متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام نهج متعدد الأهداف للتحديد البنيوي لبروتين مستهدف عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية، بدءاً من جين واحد أو تسلسل جيني واحد في الحالة المعروضة هنا. البروتين المستهدف هو الوحدة الفرعية PB2 polymerase من إنفلونزا A، وهي مكون رئيسي في التضاعف الفيروسي. يتم تحقيق النهج متعدد الأهداف من خلال تصميم واستنساخ سلسلة من البنى الجينية على التوازي أولاً، بناءً على التسلسل المستهدف الواحد والمعلومات الأخرى المعروفة عن البروتين.

تتمثل الخطوة الثانية في اختبار مستويات التعبير لكل بنية جينية واختيار الأفضل منها لإنتاج البروتين على نطاق واسع في المزارع الخلوية. وتتطلب الخطوة التالية تكسير الخلايا لاستخلاص البروتينات المستهدفة من مواد التعبير وتنقية كل منها للوصول إلى درجة نقاء عالية جداً. بعد ذلك، يتم إعداد سلسلة من تجارب البلورة لكل بروتين للحصول على شكل بلوري مناسب لدراسات الأشعة السينية.

يتم بعد ذلك جمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الدقة لبلورة واحدة أو أكثر، واستخدامها لحل وتنقية خريطة الكثافة الإلكترونية التي تحدد بنية كل بروتين مستهدف. وتسمح هذه النتائج بتصوير بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين المستهدف بناءً على خريطة الكثافة الإلكترونية. وتزيد المعالجة متعددة الأهداف بشكل كبير من احتمالية النجاح في تحديد البنية من خلال توفير بدائل قابلة للتنفيذ عند كل عقبة محتملة في المسار.

يُعد العمل على أهداف متعددة بالتوازي فعالاً للغاية أيضاً، حيث يقلل من الوقت والتكلفة لكل بروتين في كل خطوة. إن القدرة على زيادة معدل إتمام التحديد البنيوي للأهداف القابلة للاستهداف دوائياً ستتيح المزيد من فرص تطوير العلاجات سنوياً. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى قيمة في البيولوجيا البنيوية، فإن البروتينات عالية الجودة التي يتم الحصول عليها من خلال هذه الطرق يمكن أن تدعم أي استقصاء قائم على البروتينات.

تتمتع كل مرحلة من مراحل العملية بعلمها الخاص وتتطلب خبرة نوعية، ولكن الاستثمار في الكوادر البشرية والأجهزة والمعرفة الفنية يمكن أن يؤتي ثماراً مميزة بمجرد تجميع كافة العناصر. وبمجرد اختيار جين مستهدف وناتج جيني للدراسة، تتطلب الخطوة الأولى تصميم عدة متغيرات أو بنى جينية. ويُستخدم برنامج Gene composer لتصميم هذه البنى على مستوى البروتين، إلى جانب الكود المرتبط بتسلسلات الجينات الاصطناعية المهندسة.

باستخدام وحدة عرض المحاذاة ووحدة تصميم البنية، قارن محاذات تسلسلات البروتين وحدد بادئات PCR للمدرج وبادئات PCR الطرفية للناقل في تصميم بنيات البروتين. بعد ذلك، استخدم خوارزمية تحويل البروتين إلى DNA في برنامج gene composer لإجراء ترجمة عكسية لكل تسلسل أحماض أمينية إلى تسلسل حمض نووي مهندس. استخدم جدول استخدام الكودونات المناسب لتحسين التسلسل من أجل التعبير في خط خلوي محدد.

في هذه الحالة، بكتيريا e coli. بمجرد تجهيز تسلسل الجين المستهدف، قم باستنساخه افتراضياً وإدراجه في بلازميد ناقل مناسب للتعبير البكتيري. وفي هذه الحالة، تم استخدام ناقل PET 28 معدل.

يحتوي هذا الناقل على مكونات معينة ضرورية للتعبير وتنقية البروتين. تم تعديل الجين المستهدف لدمج تسلسل علامة الهيستامين عند الطرف N أو C للبروتين، بالإضافة إلى تسلسل قطع للسماح بإزالة العلامة أثناء التنقية. كما يمتلك الناقل جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية لاختبار التعبير وعمليات التخمير.

