تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات

توضح هذه التجربة بالتفصيل كيفية الحصول على بلورات جودة الحيود لبروتين مرتبط بالحمض النووي يحتوي على تنحنح ترادفي ميثيليته. GATC. كرر لصالح التعبئة البلورية لمركب البروتين الحمض النووي. ابدأ بالتصميم العقلاني لطول الحمض النووي ، وتباعد GATC ونهايات الحمض النووي تستمر مع قليل النوكليوتيدات التكميلية المفردة التي تقطعت بهم السبل لتنقية الحمض النووي ثم أنيل لتشكيل ثنائي الحمض النووي الميثيل hemi ، ثم امزج في التسلسل المنقى A لتشكيل المركب.

بعد ذلك ، ابحث عن الظروف المثلى لزراعة بلورات جودة الحيود لمركب الحمض النووي البروتيني من خلال تجارب التبلور باستخدام شاشات المصفوفة التجارية المتناثرة. نتائج مثبتة. شارك تأثير تفاوتة طول الحمض النووي بين تباعد GATC والنهايات على جودة حيود بلورات الحمض النووي CQ A.

الهدف من هذا العمل هو الحصول على بلورات جودة الحيود من CK المرتبطة بالحمض النووي ، ولكن يمكن أن يساعد أيضا في فهم المتغيرات العامة التي يجب مراعاتها عند تصميم ثنائي الحمض النووي لبلورة مجمعات الحمض النووي البروتينية الأخرى التي توضح أن هذا الإجراء سيتم استخدامه في Chang ، A لزميل الدكتوراه من مختبري. تستخدم هذه الدراسة نوعا مختلفا من البروتينات التنظيمية لتكرار الحمض النووي. ابحث عن أ يشكل ثنائيات مستقرة وله منطقة رابط مختصرة بين نطاقات ربط الحمض النووي ونطاقات ربط الحمض النووي.

يقيد هذا المتغير ارتباط الحمض النووي بتكرارات GATC الترادفية مفصولة حصريا بدورة واحدة على الحمض النووي أولا تحويل BBL 20 1D ثلاث خلايا مع ترميز البلازميد DEMETRIC seq A تحت سيطرة لوحة المحفز T السبعة. تفاعل التحول على ألواح أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر ، أمبيسلين ووضعها في الحاضنة البكتيرية طوال الليل. اختر مستعمرات مختلطة وابدأ ثقافة صغيرة بين عشية وضحاها.

في صباح اليوم التالي ، مزرعة لتر واحد مع 10 ملليلتر من اللقاح بين عشية وضحاها. عندما تكون الثقافة في مرحلة السجل ، أضف ملليلترين من 0.5 مولار IPTG للحث على إنتاج البروتين. استمر في الحضانة لمدة ثلاث ساعات في شاكر مداري بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

ثم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3 ، 300 جم لمدة 10 دقائق. ريس ، تعليق لوحة الخلايا في التنقية ، وقم بتخزين الأكاذيب عن طريق الصوتنة ومسح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 39 ، 000 مرة G لمدة 40 دقيقة. الآن قم بتحميل المادة الطافية S على عمود الهيبارين متوازن مع مخزن مؤقت للتنقية.

لتخلص بروتين CK. استخدم تدرجا خطيا لبروتين CK كلوريد الصوديوم المولي عند حوالي 0.7 مولي كلوريد الصوديوم. اسحب الكسور المحتوية على CK وقم بتخفيفها لتقليل قوة الأيونات للعينة.

ثم قم بتحميل العينة في عمود كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني E الذي يساوي المخزن المؤقت للتنقية. ضع تدرجا خطيا للملح لحلقة بروتين CK النقي عند حوالي 0.4 مولي كلوريد الصوديوم. اجمع بين الكسور المحتوية على CK.

ركز إلى ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر وتخزينها في التخزين. تصميم عازلة مجاني غير ميثيل وقليل النوكليوتيدات الميثيلية. قم بإعداد عينات من ميكرومول واحد من كل حمض نووي أحادي الجفف بالتجميد في 800 ميكرولتر من الأوتوكلاف ، ودوامة الماء المقطر المزدوجة واتركها جانبا لمدة 15 دقيقة الآن و 800 ميكرولتر.

