الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

الهدف العام من تجربة اختبار ربط القرب هذه هو تصور وتحديد تكوين استجابة تلف الحمض النووي وإصلاح مجمعات البروتين بعد تحريض تلف الحمض النووي في مزارع الخلايا المعلقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في إصلاح تلف الحمض النووي مثل التنظيم والتنظيم والزمان المكاني وكيفية استجابة مسارات الإصلاح المتنوعة لأنواع مختلفة من تلف الحمض النووي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها بسيطة نسبيا ، وتتطلب عددا منخفضا من الخلايا ، ولا تتطلب معالجة مكثفة ، مما قد يعطل أو يغير تفاعلات البروتين والبروتين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لإصلاح الحمض النووي ، وتكوين مركب البروتين في خلايا تعليق الثقافة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا في الخلايا الملتصقة المستزرعة ، والأنسجة المجمدة أو المدمجة في البارافين ، وحتى الكاملة. يتم استخدام خط الخلايا الليمفاوية الحادة للخلايا البائية الإيجابية BCR البشرية ، BV-173 ، في هذه الدراسة ويتم زراعته في IMDM مع مكملات عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

لإيقاف الخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية ، أضف خمسة ميكرومولار من ميثان سولفونات الأمونيوم إلى كل بئر واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2. في اليوم التالي ، أضف خمسة ميكرومولار من مثبط ATM إلى كل من البئرين وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحفيز تلف الحمض النووي عن طريق إضافة 50 نانوغرام لكل مليلتر من NCS إلى أحد الآبار التي تمت معالجتها مسبقا بمثبط ATM وإلى بئر آخر لم تتم معالجته مسبقا.

احتضن لمدة ساعتين. قم بإعداد 1XPBS بالإضافة إلى 10٪ BSA عن طريق وضع طبقات من خمسة جرامات من الكسر -5 BSA فوق 50 مل من 1XPBS في دورق واتركه في درجة حرارة الغرفة دون رج أو تقليب حتى يذوب BSA. قم ببطء بتصفية PBS بالإضافة إلى محلول BSA 10٪ من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد.

حصاد الخلايا ، ونقل محتويات كل بئر إلى أنبوب سعة 15 مل. اغسل الخلايا مرتين بالثلج البارد 1XBPS. بعد عد الخلايا ، أعد التعليق في مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في 1XBPS بالإضافة إلى 10٪ BSA.

حافظ على الخلايا على الجليد. قم بإعداد شرائح الفحص المجهري لهذا الإجراء عن طريق تلميعها بعناية بأنسجة خالية من النسالة وإزالة الشحوم منها عن طريق وضع 96٪ من الإيثانول في وعاء كوبلين لمدة خمس دقائق. دع الشرائح تجف في الهواء لمدة 10 دقائق.

قم بتجميع شرائح الفحص المجهري في مسارات علم الخلايا السيتوبين بمساحة ستة ملليلتر. قم بتغطية الشرائح مسبقا عن طريق سحب 50 ميكرولترا من 1XPBS بالإضافة إلى 10٪ BSA في كل قمع وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 500 دورة في الدقيقة. إلى كل قمع ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

بتفكيك القمع بعناية وتأكد من عدم لمس البقع الموجودة على الشرائح. استخدم مانع سائل قلم عنق الرحم بطرف خمسة ملليمترات لرسم دائرة حول كل بقعة. ثم أضف 50 ميكرولترا من محلول تثبيت PFA بنسبة 4٪ إلى كل بقعة.

واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا باستخدام 1XPBS في وعاء كوبلين في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف. اغسل ثلاث مرات بهذه الطريقة لمدة خمس دقائق في كل مرة.

جفف الشرائح حول البقع بمنديل خال من النسالة وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من البقع عن طريق إمالة الشريحة وتجفيفها بمنديل خال من النسالة. أضف 50 ميكرولترا من 0.25٪ Triton X في 1XPBS إلى كل بقعة واحتضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. اغسل الشرائح في 50 إلى 60 مل من TBS-T في وعاء Coplin في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.

ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. قبل الحظر ، اضغط على TBS-T وجفف الشرائح حول البقع بمنديل خال من النسالة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من البقعة.

بتدوير محلول الحجب لفترة وجيزة ثم أضف قطرة واحدة من حوالي 40 ميكرولترا إلى كل بقعة. ضع الشرائح في غرفة رطبة دافئة مسبقا واحتضانها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تحضير كوكتيلات الأجسام المضادة.

دوامة ثم ماصة مخفف الأجسام المضادة التجارية في كل أنبوب ميكروفيوج. أضف الجسم المضاد للماعز المضاد لأجهزة الصراف الآلي عند 1: 1000. والأرانب المضادة للفوسفوسيرين -15 p53 في الساعة 1:100.

