عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.

يستخدم هذا العرض التوضيحي تصويرا للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد لفهم العلاقات الزمانية المكانية للبروتينات المشاركة في استجابة تلف الحمض النووي. أولا ، قم بتحويل أو تحويل خط الخلية الذي تختاره باستخدام تركيبات التعبير التي تحتوي على علامات الفلورسنت المناسبة. هنا يحصل M Cherry و GFP بعد ذلك على سلسلة من مقاطع الفيديو الضابطة التي تظهر الخلايا ذات العلامات الفلورية في ظل الظروف العادية.

ثم قم بتطبيق العلاج المناسب والتقاط بيانات تأثيرات العلاج على عملية الخلايا الفلورية وتحليل بيانات الفيديو للعلاقات الزمانية المكانية للبروتينات. في النهاية ، يمكن للفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية أن يفصل الديناميكيات الخلوية مثل تكوين 53 BP بؤرة واحدة استجابة للعوامل الضارة بالحمض النووي أو سلوك 53 BP أثناء الانقسام. أصبحنا مهتمين لأول مرة بتصوير نمط الحياة ثنائي وثلاثي الأبعاد عندما أردنا دراسة كيفية تأثير العلاجات المختلفة على الانقسام في خطوط خلايا معينة.

يسمح لنا هذا النهج التجريبي بدراسة استجابة تلف الحمض النووي والحفاظ على الاستقرار الجيني بسهولة أكبر من الطرق التقليدية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنك استخدام هذه الطريقة لدراسة كيفية تفاعل بروتينات معينة في مسارات الإشارات المختلفة وخطوط الخلايا المختلفة. الميزة الرئيسية لتصوير نمط الحياة على التقنيات التقليدية مثل كيمياء السيتو هي أنه يسمح بدراسة بروتينات الاستجابة لتلف الحمض النووي في الوقت الفعلي.

قد يكون تحسين ظروف التسجيل الصحيحة أمرا صعبا. يمكن استخدام هذا العرض التوضيحي لرؤية العديد من الخطوات الصغيرة اللازمة لضمان النجاح. تذكر أن المثابرة تؤتي ثمارها عندما يتعلق الأمر بتقليل تبييض الصور ، والعثور على فترات التسجيل الصحيحة وطول وقت التسجيل الصحيح ، وما إلى ذلك.

قم بنقل أو تحويل خطوط الخلايا المناسبة مع البلازميدات لتعبير بروتين اندماج mCherry و GFP. حافظ على الثقافات تحت اختيار الدواء وتحقق بشكل دوري من التعبير عن بروتينات الفلورسنت في اليوم السابق للحصول على الصورة. حصاد الخلايا باستخدام التربسين.

ثم قم بزرع المزارع منخفضة الكثافة على ألواح سفلية زجاجية من الفلورو 3.5 سم. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام مجهر متحد البؤر لمراقب خلية زايس SD ، المجهز بمراقب محوري Z حامل واحد أولا ، تحقق من أن غاز ثاني أكسيد الكربون يعمل إلى وحدة ثاني أكسيد الكربون لنظام الحضانة. إذا كان المجهر مدعوما بجهاز Airtable مضاد للاهتزاز ، فقم بتشغيل مصدر الهواء لجهاز Airtable.

الآن قم بتشغيل الطاقة لكاميرات وحدة القرص الدوارة بحامل المجهر ، ووحدات الحضانة ، وإضاءة HXP ، والمرحلة الآلية ، وليزر الأرجون ، والكمبيوتر. قم بتشغيل المفاتيح الخاصة بخطوط الليزر المراد استخدامها. ابدأ تشغيل برنامج Axio vision.

يمكن تخصيص برنامج Avision مع النوافذ والقوائم المنسدلة الخاصة بالمجهر والمكونات التي يتحكم فيها. على هذا النحو ، تتمتع كل واجهة مستخدم بمظهر فريد محتمل قبل ساعة واحدة تقريبا من التصوير. حدد موقع عناصر التحكم في الحاضنة وقم بتشغيل التدفئة للغرفة العلوية ولوحة المسرح.

اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. قم بتشغيل عنصر التحكم في CO2 واضبط المستوى على 5٪ حدد العدسة الموضوعية للتصوير في هذه الدراسة. تتطلب العدسة الموضوعية استخدام وسيط غمر له معامل انكسار مشابه للماء.

إذا كنت بحاجة إلى تصوير مواضع متعددة على مدى فترات طويلة من الزمن ، فتأكد من تطبيق وسيط غمر كاف حتى لا يجف النطاق. ضع طبق الثقافة على المسرح واجعل العدسة الموضوعية ملامسة للأسفل ، إما باستخدام أدوات التحكم في المجهر أو البرنامج. قم بتوجيه الضوء المنبعث إلى قطع العين وحدد مجموعة مرشح المجال العريض المناسبة لإشارة الفلورسنت ذات الأهمية.

انظر الآن من خلال عدسات العين. ركز الصورة وحدد مجالا مناسبا من الخلايا باستخدام البرنامج أو عناصر التحكم المجهرية. قم بتوجيه الضوء المنبعث بعيدا عن قطع العين إلى المنفذ باستخدام وحدة قرص الغزل متحد البؤر في البرنامج.

