متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام نهج متعدد الأهداف للتحديد المنظم للبروتين المستهدف عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية ، بدءا من جين واحد أو تسلسل جيني واحد فقط في الحالة المعروضة هنا. البروتين المستهدف هو الوحدة الفرعية PB اثنين من البوليميراز من الأنفلونزا A ، وهو مكون رئيسي لتكاثر الفيروس. يتم تحقيق نهج الأهداف المتعددة من خلال تصميم واستنساخ سلسلة من التركيبات الجينية بالتوازي بناء على التسلسل المستهدف الفردي والمعلومات الأخرى المعروفة عن البروتين.

الخطوة الثانية هي اختبار مستويات التعبير لكل بناء واختيار أفضلها للتعبير عن البروتين على نطاق واسع في زراعة الخلايا. تتطلب الخطوة التالية كسر الخلايا المفتوحة لإزالة البروتينات المستهدفة من مادة التعبير وتكرير كل منها إلى نقاء عال جدا. ثم يتم إعداد سلسلة من تجارب التبلور مع كل بروتين للحصول على شكل بلوري مناسب لدراسات الأشعة السينية.

ثم يتم جمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الدقة على بلورة واحدة أو أكثر واستخدامها لحل وتحسين خريطة كثافة الإلكترون التي تحدد بنية كل بروتين مستهدف. تسمح هذه النتائج بتقديم بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين المستهدف بناء على خريطة كثافة الإلكترون. تزيد المعالجة متعددة الأهداف بشكل كبير من احتمالية النجاح في التحديد المنظم من خلال توفير بدائل قابلة للتطبيق في كل عقبة محتملة في المسار.

يعد العمل على أهداف متعددة بالتوازي أيضا كفاءة عالية ، مما يقلل من الوقت والتكلفة لكل بروتين في كل خطوة. ستسمح إمكانية زيادة معدل اكتمال التحديد المنظم للأهداف القابلة للدواء بمزيد من فرص تطوير العلاج سنويا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في علم الأحياء الهيكلي ، إلا أن البروتين عالي الجودة الذي يتم الحصول عليه من خلال هذه الطرق يمكن أن يدعم أي تحقيق قائم على البروتين.

كل مرحلة من مراحل العملية لها علمها الخاص وتتطلب خبرتها الخاصة ، لكن الاستثمار في أجهزة الأشخاص والمعرفة الفنية يمكن أن يؤتي ثماره بشكل جميل بمجرد تجميع جميع القطع. بمجرد اختيار الجين المستهدف والمنتج الجيني للتحقيق ، تتطلب الخطوة الأولى تصميم متغيرات أو تركيبات جينية متعددة. يتم استخدام برنامج مؤلف الجينات لتصميم هذه التركيبات على مستوى البروتين جنبا إلى جنب مع الكود المرتبط بتسلسلات الجينات الاصطناعية الهندسية.

باستخدام وحدة عارض المحاذاة ووحدة تصميم البناء ، قارن محاذاة تسلسل البروتين وحدد تصميم تركيبات البروتين ، وإدخال البرتيمير المتسلسل وناقل PCR البادئات الطرفية أو الأمبيرات. بعد ذلك ، استخدم خوارزمية بروتين المؤلف الجيني إلى الحمض النووي لترجمة كل تسلسل من الأحماض الأمينية إلى رمز على تسلسل الحمض النووي المصمم هندسيا. استخدم التعليمات البرمجية المناسبة في جدول الاستخدام لتحسين تسلسل التعبير في سطر خلية معين.

في هذه الحالة ، بكتيريا الإشريكية القولونية. بمجرد أن يصبح التسلسل الجيني المستهدف جاهزا ، قم فعليا باستنساخ الجين وإدخاله في بلازميد ناقل مناسب للتعبير البكتيري. في هذه الحالة ، ناقل PET 28 المعدل.

يحتوي هذا المتجه على مكونات معينة ضرورية للتعبير وتنقية البروتين. يتم تعديل الجين المستهدف لدمج تسلسل علامة الهيستامين إما في الطرف N أو C للبروتين وتسلسل الانقسام للسماح بإزالة العلامة أثناء التنقية. يمتلك الناقل أيضا جينا لمقاومة المضادات الحيوية لاختبار التعبير والتخمير.