قم بتسخين مخزن مؤقت مرتين لكل عينة لمدة 20 إلى 30 نيوكليوتيدات قليلة النوكليوتيدات الطويلة لإعداد هلام كبير لتغيير طبيعة الشمس بنسبة 10٪. بمجرد البلمرة ، قم بإزالة المشط واشطف البئر جيدا. قم بتجميع الجل الذي يملأ الخزانات العلوية والسفلية بمخزن مؤقت يعمل TBE مرة واحدة.

قم بتشغيل الجل مسبقا عند 750 فولت لتسخين الجل إلى 55 درجة مئوية. ثم أوقف الجري واشطف الآبار جيدا باستخدام عازلة قيد التشغيل. الآن قم بتسخين قليل النوكليوتيدات إلى 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

دوامة وتدور. تمضي العينات على الفور في تحميل الجل. قم بتشغيل الجل عند حوالي 700 فولت حتى يهاجر قليل النوكليوتيد.

في منتصف الطريق على هلام بولي أكريلاميد 10٪ ، يهاجر ألف فينول الأزرق مع قليل النوكليوتيدات بطول حوالي 20 قاعدة وزيلين سيل ff بطول حوالي 60 قاعدة. قم بتفكيك الجل من الجهاز وإزالة الفواصل على سطح مستو. قم بإزالة لوح زجاجي واحد وقم بتغطية الجل بغلاف بلاستيكي.

ثم اقلب الجل ، وقم بإزالة اللوح الزجاجي الآخر وقم بتغطية الجل بغلاف بلاستيكي. بعد ذلك ، ضع علامة على العصابات باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية ولوحة الفلورسنت خلف الجل. لرؤية ظل الحمض النووي بشفرة حلاقة ، قم باستئصال الشريط وتقطيعه إلى قطع صغيرة.

انقل كل عينة إلى أنبوب معقم سعة 15 مل. أضف تسعة ملليلتر من المخزن المؤقت الإيلوسي وخففه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التحريض. انقل المحلول بعناية إلى أنبوب الطرد المركزي الأوتوكلاف باستخدام طرف ماصة تحميل الجل.

لتجنب نقل قطع الأكريلاميد ، أضف ملليلترا واحدا من ثلاثة مللي من أسيتات الصوديوم درجة الحموضة سبعة بالإضافة إلى 25 مل من الإيثانول المبرد بنسبة 100٪ تحتضن عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ثلاث ساعات على الأقل. الطرد المركزي الحمض النووي المترسب. ثم جفف الكريات على سرعة التفريغ على حرارة متوسطة ، وأعد تعليق كل حبيبات في 400 ميكرولتر من الأوتوكلاف ، والماء المقطر المزدوج ونقلها إلى أنبوب جديد.

أضف 40 ميكرولترا من أسيتات الصوديوم المولية الثلاثة عند درجة الحموضة سبعة ومليلتر واحد من دوامة الإيثانول 100٪ واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر بعد الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 18،000 مرة. G, شطف حبيبات الحمض النووي مع 100 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول البارد لإزالة أي تدور ملح متبقي لمدة ست دقائق في 18, 000 مرة. ثم تخلص G من الإيثانول وجفف الحبيبات على فراغ سريع.

الآن أعد إرسال كل بيليه في 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج الأوتوكلاف. تحديد تركيز قليل النوكليوتيدات عن طريق قياس الطيف. لتحضير ثنائي الحمض النووي الميثلي hemi ، قم أولا بخلط تركيزات مولو متساوية من الخيوط المفردة التكميلية.

ثم سخني الخلطات إلى 95 درجة مئوية في حمام مائي لمدة خمس دقائق لإزالة الخيوط. دع العينات تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة داخل الحمام المائي. اجمع بين كميات متساوية من 81 ميكرومولار منقى CQ a بروتين و 81 ميكرومولار من الحمض النووي الميثيلي.