يتم بعد ذلك إنشاء التسلسل الجيني لكل بروتين مستهدف باستخدام طرق تخليق الجينات القياسية تحضيراً لاستنساخ التمديد الأولي غير المكتمل للبلمرة، أو ما يُعرف بـ pipe cloning؛ وهي استراتيجية استنساخ تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) حيث يتم تضخيم الجين المستهدف باستخدام بادئات مكملة للناقل المطلوب. تعتمد هذه الطريقة على الطبيعة غير المكتملة للمراحل المتأخرة من تفاعل PCR، مما يترك نواتج التفاعل بنهايات متغيرة أحادية السلسلة. أقوم بتحضير تفاعل PCR للإدراج (IPCR) بإضافة خمسة ميكرولتر (5 µL) من كل من البادئات الأمامية والعكسية إلى كل تفاعل.

في طبق يحتوي على 96 بئراً ووفقاً لمخطط الطبق، أضف 2 µL من كل جين اصطناعي كامل الطول إلى البئر المناسب له بناءً على مخطط الطبق. بعد إضافة 25 µL من الخليط الرئيسي لإنزيم PFU إلى كل بئر، قم بإجراء 25 دورة للتفاعلات باستخدام ظروف PCR التالية: مرحلة المسخ عند 95 °C لمدة 30 ثانية.

يتم الإنضاج عند 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، ثم التمديد عند 68 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ويتم التأكد من تضخيم القطع عن طريق تحليل هلام AGROS لنواتج IPCR. وتتمثل نواتج IPCR الناجحة في ظهور حزم قوية.

غالباً ما تظهر النتائج غير المرغوب فيها على شكل حزم باهتة أو لطخات في تفاعل منفصل. يتم تضخيم بلازميد التعبير بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للناقل (VPCR)، أو يتم تأكيد تضخيم قطعة VPCR من خلال تحليل هلام AROS لنواتج VPCR. وبمجرد تضخيم نواتج IPCR وVPCR، تُضاف إلى طبق الدمج وتوضع في جهاز التدوير الحراري لإجراء تفاعل الدمج.

يتم بعد ذلك تحويل البناءات التي تم استنساخها بنجاح إلى خلايا e coli كيميائية الكفاءة وتخزينها في مخزونات الجلسرول لبدء اختبار التعبير عن طريق التخطيط. يتم تخطيط كمية صغيرة من كل عينة من مخزون الجلسرول للبناء المستنسخ على طبق آجار منفصل. يُحضّر الطبق باستخدام مرق مغذٍ بكتيري والمؤشر المضادي الحيوي Kanamycin المشفر في الناقل، ثم يتم تحضينه طوال الليل عند 37 °C وفي اليوم التالي.

ابدأ بإنشاء مزرعة أولية لكل عينة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من طبق آغار حديث النمو. استخدم هذه المستعمرة لتلقيح 1.2 milliliters من مرق TB المضاف إليه can mycin والجلوكوز من أجل المعالجة المتوازية. تُنمى كل مزرعة أولية في كتلة ذات قاع مستدير مكونة من 96 بئرًا.

تُحضن المزارع طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 220 دورة في الدقيقة. وبعد النمو الليلي، يتم البدء في تحضير مزارع تحريض صغيرة النطاق لكل عينة باستخدام 40 µL من المزرعة المسبقة للتلقيح.

1.2 ملليلتر من مرق TB. مضاف إليه 50 مليغرام لكل ملليلتر من الكاناميسين ونظام Novagen overnight express. أولاً، تُنمى مزارع التحفيز عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، مع الرج بسرعة 220 RPM، ثم تُجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بقوة 4,000 GForce لمدة 15 دقيقة.

قم بسكب السائل الطافي وخزن الرواسب عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إجراء المزيد من المعالجة بعد التنقية. قم بتحليل البروتين مع وبدون تفاعل الانقسام باستخدام الفصل الكهربائي الشعيري باستخدام نظام caliper lab CHIP 90 وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وفي حالة بروتين influenza a PB two، أدى 14 من أصل 34 بنية إلى الحصول على بروتين مستهدف قابل للذوبان، والتي انتقلت إلى الخطوة التالية وهي التخمير واسع النطاق.

لبدء عملية تخمير واسعة النطاق، يتم تلقيح 100 milliliters من مرق استنبات الخلايا البكتيرية الذي يحتوي على 50 mg/mL من Canmycin من مخزون الجلسرول، وتُترك لتنمو طوال الليل عند 37 °C مع الرج بسرعة 220 RPM. وفي اليوم التالي، يتم توسيع المزرعة الأولية باستخدام 10 milliliters للتلقيح.

