتيح خطوط الليزر التي سيتم استخدامها. ابدأ بتشغيل برنامج Axio vision.

يمكن تخصيص برنامج Avision بنوافذ وقوائم منسدلة خاصة بالمجهر والمكونات التي يتحكم بها. وبناءً على ذلك، تمتلك كل واجهة مستخدم مظهراً فريداً من نوعه. قبل البدء في التصوير بحوالي ساعة واحدة، حدد موقع عناصر التحكم في الحاضنة وقم بتشغيل التسخين للغرفة العلوية ولوحة المسرح.

اضبط درجة الحرارة على 37 °C. قم بتشغيل التحكم في CO2 واضبط المستوى عند 5%. اختر العدسة الشيئية المستخدمة للتصوير في هذه الدراسة. تتطلب العدسة الشيئية استخدام وسط غمر له معامل انكسار مشابه للماء.

إذا كنت بحاجة إلى تصوير مواقع متعددة على مدار فترات زمنية طويلة، فتأكد من وضع كمية كافية من وسط الغمر حتى لا يجف المجهر. ضع طبق المزرعة على المنصة واجعل العدسة الشيئية تلامس القاع، باستخدام عناصر التحكم في المجهر أو البرنامج. وجه الضوء المنبعث إلى العدسات العينية واختر مجموعة مرشحات المجال الواسع المناسبة لإشارة الفلورسنت المطلوبة.

انظر الآن من خلال العدسات العينية. قم بضبط تركيز الصورة وتحديد مجال مناسب من الخلايا باستخدام البرمجيات أو عناصر التحكم في المجهر. وجّه الضوء المنبعث بعيداً عن العدسات العينية إلى المنفذ المتصل بوحدة القرص الدوار البؤري (confocal spinning disc unit) في البرمجيات.

قم بتشغيل الليزر المناسب لهذه الدراسة. وبالنسبة لكل قناة، اضبط شدة الليزر عن طريق ضبط تحكم مرشح kuo optic القابل للضبط إلى المستوى المناسب. بعد ذلك، اختر المرآة ثنائية اللون وفلاتر الانبعاث المناسبة.

افتح غالق وحدة القرص الدوار. اختر الآن نافذة العرض المباشر لعرض مجال الرؤية الحالي. ثم افتح نافذة التحكم في الكاميرا.

حدد الكاميرا المراد استخدامها واضبط وقت التعريض على 100 milliseconds تقريبًا. قم بتعديل النسبة المئوية ومعامل كسب الإلكترونات (EM gain) حسب الضرورة. كذلك، افتح وحدة التحكم في وحدة القرص الدوار البؤري (confocal spinning disc) واضبط سرعة القرص الدوار عن طريق إدخال وقت تعريض الكاميرا الذي تم ضبطه لالتقاط صورة مناسبة.

انقر فوق "set" لتثبيت التغيير. افتح الآن نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد. اختر علامة تبويب القناة (channel) ثم قم بتحميل أو اختيار القنوات المناسبة المحددة لجهاز Flora Fours.

لضمان تسجيل الصور، استخدم مرآة ثنائية اللون مشتركة لكلتا القناتين. اضبط البرنامج على التركيز التلقائي. انتقل إلى نافذة MDA وانقر فوق علامة تبويب ZS stack.

حدد مكدس ZS عند موضع التركيز الحالي. اضبط النطاق لمكدس Zack بمقدار 10 micron واختر القيمة المثلى لعدد الخطوات لضمان أخذ عينات نايكويست (nyquist sampling) عبر المحور Z. انقر الآن على بدء وتحليل صورة مكدس Z الناتجة. حدد علامة تبويب الوقت.

حدد الفاصل الزمني بين نقاط التصوير الزمنية والمدة الإجمالية للجلسة. ولإجراء تصوير متعدد النقاط لعدة خلايا في الطبق، افتح نافذة MDA. اختر علامة تبويب الموضع (position) وتحقق من تفعيل إعداد تطبيق الإعداد قبل أو بعد النقطة الزمنية لكل موضع (apply setting before or after time point per position).

الآن اختر mark. حدد المواقع باستخدام العرض المباشر، وحرك الطبق لاختيار حقول الرؤية المناسبة. انقر فوق start في قائمة الاستحواذ متعدد الأبعاد لبدء التجربة وتسجيل فيديو ضابط.

باشر بإضافة المعالجة المناسبة وتسجيل الفيديو التجريبي في فترات زمنية محددة ولمدة زمنية معينة. بالنسبة لهذا الخط الخلوي ولمراقبة عملية الانقسام الفتيلي بأكملها، استخدمنا فاصلًا زمنيًا قدره سبع دقائق ونصف، واستمر ذلك لمدة تتراوح من أربع إلى خمس ساعات. سيتعين عليك تحديد الإعدادات الخاصة بخطك الخلوي وبما ترغب في دراسته.

افتح برنامج velocity، ثم أنشئ مكتبة جديدة وقم بتسميتها واستورد ملفات الفيديو التجريبية لعرضها. جرب استخدام إعداد التركيز الممتد (extended focus)، وقم بتعديل مقاطع الفيديو حسب الضرورة. برنامج Velocity مجهز بمجموعة من الأدوات للمساعدة في تحسين جودة الصور التي تم الحصول عليها.

إذا كانت إعدادات المجهر مناسبة، فسيؤدي ذلك إلى توفير الكثير من الوقت لاحقاً في عملية التحرير. غالباً ما يكون من المفيد معالجة صورك وضبط السطوع والتباين وفقاً لاحتياجاتك المحددة التي ستختلف بناءً على تجربتك. لعرض الخلايا ثلاثية الأبعاد، قم بالتحويل إلى إعداد العتامة ثلاثي الأبعاد (3D opacity).

يسمح هذا بتدوير الخلايا المُصيرة ثلاثية الأبعاد في الفراغ، مما يوفر منظورات متعددة للهياكل ذات الأهمية داخل الخلايا. الأفلام. ويمكن تصدير الصور الثابتة إلى مجموعة متنوعة من أنواع الملفات بناءً على تفضيل المستخدم مقارنة بالمجموعات الضابطة. شكلت الخلايا الليفية المعرضة لـ CPT بؤرًا في غضون 5 إلى 10 دقائق وحافظت على هذه البؤر طوال فترة التسجيل.

ومن المثير للاهتمام أنه في خلايا الكلى الجنينية البشرية، ينفصل 53 BP one عن الكروماتين عند بدء الانقسام الفتيلى، مكوناً سحابة رقيقة حول الكروموسومات المتكثفة. ومع حدوث التلف والوصول إلى نهاية الانقسام الفتيلى، يتجمع 53 BP one مرة أخرى في بؤر متميزة. نأمل أن يمكّنكم هذا الفيديو من دراسة العلاقات الزمانية والمكانية للبروتينات المشاركة في استجابة تلف DNA بالإضافة إلى المسارات الأخرى.

على سبيل المثال، في مجال ديناميكيات الكروماتين، استُخدمت هذه التقنية لدراسة كيف يؤثر ارتباط 53 BP1 على حركة النهايات التيلوميرية للحمض النووي DNA. وبعد إنشاء خلايا معدلة وراثياً، يمكن إجراء تصوير حي للخلايا ثنائي وثلاثي الأبعاد في غضون أربع إلى ثماني ساعات تقريباً. تأكد من ضبط إعدادات المجهر بشكل مناسب للحصول على تصوير مثالي.