لتجارب التحكم في الأجسام المضادة المفردة ، قم بإعداد تخفيفات الأجسام المضادة التي تحتوي فقط على الجسم المضاد للماعز المضاد ل ATM والجسم المضاد للأرانب فقط المضاد للفوسفوسيرين -15 p53. عند الانتهاء من الحضانة لمدة ساعة واحدة ، اضغط على محلول الحظر ولكن احرص على عدم ترك الخلايا تجف. أضف 30 ميكرولترا من كل تخفيف كوكتيل للأجسام المضادة واحتضنه في غرفة رطبة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، اغسل الشرائح باستخدام 1X NC2 washbuffer A في وعاء Coplin في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد غسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل ، قم بإخراج مخزن الغسيل من الشرائح وأضف 30 ميكرولترا من خليط مسبار فحص ربط القرب إلى كل بقعة. احتضن عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة دافئة مسبقا لمدة ساعة واحدة.

اغسل الشرائح ب 50 إلى 60 مل من محلول الغسيل A في وعاء كوبلين في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول ربط ligase على الجليد عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من ligase إلى 39 ميكرولترا من محلول الربط لكل بقعة. أضف 40 ميكرولترا من محلول ربط ليغاز إلى كل بقعة.

احتضن عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة دافئة مسبقا لمدة 30 دقيقة. اغسل الشرائح بمحلول غسيل A في وعاء كوبلين في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف. تحضير خليط بوليميراز التضخيم على الثلج.

قم أولا بتخفيف محلول مخزون التضخيم من واحد إلى خمسة في الماء. وأضف 0.5 ميكرولتر من البوليميراز إلى 39.5 ميكرولتر من محلول التضخيم 1X لكل بقعة. اضغط على مخزن الغسيل وأضف 40 ميكرولترا من خليط بوليميراز التضخيم لكل بقعة.

احتضان عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة دافئة مسبقا لمدة 100 دقيقة. عند الانتهاء من الحضانة لمدة 100 دقيقة ، اضغط على خليط بوليميراز التضخيم واغسل الشرائح باستخدام 1X NC2 المخزن المؤقت للغسيل B في جرة كوبلين. في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح في 0.01x washs buffer B لمدة دقيقة واحدة. اضغط على المخزن المؤقت للغسيل الزائد B وجفف الشرائح حول البقع بمنديل خال من النسالة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من البقعة.

قم بإعداد وسيط تركيب يحتوي على DAPI لا يفرط في تلطيخ النوى عن طريق تخفيف DAPI الذي يحتوي على وسيط تركيب 1: 5 في وسط التركيب بدون DAPI. أضف 25 إلى 30 ميكرولترا من وسيط التركيب المخفف الذي يحتوي على DAPI إلى زلة غطاء 24 ملم × 24 ملم. التقط زلة الغطاء مع الشريحة واضغط قليلا لضمان عدم وجود فقاعات هواء محاصرة.

أغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر وانتظر 15 دقيقة على الأقل قبل التصوير. أخيرا ، قم بتصوير وتحليل الشرائح باستخدام مجهر مضان متحد البؤر. تم استخدام مقايسة ربط القرب للتحقيق في التفاعل بين أجهزة الصراف الآلي والفوسفوسيرين 15 p53 في BV 173 الخلايا الإيجابية البشرية القادرة على BCR التي تم القبض عليها في مرحلة G1.

على عكس الخلايا التي لم يتم علاجها باستخدام NCS للحث على تلف الحمض النووي ، فإن غالبية الخلايا المعالجة ب NCS لديها إشارات ثقبية حصريا في النواة بمتوسط سبع إشارات لكل خلية. يشير هذا إلى أن تحريض تلف الحمض النووي يؤدي إلى التفاعل بين ATM والفوسفوسيرين 15 ص 53. تؤدي المعالجة المسبقة للخلايا بمثبط كيناز ATM محدد قبل تحريض تلف الحمض النووي إلى تقليل عدد الإشارات إلى متوسط إشارتين لكل خلية مما يؤكد أن فسفرة p53 في بقايا سيرين 15 كانت تعتمد على نشاط كيناز ATM

لم تسفر تجارب التحكم في الأجسام المضادة الفردية التي ينبعث فيها الجسم المضاد المضاد للفوسفوسيرين 15 p53 عن أي إشارات كما هو متوقع. يعرض هذا الشكل القياس الكمي والتحليل الإحصائي للنتائج التي توضح وتؤكد خصوصية تقنية فحص ربط القرب على مستحضرات تدور الخلوي لمزارع الخلايا المعلقة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي خمس ساعات بعد الحضانة الليلية بجسم مضاد أساسي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معايرة الجسم المضاد بعناية عن طريق تلطيخ التألق المناعي للخلايا التي تهمك قبل إجراء فحص ربط التقارب. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في بيولوجيا الخلية لاستكشاف تفاعلات بروتين البروتين العابرة التي يصعب تقييمها باستخدام الطرق القياسية مثل الترسبات المناعية والتصوير القائم على FRET والذي غالبا ما ينتج عنه قطع أثرية تقنية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة ربط القرب على مزارع الخلايا المعلقة لتصور تفاعل بروتين البروتين في الموقع وتحديده.