لتر واحد من المرق الذي يحتوي على وسط الحث الذاتي و50 mg/mL من الكاناميسين في دورق مُجزأ سعة لترين. رُج المزارع المتوسعة عند درجة حرارة 37 °C تقريبًا كل 30 دقيقة. تحقق من الكثافة الضوئية للمزرعة عن طريق قياس الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي قدره 600 nm.

عند الوصول إلى كثافة ضوئية تبلغ 0.6، قم بتغيير درجة حرارة الحاضنة الهزازة إلى 20 °C بعد وقت النمو المطلوب. اسحب عينة ممثلة بحجم 10 mL من كل بناء لاختبار التعبير. قم بحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 ×g لمدة 15 دقيقة.

قم بسكب supernatant وجمد كتلة الخلايا عند درجة حرارة -80 °C. لبدء هذا الإجراء، قم بإذابة عجينة الخلايا وإعادة تعليقها في lysis buffer بنسبة حجم نهائي تبلغ 1:5. قلّب المزيج بقوة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

استخدم ملعقة مختبرية نظيفة لتفتيت الكتل العالقة بجدار الكأس. قم بتحلل الخلايا ميكانيكيًا على الثلج باستخدام جهاز سونيكيت من شركة masonic. قم بتصفية المستخلص الخام عن طريق الطرد المركزي عند 18,000 GForce لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

اجمع السائل الطافي واحفظ منه جزءاً صغيراً للتحليل قبل البدء في عملية التنقية واسعة النطاق. تحقق من التعبير البروتيني واسع النطاق لكل مزرعة عبر تحليل هلام SDS page. تُظهر نتيجة SDS page التمثيلية هذه تعبيراً بروتينياً قوياً، وذوبانية تبلغ حوالي 50% وانشطاراً بنسبة 50% تقريباً.

في هذه الحالة، تمت إزالة وسم الهيستيدين بالتزامن مع وسم إضافي لزيادة ذوبانية البروتين، والذي تم تصميمه هندسياً في التركيب الأصلي. ويُستخدم راتنج النيكل لفصل البروتين المستهدف الذي يحمل وسم الهيستامين الفريد عن جميع المواد الخلوية الأخرى، بما في ذلك البروتينات البكتيرية الأصلية. يتم تحضير عمود النيكل عن طريق الغسل بأربعة أحجام من العمود من الماء منزوع الأيونات (UE water) لإزالة محلول التخزين، يليه حجم واحد من العمود من المحلول المنظم B وخمسة أحجام من العمود من المحلول المنظم.

يتم إجراء موازنة متوازية لـ A for E باستخدام جهاز تحضير البروتين، القادر على تشغيل أعمدة متعددة في وقت واحد. يتم تحميل كل مستخلص مصفى يحتوي على بروتين مذاب بعلامة الهيستامين في عمود منفصل بمعدل 2 mL/min، متبوعاً بغسيل العمود لعدة مرات باستخدام المنظم A، ثم جمع المنظم المتدفق وحفظه للتحليل. يتم استخلاص البروتين المرتبط في سلسلة من التدرجات الخطوية باستخدام المنظمين A و B بنسب 95 إلى 5، ثم 60 إلى 40، وأخيراً 100% من المنظم B. وتتنافس المكونات الموجودة في المنظم B مع الهيستامين على راتنج النيكل، مما يؤدي إلى إزالة البروتين من العمود بنسبة محددة.

اجمع كل جزء من أجزاء الشطف بشكل منفصل. يظهر هنا مخطط كروماتوغرافي ممثل لنتيجة تشغيل على عمود النيكل 1. قم بتحليل أجزاء الشطف من عمود النيكل 1، والمحلل الخام، والمحلل المصفى، والتدفق النافذ من عمود النيكل 1 باستخدام SDS page، وقارن النتائج مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 nanometers الذي تم جمعه أثناء تنقية العمود.

تحدد هذه الخطوة ما إذا كانت عملية التنقية ناجحة. قم باختيار وتجميع الكسور التي تحتوي على البروتين المستهدف للمتابعة في عمليات المعالجة اللاحقة. احسب الكمية الإجمالية للبروتين في هذه المرحلة باستخدام معامل الانطفاء النظري للبروتين، مع قياس الامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية عند 280 nanometers وأخذ الحجم الإجمالي للكسور المجمعة في الاعتبار.