ثم احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. يحفظ على حرارة أربع درجات مئوية حتى يستخدم الشاشة لظروف التبلور باستخدام شاشات مصفوفة تجارية متناثرة. بمجرد تحديد خيوط التبلور الأولية ، قم بتحسين الظروف لنمو بلورات جودة الحيود للبكاء وحماية بلورات الحمض النووي CK الناتجة.

إما زيادة كمية PEG 400 الموجودة في محلول التبلور إلى تركيز نهائي قدره 25٪ أو إضافة 20٪ جلسرين إلى محلول التبلور. استخرج البلورات الفردية باستخدام فلاش حلقة النايلون. تجميد العينات في النيتروجين السائل.

الآن اختبر حد حيود كل بلورة عند 100 كلفن. للحصول على التركيب البلوري للطفرة المختصرة ل CK المرتبطة بالحمض النووي الميثيلي Hemi ، نقوم على التوالي بتحسين ثلاث معلمات على الحمض النووي ، والتباعد بين تسلسلات GATC الميثيلة Hemi ، وطول الازدواج وغياب أو وجود خمسة نتوءات رئيسية. تستخدم هذه الدراسة متغيرا DME للبحث مع طفرة نقطية في المجال الطرفي النهائي يمنع المزيد من الرباط والرابط القصير الذي يقيد ارتباط الحمض النووي بالترادف.

تكرارات GATC المفصولة حصريا بدورة واحدة على فحوصات تحول الحركة الكهربائية للحمض النووي إلى أن بروتين CK المعدل يربط بشكل تفضيلي تكرارات GATC مفصولة بتسعة إلى 10 أزواج قاعدية. لذلك ، تستخدم الشاشات الأولية دوبلكس من 23 إلى 24 زوجا أساسيا بطول يحتوي على اثنين من الميثيلات. يكرر GATC مفصولة إما بتسعة أو 10 أزواج قاعدية.

أسفرت ثلاثة دوبلكس عن بلورات ذات شكل جيد. في حين أن أيا من البلورات لم تنحرف إلى دقة عالية. أشارت البيانات إلى أن فصل A-G-A-T-C لتسعة أزواج قاعدية كان مفضلا للتبلور مما يعزز بشكل غير متوقع تفاعلات العمود الفقري للأخدود من خلال تضمين ثنائي النوكليوتيد CG بين موقعي GATC لم يغير حد حيود البلورات.

على النقيض من ذلك ، أدى تحسين طول الأجزاء المتدلية إلى تغيير التلامسات الجزيئية والتشكل البلوري بشكل كبير. أكد التركيب البلوري لبروتين CK المرتبط بثنائي الحمض النووي الميثيلي أن الوجه الحر للحمض النووي المزدوج لا ينخرط في اتصالات بلورية على الرغم من الحجم النسبي للبروتين والحمض النووي ، فإن معظم التفاعلات بين رفقاء التماثل يتم التوسط فيها تفاعلات البروتين والبروتين والبروتين. ومن المثير للاهتمام ، في هذه الحالة بالذات ، أن التأثير المفيد لخمسة ثنائي النوكليوتيدات الأولية لا يرجع إلى تكوين حمض نووي مستمر زائف.

بدلا من ذلك ، فإن الطرف الأساسي الخمسة للخيط الميثيلي يبرز بعيدا عن محاور الحمض النووي ويتفاعل مع جزيء CK القريب للمركب ، مما يفسر سبب الحاجة الصارمة إلى اثنين من النيوكليوتيدات لتغيير العبوة البلورية بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية البروتينات وتصميم ثنائيات الحمض النووي لبلورة مركب الحمض النووي للبروتين. من المهم أن تتذكر أنه على الرغم من أن هذا البروتوكول كان جهازا لبلورة مركب الحمض النووي CK ، إلا أن التحسين العقلاني لتسلسل طول الحمض النووي ونهاياته يوفر إطارا عاما لتصميم دوبلكس الحمض النووي لبلورة مجمعات الحمض النووي البروتينية الأخرى.