ثم يتم إنشاء كل تسلسل جيني للبروتين المستهدف بواسطة طرق تخليق الجينات القياسية استعدادا لاستنساخ الأنابيب ، أو استنساخ الامتداد الأولي غير المكتمل ، أو استنساخ الأنابيب هو استراتيجية استنساخ قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل حيث يتم تضخيم الجين المستهدف باستخدام بادئات مكملة للناقل المقصود. تستغل هذه الطريقة الطبيعة غير المكتملة لتفاعل البوليميراز المتسلسل في المرحلة المتأخرة ، والتي تترك منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع أطراف متغيرة أحادية الشريط. أقوم بإعداد إدخال PCR أو IPCR عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات لكل من الاشعال الأمامية والخلفية لكل تفاعل.

في صفيحة 96 بئر وفقا لخريطة اللوحة ، أضف ميكرولترين من كل جين اصطناعي كامل الطول إلى البئر المناسب وفقا لخريطة اللوحة. بعد إضافة 25 ميكرولترا من مزيج PFU الرئيسي لكل منها ، قم بتدوير التفاعلات جيدا 25 مرة باستخدام شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية. تشوه طبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

أنيل عند 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ويمتد عند 68 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. يتم تأكيد تضخيم الشظايا من خلال تحليل هلام AGROS لمنتجات IPCR. يتم تمثيل منتجات IPCR الناجحة بنطاقات قوية.

غالبا ما ينظر إلى النتائج غير المرغوبة على أنها عصابات باهتة أو ملطخة في تفاعل منفصل. يتم تضخيم التعبير البلازميد عن طريق متجه PCR أو تضخيم شظية VPCR من خلال تحليل هلام AROS لمنتجات VPCR. بمجرد تضخيم منتجات IPCR و VPCR ، تتم إضافتها إلى لوحة دمج ووضعها في جهاز تدوير حراري لتفاعل الدمج.

ثم يتم تحويل التركيبات المستنسخة بنجاح إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا وتخزينها في سيقان الجلسرين لبدء خط اختبار التعبير. كمية صغيرة من كل عينة من مخزون الجلسرين من البناء المستنسخ على صفيحة أجار منفصلة. اللوحة مصنوعة من مرق المغذيات البكتيرية وعلامة المضادات الحيوية كاناميسين المشفرة في الناقل تحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي.

ابدأ زراعة مسبقة لكل عينة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من طبق الأجار المزروع حديثا. استخدم هذه المستعمرة لتلقيح 1.2 مل من مرق السل المكمل بعلبة المايسين والجلوكوز للمعالجة المتوازية. تزرع كل ثقافة مسبقة في كتلة سفلية مستديرة 96 بئر.

تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بمعدل 220 دورة في الدقيقة. بعد النمو بين عشية وضحاها. ابدأ الثقافات التعريفية الصغيرة لكل عينة باستخدام 40 ميكرولترا من الثقافة المسبقة للتلقيح.

1.2 مل من مرق السل. مكمل ب 50 ملليغرام لكل مليلتر من علبة مايسين ونظام نوفاجين السريع بين عشية وضحاها. أولا ، قم بزراعة المزارع الحثية عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، مع الرج عند 220 دورة في الدقيقة من خلايا الحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 4،000 وحدة GForce لمدة 15 دقيقة.

اسكب المادة الطافية وقم بتخزين الكريات عند سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل مزيد من المعالجة بعد التنقية. تحليل البروتين مع أو بدون تفاعل الانقسام عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري باستخدام نظام CHIP 90 لمختبر الفرجار وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. في حالة الأنفلونزا ، أدت الوحدة الفرعية للبروتين PB 14 من 34 إلى بروتين مستهدف قابل للذوبان ودخلت الخطوة التالية ، التخمير على نطاق واسع.

لبدء التخمير على نطاق واسع ، قم بتلقيح 100 مل من مرق زراعة الخلايا البكتيرية الذي يحتوي على 50 ملليغرام لكل ملليلتر. هل يمكن أن ينمو المايسين من مخزون الجلسرين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية؟ اهتز عند 220 دورة في الدقيقة في اليوم التالي ، قم بتوسيع الثقافة المسبقة باستخدام 10 ملليلتر للتلقيح.

