دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص تطور الخلايا التيموسية في الفئران باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير معلقات من الخلايا المفردة من التيموس والطحال في الفأر. وكخطوة ثانية، يتم صبغ الخلايا التيموسية والخلايا الليمفاوية بمزيج من الأجسام المضادة لتحديد مجموعات خلوية تيموسية محددة.

وفي النهاية، يمكن تقييم تكرار وأعداد المجموعات المختلفة من الخلايا اللمفاوية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في تطور الخلايا التائية، مثل تحديد الجينات والمسارات المهمة لتوليد مجموعة من الخلايا التائية الوظيفية والمتسامحة خلوياً في آن واحد. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة حول تطور الخلايا التائية في الغدة الزعترية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في فحص تطور الخلايا المناعية الأخرى.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في تصميم مزيج الأجسام المضادة الخاص بهم لقياس التدفق الخلوي. قبل البدء في عملية التشريح، ضع مصفاة شبكية فولاذية معقمة في طبق بتري مقاس 60 في 15 مليمتر. ثم أضف 5 milliliters من HBSS إلى الطبق واحفظ الطبق على الثلج لجمع الغدة الزعترية.

أولاً، استخدم ملقطاً لرفع الطرف السفلي لعظمة القص والكشف عن الحجاب الحاجز. بعد ذلك، قم بقص الحجاب الحاجز مع تجنب الكبد لفصل القفص الصدري، ثم قص القفص الصدري في اتجاه نحو الأعلى على كلا الجانبين، مع الحرص على تجنب الرئتين والقلب.

استخدم الآن الملقط لسحب القفص الصدري للخلف برفق. الغدة الزعترية هي عضو أبيض مفصص يقع فوق القلب. استخدم الحافة المسطحة للملقط للإمساك بأسفل الفصوص.

ثم اسحب الغدة الزعترية بلطف وضعها على إحدى الشاشات الشبكية التي تم تحضيرها مسبقاً. ولحصاد الطحال، قم بعمل شق عبر الصفاق للكشف عن التجويف البطني. الطحال هو عضو أحمر اللون يشبه لوح ركوب الأمواج، ويقع في الجانب الأيسر من التجويف البطني للفأر أسفل الكبد.

بعد ذلك، استخدم زوجاً من الملاقط لسحب الطحال وزوجاً آخر لإزالة الأنسجة الضامة. ثم ضع الطحال الذي تم تشريحه على مصفاة شبكية منفصلة. الآن استخدم مكبس حقنة سعة 3 mL لطحن كل عضو فوق المصفاة الشبكية الخاصة به حتى لا يتبقى سوى الأنسجة الضامة والدهون، ثم اسحب الخلايا وHBSS باستخدام الماصة وضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 mL.

بعد ذلك، يتم شطف كل شبكة بمحلول HBS طازج 3 مرات. ثم يتم ترسيب الخلايا لمدة خمس دقائق عند 335 ×g ودرجة حرارة 4 °C. وبعد سحب السائل الطافي، يتم تعليق الخلايا في 500 µL من منظم تحلل CK لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء تحلل خلايا الدم الحمراء الطحالية.

قم بتعليق الخلايا التيموسية بتركيز 20 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر في محلول fax buffer، واتركها جانباً على الثلج. الآن، أضف خمسة ملليلتر من HBSS لاستعادة التوتر الإسموزي للخلايا بعد عملية الطرد المركزي مرة أخرى، ثم أعد تعليق الرواسب الخالية من كريات الدم الحمراء بتركيز 20 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر في محلول fax buffer. ابدأ هذه الخطوة بعملية التقسيم إلى أجزاء (aliquotting).

أضف 4 × 10⁶ من الخلايا الثيموسية (THYMOCYTES) المحفوظة لكل عينة قياس التدفق الخلوي في كل بئر من أطباق ذات 96 بئراً. بعد ذلك، أضف الخلايا إلى آبار طبق 96 بئراً لاستخدامها كضوابط تعويض. ثم قم بحجب مستقبلات FC في كل عينة من الخلايا عن طريق التحضين مع anti CD 1632 لمدة 10 دقائق على الثلج.

الآن قم بطرد السوائل في الطبق باستخدام جهاز الطرد المركزي، ثم تخلص من السائل الموجود في الآبار عن طريق هز الطبق مرة واحدة وهو مقلوب فوق حوض الغسيل، بعد ذلك أعد تعليق المحتويات في كل بئر في 200 µL من fax buffer وكرر عملية الغسيل. بعد ذلك، قم بتحضين العينات التجريبية مع 200 µL من مزيج الأجسام المضادة أو أجسام مضادة أحادية الاقتران بالفلوروكروم من أجل ضوابط التعويض (compensation controls). يتم تنفيذ جميع هذه الخطوات في fax buffer على الثلج وفي الظلام.