قم بتشغيل الليزر المناسب لهذه الدراسة. لكل قناة ، اضبط شدة الليزر عن طريق ضبط التحكم في المرشح القابل للضبط kuo البصري إلى مستوى مناسب. بعد ذلك ، حدد المرآة ثنائية اللون ومرشحات الانبعاث المناسبة.

افتح الغالق لوحدة الأقراص الدوارة. حدد الآن النافذة الحية لعرض مجال الرؤية الحالي. الآن افتح نافذة التحكم في الكاميرا.

حدد الكاميرا المراد استخدامها واضبط وقت التعريض الضوئي على 100 مللي ثانية تقريبا. اضبط النسبة المئوية وكسب EM حسب الضرورة. افتح أيضا عنصر التحكم في وحدة قرص الغزل متحد البؤر واضبط سرعة قرص الدوران عن طريق إدخال وقت تعرض الكاميرا الذي تم ضبطه لالتقاط صورة مناسبة.

انقر فوق تعيين لتأمين التغيير. الآن افتح نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد. حدد علامة تبويب القناة وقم بتحميل أو تحديد القنوات المناسبة المحددة ل Flora Fours.

لضمان تسجيل الصورة ، استخدم مرآة ثنائية اللون مشتركة لكلتا القناتين. اضبط البرنامج على التركيز التلقائي. انتقل إلى نافذة MDA وانقر فوق علامة التبويب مكدس ZS.

حدد مكدس ZS في موضع التركيز البؤري الحالي. اضبط النطاق ل Zack 10 ميكرون واختر الأمثل لعدد الخطوات لضمان أخذ عينات nyquist من خلال Z.Now انقر فوق ابدأ وقم بتحليل صورة مكدس Z الناتجة. حدد علامة التبويب الوقت.

قم بتعيين الفاصل الزمني بين النقاط الزمنية للتصوير والمدة الإجمالية للجلسة. للتصوير متعدد النقاط لعدة خلايا في الطبق، افتح نافذة MDA. حدد علامة تبويب الموضع وتحقق من تحديد إعداد التطبيق قبل أو بعد النقطة الزمنية لكل موضع.

الآن حدد علامة. ابحث باستخدام طريقة العرض المباشرة، وحرك الطبق وحدد مجالات الرؤية المناسبة. انقر فوق ابدأ في قائمة الاكتساب متعدد الأبعاد لبدء التجربة وتسجيل فيديو تحكم.

تابع إضافة المعالجة المناسبة وسجل الفيديو التجريبي على فترات زمنية محددة لفترة زمنية محددة. بالنسبة لخط الخلية هذا ولمراقبة عملية الانقسام بأكملها ، استخدمنا فاصلا زمنيا مدته سبع دقائق ونصف لمدة أربع إلى خمس ساعات. سيتعين عليك تحديد الإعدادات المحددة لخط الخلية الخاص بك وما تريد دراسه.

افتح برنامج السرعة ، وقم بإنشاء مكتبة جديدة وتسميتها وقم باستيراد ملفات الفيديو التجريبية لعرض الملفات. حاول استخدام إعداد التركيز الموسع ، واضبط مقاطع الفيديو حسب الضرورة. تم تجهيز Velocity بمجموعة من الأدوات للمساعدة في تحسين جودة الصور المكتسبة.

إذا كانت الإعدادات الموجودة على المجهر مناسبة ، فستوفر الكثير من الوقت لاحقا في التحرير. غالبا ما يكون من المفيد تفويض صورك وضبط السطوع والتباين ، وستختلف احتياجاتك الخاصة بناء على تجربتك لعرض الخلايا في 3D. قم بالتبديل إلى إعداد التعتيم ثلاثي الأبعاد.

يسمح هذا بتدوير الخلايا ثلاثية الأبعاد في الفضاء ، وبالتالي توفير وجهات نظر متعددة للهياكل ذات الأهمية داخل الخلايا. افلام. يمكن تصدير الصور الثابتة إلى مجموعة متنوعة من أنواع الملفات بناء على تفضيلات المستخدم مقارنة بعناصر التحكم. شكلت خلايا الخلايا الليفية المعرضة ل CPT بؤر في غضون خمس إلى 10 دقائق وحافظت على هذه البؤر طوال مدة التسجيل.

ومن المثير للاهتمام ، في خلايا الكلى الجنينية البشرية ، ينفصل 53 BP عن الكروماتين في بداية الانقسام ، مكونا ضبابا رقيقا حول الكروموسومات المكثفة. عندما يحدث teleph وينتهي الانقسام 53 BP واحد ، يتجمع مرة أخرى في بؤر متميزة. نأمل أن يمكنك هذا الفيديو من دراسة العلاقات الزمانية المكانية للبروتينات المشاركة في استجابة تلف الحمض النووي بالإضافة إلى المسارات الأخرى.

على سبيل المثال ، في مجال ديناميكيات الكروماتين ، تم استخدام هذه التقنية لدراسة كيفية تأثير ارتباط 53 BP على حركة النهايات التيلوميرية للحمض النووي. بعد تكوين الخلايا المعدلة وراثيا ، يمكن إجراء تصوير الخلايا الحية ثنائي وثلاثي الأبعاد في حوالي أربع إلى ثماني ساعات. تأكد من ضبط إعدادات المجهر بشكل مناسب للحصول على التصوير الأمثل.