لتر واحد من المرق الذي يحتوي على وسائط تحريضية تلقائية و 50 ملليغرام لكل مليلتر أن يكون الميسين في قارورة محيرة سعة لترين. هز الثقافات الموسعة عند 37 درجة مئوية كل 30 دقيقة تقريبا. تحقق من الكثافة البصرية للثقافة عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي يبلغ 600 نانومتر.

عند الوصول إلى كثافة بصرية تبلغ 0.6 ، قم بتغيير درجة حرارة حاضنة الاهتزاز إلى 20 درجة مئوية بعد وقت النمو المطلوب. قم بإزالة رباعي علي 10 ملليلتر من كل بنية لاختبار التعبير. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 GForce لمدة 15 دقيقة.

اسكب المادة الطافية وجميد حبيبات الخلية عند سالب 80 درجة مئوية. لبدء هذا الإجراء ، قم بإذابة وإعادة تعليق معجون الخلية في مخزن التحلل بنسبة حجم رئيسي من واحد إلى خمسة. يقلب بقوة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

استخدم ملعقة نظيفة لكسر القطع من جانب الدورق قم بتحليل الخلايا ميكانيكيا على الجليد باستخدام صوتنة الماسونية. قم بتوضيح المحللة الخام عن طريق الطرد المركزي عند 18,000 وحدة GForce لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

اجمع المادة الطافية واحتفظ بكمية صغيرة للتحليل قبل الشروع في التنقية على نطاق واسع. تأكد من التعبير البروتيني على نطاق واسع لكل مزرعة عن طريق تحليل هلام صفحة SDS. تظهر نتيجة صفحة SDS التمثيلية هذه تعبيرا قويا عن البروتين ، وقابلية للذوبان بنسبة 50٪ تقريبا وحوالي 50٪ من الانقسام.

في هذه الحالة ، تمت إزالة علامة الهيستيدين جنبا إلى جنب مع علامة ذوبان البروتين المضافة ، والتي تم تصميمها في البناء الأصلي. يستخدم راتنج النيكل لفصل البروتين المستهدف بعلامة الهيستامين الفريدة عن جميع المواد الخلوية الأخرى بما في ذلك البروتينات البكتيرية الأصلية. يتم تحضير عمود واحد من النيكل عن طريق الغسيل بأربعة أحجام أعمدة من ماء UE لإزالة المخزن المؤقت للتخزين متبوعا بحجم عمود واحد من المخزن المؤقت B وخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت.

يتم إجراء التوازي في توازن A ل E باستخدام صانع البروتين ، القادر على تشغيل أعمدة متعددة في وقت واحد. قم بتحميل كل محللة موضحة تحتوي على بروتين قابل للذوبان مع علامة الهيستامين في عمود منفصل بمعدل ملليلترين في الدقيقة ، متبوعا بعدة غسلات لحجم الأعمدة مع المخزن المؤقت A ، وجمع التدفق من خلال المخزن المؤقت وحفظه للتحليل. قم بإزالة البروتين المرتبط في سلسلة من التدرجات التدريجية مع المخازن المؤقتة A و B عند 95 إلى خمسة 60 إلى 40 ، وأخيرا 100٪ buffer B. تتنافس المكونات الموجودة في المخزن المؤقت B مع الهيستامين على راتنج النيكل وبالتالي إزالة البروتين من العمود بنسبة معينة.

اجمع كل جزء شطف على حدة. يتم عرض نتيجة الكروماتوغرام التمثيلي من التشغيل على عمود واحد من النيكل هنا. يحلل النيكل واحدة يستعصى كسور, الخام محللة, ال يكرر محللة, والنيكل واحدة يتدفق كليا ب [سدس] صفحة ويقارن مع ال [أوف] امتصاص في 280 [نومتر] يجمع أثناء العمود تنقيه.

تحدد هذه الخطوة ما إذا كانت عملية التنقية ناجحة أم لا. حدد وتجمع الكسور التي تحتوي على البروتين المستهدف للمضي قدما لمزيد من المعالجة. احسب الكمية الإجمالية للبروتين في هذه المرحلة باستخدام معامل الانقراض النظري للبروتين ، وقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر واحتساب الحجم الكلي للكسور المجمعة.