بعد مرور 30 دقيقة، اغسل الخلايا مرتين باستخدام fax buffer، ثم بعد إعادة تعليق الخلايا في fax buffer، انقل العينات إلى أنابيب fax في نماذج TCR transgenic الفسيولوجية والفئران من النوع البري (wild type). يبدأ الانتقاء الإيجابي عند مرحلة double positive bright قبل الانتقال إلى مرحلة double positive dull. وبعد مواجهة المستضد، تدخل خلايا thymocytes من نوع double positive dull مرحلة انتقالية تكون فيها CD four positive و CD eight low قبل أن تصبح CD four.

تتميز الخلايا التيموسية أحادية الإيجابية، سواء كانت إيجابية لـ CD8 أو إيجابية لـ CD4، بأنها خلايا ناضجة تتميز بتعبير عالٍ عن TCR وفقدان CD24. وبينما يمكن لملف CD8 مقابل CD4 أن يكشف عن عيوب في الانتقاء الإيجابي، فإن فحص TCR beta مقابل CD69 أو CD5 يمكن أن يوفر رؤية أعمق حول مكمن الخلل. يرتفع تعبير كل من CD69 و CD5 بعد تحفيز TCR، حيث تؤدي التفاعلات الأقوى إلى تعبير أعلى لهذه العلامات.

في هذا المخطط لـ TCR beta مقابل CD 69 في فأر من النوع البري، تمثل البوابة TCR R beta low CD 69 negative مجموعة من الخلايا الثيموسية موجبة المزدوج (double positive) في مرحلة ما قبل الانتخاب. بينما تمثل هذه البوابة TCR beta intermediate CD 69 positive مجموعة انتقالية تأتي مباشرة بعد ارتباط TCR، وتتكون من خلايا double positive bright مع بعض خلايا double positive dull وخلايا CD four positive CD eight low. وهنا توضح البوابة TCR R beta high CD 69 positive مجموعة الخلايا التي تلي عملية الانتخاب الإيجابي مباشرة، والتي تتكون من خلايا double positive dull و CD four positive و CD eight low وخلايا CD four single positive.

أخيرًا، تُظهر هذه البوابة ذات الخلايا التي تحمل تعبيرًا عاليًا لـ TCR beta وسالبة لـ CD 69 مجموعة أكثر نضجًا من الخلايا، تتكون أساسًا من خلايا CD4 وخلايا CD8 إيجابية مفردة. وقد يشير غياب المجموعات ذات التعبير المتوسط لـ TCR beta وإيجابية CD 69، والمجموعات ذات التعبير العالي لـ TCR beta وإيجابية CD 69، إلى ضعف في عملية الانتقاء الإيجابي. كما قد تشير التغيرات في نسبة الخلايا CD4 إيجابية مفردة إلى الخلايا CD8 إيجابية مفردة ضمن المجموعة ذات التعبير العالي لـ TCR beta وسالبة CD 69 إلى حدوث تغيرات في الالتزام السلالي.

قد يعكس فقدان مجموعات TCR beta high CD 69 positive و TCR beta high CD 69 negative مشكلات تتعلق بالبقاء بعد عملية الانتخاب الإيجابي. ويعد فحص TCR beta بواسطة CD five استراتيجية أخرى لتحديد مجموعات ما قبل وما بعد الانتخاب الإيجابي. وتتكون هاتان المجموعتان الأوليان بشكل أساسي من الخلايا التيموسية المزدوجة الإيجابية الساطعة (double positive bright thymocytes).

تمثل مجموعة TCR beta low CD five low الخلايا الثيموسية مزدوجة الإيجابية قبل مرحلة الانتقاء، بينما تتكون مجموعة TCR beta intermediate CD five intermediate من الخلايا التي تبدأ عملية الانتقاء الإيجابي. ويشير ضعف تولد هذه المجموعة أو المجموعة السابقة إلى وجود خلل في الانتقاء الإيجابي. أما مجموعة TCR beta intermediate CD five high، فهي تمثل الخلايا الثيموسية التي تمر بعملية الانتقاء الإيجابي، وتتكون بشكل أساسي من الخلايا مزدوجة الإيجابية الباهتة (double positive dull) والخلايا الإيجابية لـ CD four.

الخلايا التيموسية ذات التعبير المنخفض عن CD8. تتكون المجموعة ذات التعبير المرتفع عن TCR beta والمرتفع عن CD5 بشكل أساسي من الخلايا التي اجتازت مرحلة الانتقاء الإيجابي. تغيرات في نسبة الخلايا التيموسية أحادية الإيجابية لـ CD4 إلى الخلايا أحادية الإيجابية لـ CD8.