احفظ عينة صغيرة للتحليل. تم تشفير الجين الخاص بالبروتين المستهدف بتسلسل محدد يتعرف عليه ULP one كموقع قطع، وبالتالي فإن إضافة ULP one تؤدي إلى القطع بين وسم الهيستيدين والبروتين المراد دراسته. لبدء هذا الإجراء، أضف 1 µL من ubiquitin like protease, one لكل 5 mg من البروتين الموجود في الكسور المجمعة.

في هذه المرحلة، يتم نقل البروتين المشطور من المحلول المنظم B إلى المحلول المنظم A لمزيد من المعالجة باستخدام أنابيب الدياليز، حيث يُجرى دياليز للبروتين مقابل لترين من المحلول المنظم A لمدة أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب. استخدم حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10 kilodalton لـ PB two بعد الدياليز. قم بتشغيل هلام SDS page آخر للبروتين المستهدف في وجود وغياب ULP one.

سيحدد هذا ما إذا كان انقسام ULP one قد تم بنجاح، وسيتيح اختيار أفضل الكسور لمتابعتها في عمليات معالجة لاحقة. تظهر هنا نتائج SDS page نموذجية لثلاثة تركيبات من البوليميراز pb. يوجد مؤشرا الوزن الجزيئي للوحدات الفرعية في المسار الأول.

تمثل المسارات الثاني والسادس والعاشر بروتينات مجمعة من أعمدة النيكل 1. وتحتوي المسارات الثالث والسابع والحادي عشر على التدفق النافذ للبروتين المشطور في المنظم A من النيكل 2، بينما تظهر المسارات الرابع والثامن والثاني عشر إزالة علامة الهستيدين في المنظم B من النيكل 2.

بعد إزالة الهيستامين، يتم تركيز الكسور المجمعة من عمود النيكل الثاني. لبدء كروماتوغرافيا الترشيح الحجمي (SEC)، يجب اختيار الراتنج المناسب مرة أخرى بناءً على الوزن الجزيئي للهدف. في هذه الحالة، يتم استخدام عمود Superdex 200 10/300 GL وموازنته بـ 200 milliliters من منظم SEC بمعدل تدفق قدره 0.5 milliliters في الدقيقة. باستخدام حقنة سعة خمسة milliliter، يتم تحميل العينة في حلقة عينة سعة 10 milliliters وبدء تشغيل عمود SEC. يتم مراقبة مخطط الكروماتوغرام للامتصاص فوق البنفسجي عند 280 nanometers مع جمع كسور ذات أحجام صغيرة.

يتم تشغيل جميع أجزاء SEC ذات الصلة عبر SDS page. تُجرى الطريقة القياسية لتجارب بلورة البروتين باستخدام طريقة القطرة الجالسة التي تعتمد على انتشار البخار. ومن الشائع إعداد شاشتين أو أكثر من المصفوفات المتناثرة في بداية العمل لكل بروتين مستهدف.

لبدء هذه العملية، قم بملء كل خزان في لوحة تبلور مدمجة صغيرة ذات 96 بئراً بـ 80 µL من كل حالة في شاشة التبلور المختارة، ثم وزع 0.4 µL من البروتين في محلول SEC المنظم في كل بئر من الآبار الـ 96. بعد ذلك، أضف 0.4 µL من شاشة التبلور، مع ضمان الخلط الكامل للقطرة في كل بئر. قم بتغطية اللوحة بأكملها بشريط إغلاق شفاف، مع التأكد من إحكام الغلق على كل بئر، ثم خزن اللوحة عند 16 °C في مكان هادئ وخالٍ من الاهتزازات البيئية.

افحص تبلور البروتين بشكل دوري على مدار الأسابيع القليلة القادمة باستخدام مجهر تشريحي. إذا لم تظهر بلورات البروتين، فقم بإعداد ألواح جديدة بظروف مختلفة وقم بتغيير تركيز البروتين في القطرة النهائية لزيادة احتمالية النجاح قبل عملية الحصاد. قم بتبريد قرص من طراز A LS في وعاء مملوء بالنيتروجين السائل وغطه بغطاء لبدء عملية الحصاد.

اقطع الشريط الشفاف الذي يغطي البئر الذي يحتوي على بلورة البروتين المستهدفة وانقله إلى بئر فارغ مجاور. أضف 1.6 µL من ظروف التبلور المقابلة واخلطها مع 0.4 µL من ethylene glycol. يعمل محلول من 20% ethylene glycol في ظروف التبلور على حماية بلورة البروتين.