احفظ عينة صغيرة للتحليل. تم ترميز الجين للبروتين المستهدف بتسلسل معين ، والذي تم التعرف عليه بواسطة ULP واحد كموقع انقسام ، وبالتالي يؤدي إضافة ULP واحد إلى الانقسام بين علامة الهيستيدين والبروتين محل الاهتمام. لبدء هذا الإجراء ، أضف ميكرولتر واحد من اليوبيكويتين مثل البروتياز ، واحد لكل خمسة ملليغرامات من البروتين الموجود في الكسور المجمعة.

في هذه المرحلة ، يتم نقل البروتين المشقوق من العازلة B إلى المخزن المؤقت A لمزيد من المعالجة باستخدام أنابيب غسيل الكلى ، وغسيل البروتين مقابل لترين من المخزن المؤقت ، A لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية مع التحريك. استخدم قطعا للوزن الجزيئي 10 كيلودالتون ل PB اثنين بعد غسيل الكلى. قم بتشغيل هلام صفحة SDS آخر للبروتين المستهدف مع وجود ULP وبدون ULP.

سيحدد هذا ما إذا كان الانقسام الواحد ل ULP ناجحا ويسمح باختيار أفضل الكسور للمضي قدما لمزيد من المعالجة. تظهر هنا نتائج صفحة SDS التمثيلية الخاصة بنا لثلاثة تركيبات من البوليميراز pb. توجد علامتان للوزن الجزيئي للوحدة الفرعية في الممر الأول.

الممرات اثنان وستة و10 مجمعة بروتينات من النيكل واحد أعمدة. تحتوي الممرات الثالثة والسبعة و11 على تدفق البروتين المشقوق في المخزن المؤقت A من النيكل الثاني والممرات الأربعة والثمانية و12. إظهار إزالة علامة الهيستامين في المخزن المؤقت B من النيكل الثاني.

بعد إزالة الهيستامين ، تتركز الكسور المجمعة من النيكل اثنين. لبدء SEC ، يجب اختيار الراتنج المناسب مرة أخرى بناء على الوزن الجزيئي للهدف في هذه الحالة ، يتم استخدام عمود acere S 110 على 30 GL وموازنته مع 200 مل من المخزن المؤقت SEC بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر ، قم بتحميل العينة في حلقة عينة سعة 10 ملليلتر وابدأ تشغيل عمود SEC. راقب الكروماتوجرام الماص للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر أثناء جمع كسور صغيرة الحجم.

قم بتشغيل جميع كسور SEC ذات الصلة عبر صفحة SDS. يتم إجراء النهج القياسي لتجارب تبلور البروتين بطريقة إسقاط الجلوس التي تتضمن انتشار البخار. ليس من غير المألوف إعداد شاشتين أو أكثر من شاشات المصفوفة المتناثرة في البداية لكل بروتين مستهدف.

لبدء هذه العملية ، املأ مسبقا كل خزان من لوحة تبلور صغيرة مدمجة 96 بئر ب 80 ميكرولترا لكل حالة في شاشة التبلور المحددة ، وقم بتوزيع 0.4 ميكرولتر من البروتين في مخزن SEC المؤقت في كل من الآبار البالغ عددها 96. ثم أضف 0.4 ميكرولتر من شاشة التبلور ، مما يضمن الخلط الكامل للقطرة في كل منها. قم بتغطية المبتذل بالكامل بشريط سقف شفاف تماما ، مما يضمن إحكام الإغلاق الكامل على كل بئر لتخزين اللوحة عند 16 درجة مئوية في مكان غير مضطرب خال من الاهتزازات البيئية.

تحقق من تبلور البروتين بشكل دوري خلال الأسابيع القليلة المقبلة تحت المجهر التشريح. إذا لم تظهر بلورات البروتين ، فقم بتعيين أطباق جديدة بظروف مختلفة وقم بتغيير تركيز البروتين في القطرة النهائية لزيادة احتمالية النجاح قبل الحصاد. قم بتبريد قرص على غرار A LS في فاعل مليء بالنيتروجين السائل وقم بتغطيته بغطاء لبدء الحصاد.

قم بقص الشريط الشفاف الذي يغطي البئر ببلورة البروتين المستهدفة إلى مكان قريب فارغ. حسنا ، أضف 1.6 ميكرولتر من حالة التبلور المقابلة واجمعها مع 0.4 ميكرولتر من جلايكول الإيثيلين. محلول 20٪ إيثيلين جلايكول في حالة التبلور يحمي بلورة البروتين.