قد تشير الخلايا الموجبة المنفردة ضمن هذه المجموعة، على الرغم من سلامة المجموعات السابقة، إلى حدوث تغيرات في التزام السلالة. علاوة على ذلك، قد يشير غياب هذه المجموعة إلى انخفاض بقاء الخلايا الثيموسية بعد الاختيار الموجب، حيث يتضمن الاختيار السالب حذف مجموعات صغيرة محددة للمستضد. ومن الأفضل رصد العيوب في هذه العملية باستخدام الفئران المعدلة وراثياً لمستقبلات الخلايا التائية (TCR)؛ ففي الخلايا الثيموسية للفئران HY CD4 التي تعبر عن TCR-H-Y المعدل وراثياً، يمكن الكشف عنها باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة T 3.7.

يتعرف مستقبل H-Y-T-C-R على مستضد HY الخاص بالذكور والمعروض ضمن MHC Class one db. وبناءً على ذلك، تخضع الفئران الذكور من سلالة HY CD four لعملية انتخاب سلبي للخلايا التيموسية الموجبة لـ H-Y-T-C-R، وهو ما يتضح من خلال انخفاض أعداد الخلايا التيموسية المزدوجة الموجبة لـ T three point 70، وانخفاض أكثر حدة في أعداد الخلايا التيموسية أحادية الموجبة لـ CD eight والموجبة لـ T 3.7. وفي المقابل، تخضع الفئران الإناث من سلالة HY CD four لعملية انتخاب إيجابي لتوليد خلايا T أحادية الموجبة لـ CD eight والموجبة لـ T 3.7.

بينما يشير الانخفاض في أعداد الخلايا التيموسية مزدوجة الإيجابية إلى حدوث اختيار سلبي، فإن غياب الخلايا التيموسية أحادية الإيجابية النوعية للمستضد يعد المقياس الأكثر دقة. ويكشف المزيد من الفحص لعدد قليل من الخلايا التيموسية CD8 أحادية الإيجابية والموجبة لـ T3.70 في الفئران الذكور HY CD4 أن معظمها خلايا غير ناضجة ذات تعبير عالٍ عن CD24. بينما وصلت معظم الخلايا التيموسية CD8 أحادية الإيجابية والموجبة لـ T3.70 في الإناث HY CD4 إلى مرحلة النضج وهي ذات تعبير منخفض عن CD24، مما يقدم دعماً إضافياً بأن الاختيار السلبي يحدث في الفئران الذكور HY CD4.

تتمثل إحدى التحذيرات المتعلقة بنماذج TCR المعدلة وراثياً في صعوبة التوصيف الإضافي للاختيار الإيجابي من خلال تحديد المجموعات بناءً على تعبير TCR و CD 69 أو CD 5 بسبب التعبير العالي لـ TCR طوال فترة تطور الخلايا الثيموسية. تمتلك فئران HY CD 4 الإناث مجموعة كبيرة من الخلايا الثيموسية مزدوجة الإيجابية T 3.70 positive التي تخضع للاختيار الإيجابي. وكما يتضح من الزيادة في مجموعة CD 69 positive مقارنة بالنوع البري، فإن الاختيار السلبي يتضمن تحفيز TCR ذو ألفة أعلى من الاختيار الإيجابي. ويستدل على ذلك من التعبير الأعلى لـ CD 69 على الخلايا الثيموسية مزدوجة الإيجابية T 3.70 positive في فئران HY CD 4 الذكور، مما يؤدي إلى إزاحة قمة المخطط البياني (histogram) نحو اليمين.

تُلاحظ اتجاهات مماثلة مع تعبير CD five عند تحليل الانتقاء التيموسي في الفئران المعدلة وراثياً. ويمكن لفحص تعبير CD 69 أو CD five تحديد ما إذا كان الخلل يكمن في إشارات TCR أو في نتيجة لاحقة لتحفيز TCR. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون ساعتين ونصف لتحضير الخلايا وصبغها، بالإضافة إلى ساعة واحدة إضافية لجمع البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

إذا تم تنفيذ العملية بشكل صحيح، فإن كل فأر إضافي سيستغرق 30 دقيقة تقريبًا. أثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع الخلايا التيموسية برفق والتأكد من تخطيط استراتيجية الصبغ مسبقًا. اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء مقايسات أخرى، مثل مقايسات القتل أو مقايسات إنتاج السيتوكينات، للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كانت الخلايا التيموسية المصدرة تعمل بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تطور المواقع التيموسية باستخدام قياس التدفق الخلوي.