أثناء التجميد العميق (cryo freezing)، قم بتحليل البلورة تحت المجهر واختيار حلقة تجميد (cryo loop) مناسبة للحصاد، بحيث يتطابق القطر الداخلي للحلقة مع أقصى عرض للبلورة. ثم ثبت حلقة التجميد في عصا بلورية مغناطيسية (magnetic crystal wand) والتقط البلورة مباشرة من محلول البئر. اغمس حلقة التجميد التي تحتوي على البلورة المحصودة فوراً في مادة واقية من التجمد (cryoprotectant)، ثم اغمرها في قرص من نوع LS style puck.

للتجميد السريع، قم بتجميد تكرار البلورة للعدد المطلوب من البلورات. وبمجرد اكتمال عملية الحصاد، استخدم عصا القرص لوضع غطاء مغناطيسي على القرص الذي يحتوي على البلورات المجمدة سريعاً ذات الألسنة المثنية. اقلب القرص رأساً على عقب للخطوة التالية.

قم بربط دافع القرص (puck pusher) بالقرص، ثم انقل القرص إلى جهاز KU actor doer واستخدمه لخلع الغطاء. تظل البلورات الموجودة في القرص مجمدة في حمام من النيتروجين السائل حتى تصبح جاهزة لدراسات حيود الأشعة السينية باستخدام برنامج الحصول على الصور J Director. قم بضبط المعلمات التالية لفحص البلورات: شق الحزمة عند 0.5 degrees، ومسافة الكاشف 50 millimeters، وخطوة الصورة عند 70 degrees، ومدة التعريض 30 seconds.

تظهر هنا لقطة شاشة نموذجية من برنامج الحصول على الصور أثناء فحص بلورة ما، حيث تعرض اللوحة المركزية حيود الأشعة السينية المرصود من بلورة ممثلة، مع جمع صور كافية بدقة عالية للحصول على مجموعة بيانات كاملة مطلوبة لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد. وقد أدت استراتيجيات الاستنساخ وتنقية البروتين الموضحة في هذا الفيديو إلى الحصول على 14 عينة من PB two منقاة، أنتجت تسعة منها بلورات مناسبة لدراسات الحيود. وقد جُمعت مجموعة بيانات حيود الأشعة السينية داخلياً لخمسة من البنى التسعة باستخدام إشعاع QK alpha عبر مولد أشعة سينية ذو مصعد دوار rigaku super bright FRE plus، مجهز بـ ossec variax hf، وبصريات HF، وكاشف Saturn 944 plus CCD.

تظهر هنا صورة حيود الأشعة السينية للوحدة الفرعية PB two من إنزيم البوليميراز. تمت معالجة كل مجموعة بيانات، وتم تحديد إجمالي أربعة هياكل للوحدة الفرعية PB two. وقد خضع كل هيكل لمراجعة الأقران وتم رفعه إلى بنك بيانات البروتين للإتاحة العامة.

يوضح هذا الشكل مخططات شريطية للجزيئات في الوحدة غير المتماثلة لبلورة الأشعة السينية. وفيما يتعلق بالهياكل الأربعة لـ PB two، تم تلوين البنى الثانوية بنمط قوس قزح مع أكواد PDB المقابلة. يوضح هذا الجدول تحليل النتائج لأهداف influenza PB two باستخدام الطرق الموصوفة في هذا الفيديو التعليمي.

يتم توضيح مسار المعالجة المتوازية متعددة الأهداف لتحديد البنية من الجين من خلال خمس خطوات: الاستنساخ، والذوبانية، والتنقية، والبلورة، وتحديد البنية. ولا يوفر مخرج مسار البيولوجيا البنيوية الخاص بنا الأساس للأبحاث القائمة على البنية فحسب، بل يغذي أيضاً دراسات إضافية مثل المقايسات الوظيفية لتأكيد وظيفة البروتين أو الفحص البيوفيزيائي للمركبات الجديدة بواسطة MAR أو SPR لتحديد نقاط بداية جديدة لتطوير الأدوية. وقد ساعدت هذه التقنية والأدوات التي ابتُكرت معها في تمهيد الطريق لعلماء البيولوجيا البنيوية لإجراء أنواع عديدة من الاستقصاءات القائمة على الاكتشاف، بما في ذلك تصميم الأدوية القائم على البنية، والذي كان له تأثير هائل على صحة الإنسان والأمراض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مساهمة المعالجة المتوازية متعددة الأهداف في زيادة نجاح التحديد التركيبي بشكل كبير. لا تنسَ أن العمل في مختبر البيولوجيا التركيبية قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات المناسبة، مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE)، أثناء القيام بالأنشطة المختبرية.