أثناء التجميد بالتبريد ، قم بتحليل البلورة تحت المجهر وحدد حلقة تبريد مناسبة للحصاد ، مع مطابقة القطر الداخلي للحلقة مع أقصى عرض للبلورة. قم بتوصيل حلقة التبريد بعصا بلورية مغناطيسية وقم بلف البلورة مباشرة من محلول البئر. اغمس حلقة التبريد على الفور مع البلورة المحصودة في مادة واقية من التبريد ثم اغمرها في قرص LS على غرار LS.

للوميض ، قم بتجميد الكريستال المتكرر للحصول على العدد المطلوب من البلورات. بمجرد اكتمال الحصاد ، استخدم عصا عفريت لوضع غطاء مغناطيسي على القرص الذي يحتوي على بلورات مجمدة وميضة بألسنة مثنية. اقلب القرص رأسا على عقب للخطوة التالية.

قم بربط دافع عفريت على القرص ، ثم انقل القرص إلى ممثل KU واستخدمه لكمة الغطاء. تظل البلورات الموجودة في القرص مجمدة في حمام نيتروجين سائل حتى تصبح جاهزة لدراسات حيود الأشعة السينية باستخدام برنامج الحصول على الصور J Director. قم بإعداد المعلمات التالية لشق شعاع الغربلة البلورية عند مسافة كاشف 0.5 درجة من 50 ملم خطوة الصورة عند 70 درجة وطول التعريض الضوئي 30 ثانية.

فيما يلي مثال على لقطة شاشة من برنامج الحصول على الصور أثناء فحص البلورة ، تظهر اللوحة المركزية حيود الأشعة السينية المرصود من بلورة تمثيلية تجمع صورا كافية بدقة عالية لمجموعة بيانات كاملة مطلوبة لتحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد. نتج عن استراتيجيات الاستنساخ وتنقية البروتين الموضحة في هذا الفيديو 14 عينة PB منقاة أسفرت تسع منها عن بلورات مناسبة لدراسات الحيود. تم جمع مجموعة بيانات حيود الأشعة السينية الداخلية على خمسة من التركيبات التسعة مع إشعاع ألفا QK باستخدام مولد الأشعة السينية الأنود الدوار FRE فائق السطوع ، والمجهز ب ossec variax hf ، وبصريات HF ، وكاشف Saturn 944 plus CCD.

هنا صورة حيود الأشعة السينية لوحدتين الفرعيتين من البوليميراز PB. تمت معالجة كل مجموعة بيانات وتم تحديد ما مجموعه أربعة هياكل من وحدتين فرعيتين من PB. تمت مراجعة كل هيكل من قبل الأقران وتحميله على بنك بيانات البروتين للوصول العام.

يوضح هذا الشكل مخططات شريطية للجزيئات في الوحدة غير المتماثلة البلورية. من بين الهياكل الأربعة PB ، يتم تلوين الهياكل الثانوية بنمط قوس قزح مع رموز PDB المقابلة. يظهر في هذا الجدول تحليل نتائج الإنفلونزا PB هدفين بالطرق الموضحة في مقالة الفيديو هذه.

توضيح خط أنابيب المعالجة المتوازية متعدد الأهداف لتحديد الجينات إلى الهيكل في خمس خطوات ، الاستنساخ ، والذوبان ، والتنقية ، والتبلور ، وتحديد الهيكل. لا يوفر ناتج خط أنابيب البيولوجيا الهيكلية لدينا الأساس للبحث القائم على الهيكل فحسب ، بل يغذي أيضا دراسات إضافية مثل المقايسات الوظيفية لتأكيد وظيفة البروتين أو الفحص الفيزيائي الحيوي للمركبات الجديدة من خلال MAR أو SPR لتحديد نقاط انطلاق جديدة لتطوير الأدوية. ساعدت هذه التقنية والأدوات التي تم اختراعها معها في تمهيد الطريق لعلماء الأحياء الإنشائية لاكتشاف أنواع كثيرة من التحقيقات القائمة على الاكتشاف بما في ذلك تصميم الأدوية القائم على الهيكل ، والذي كان له تأثير كبير على صحة الإنسان ومرضه.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زيادة المعالجة المتوازية متعددة الأهداف بشكل كبير من نجاح التحديد المنظم. لا تنس أن العمل في مختبر البيولوجيا الهيكلية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية أثناء الانخراط في الأنشطة المختبرية.