دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص تطورك في الفئران عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير معلقات خلية واحدة من الفأر والغدة الصعترية والطحال. كخطوة ثانية ، يتم تلطيخ الخلايا الزعترية والخلايا بمزيج من الأجسام المضادة لتحديد مجموعات محددة من السكان.

في النهاية ، يمكن تقييم تواتر وعدد مجموعات الخلايا الليمفاوية المختلفة عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تطور الخلايا التائية ، مثل الجينات والمسارات المهمة لتوليد ذخيرة الخلايا التائية الوظيفية والمتسامحة مع الخلايا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتطور الخلايا التائية في الغدة الصعترية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا في فحص تطور الخلايا المناعية الأخرى.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في تصميم كوكتيلات الأجسام المضادة الخاصة بهم لقياس التدفق الخلوي. قبل البدء في التشريح ، ضع شاشة شبكية فولاذية معقمة في طبق بتري مقاس 60 × 15 ملم. ثم أضف خمسة ملليلتر من HBSS إلى الطبق وقم بتخزين الطبق على الثلج لحصاد الغدة الصعترية.

أولا ، استخدم زوجا من الملقط لرفع الطرف السفلي من القص والكشف عن الحجاب الحاجز. بعد ذلك ، تجنب الكبد ، قم بقطع الحجاب الحاجز لفصل القفص الصدري ثم قطع القفص الصدري في اتجاه تصاعدي على كل جانب. الحرص على تجنب الرئتين والقلب.

استخدم الآن الملقط لسحب القفص الصدري برفق للخلف. الغدة الصعترية هو عضو أبيض ثنائي الفصوص يقع فوق القلب. استخدم الحافة المسطحة للملقط للإمساك بقاع الفصوص.

ثم اسحب الغدة الصعترية برفق وضعها على إحدى الشاشات الشبكية المعدة مسبقا. لحصاد الطحال ، قم بعمل شق عبر الصفاق لفضح تجويف البطن. الطحال عبارة عن عضو أحمر على شكل لوح تزلج يقع على الجانب الأيسر من تجويف بطن الفأر أسفل الكبد.

ثم استخدم زوجا من الملقط لسحب الطحال وآخر لإزالة النسيج الضام. ثم ضع الطحال المقطوع على شاشة شبكية منفصلة. استخدم الآن المكبس من حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لطحن كل عضو في شاشته الشبكية حتى يبقى النسيج الضام والدهون فقط ماصة الخلايا و HBSS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

ثم اشطف كل شبكة باستخدام HBS S3 الطازجة. بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 335 مرة جم وأربع درجات مئوية. بعد شفط الجذع الطافي ، قم بتعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول تحلل CK لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء كذب خلايا الدم الحمراء الطحالية.

الخلايا الزعترية عند 20 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر في المخزن المؤقت للفاكس ، واضعها جانبا على الجليد. أضف الآن خمسة ملليلتر من HBSS لإعادة الخلايا إلى متساوي التوتر بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، وقم بتعليق الحبيبات الخالية من كرات الدم الحمراء عند 20 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في المخزن المؤقت للفاكس. ابدأ هذه الخطوة بواسطة علي واتينج.

أربعة أضعاف 10 إلى سادس الخلايا الزعترية المحجوزة لكل عينة قياس التدفق الخلوي لكل بئر من صفيحة 96 بئر. بعد ذلك ، أضف الصخورات إلى آبار لوحة 96 بئر لضوابط التعويض. ثم قم بحظر مستقبلات FC في كل عينة من عينات الخلية عن طريق الحضانة باستخدام مضاد CD 1632 لمدة 10 دقائق على الجليد.

الآن قم بتدوير اللوحة ثم قم بتبديد السائل من الآبار عن طريق تحريك اللوحة مرة واحدة ووجهها لأسفل في الحوض ، ثم قم بتعليق كل بئر في 200 ميكرولتر من مخزن الفاكس المؤقت وكرر الغسيل. بعد ذلك ، احتضان العينات التجريبية ب 200 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة المترافقة ذات الفلوروكروم المفردة لضوابط التعويض. كل ذلك في الفاكس المخزن المؤقت على الجليد في الظلام.

بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن فاكس ، ثم بعد إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للفاكس ، انقل العينات إلى أنابيب الفاكس في النماذج الفسيولوجية المعدلة وراثيا TCR والفئران البرية. يبدأ الانتقاء الإيجابي في المرحلة الساطعة الإيجابية المزدوجة قبل الانتقال إلى المرحلة المملة الإيجابية المزدوجة. بعد مواجهة المستضد للخلايا الزعترية الباهتة الإيجابية المزدوجة ، ثم أدخل قرصا مضغوطا انتقاليا أربعة إيجابيا للقرص المضغوط الثامن المرحلة المنخفضة قبل أن تصبح CD أربعة.

مفردة موجبة أو CD ثمانية خلايا الغدة الصعترية مفردة إيجابية ناضجة الخلايا الزعترية موجبة واحدة تتميز بتعبيرها العالي TCR وفقدان CD 24. في حين أن ملف تعريف القرص المضغوط ثمانية بواسطة القرص المضغوط الرابع يمكن أن يكشف عن عيوب في الاختيار الإيجابي ، فإن فحص TCR beta بواسطة CD 69 أو CD five يمكن أن يوفر مزيدا من التبصر حول مكان وجود العيب. يتم تنظيم كل من CD 69 و CD five بعد تحفيز TCR مع تفاعلات أقوى تؤدي إلى زيادة التعبير عن هذه العلامات.

في مخطط TCR التجريبي هذا بواسطة CD 69 في فأر من النوع البري ، تمثل المشية السلبية TCR R beta منخفضة CD 69 مجموعة من الخلايا الزعترية الإيجابية المزدوجة قبل الاختيار. في حين أن المشية الإيجابية المتوسطة TCR beta CD 69 تمثل مجموعة انتقالية مباشرة بعد مشاركة TCR وتتكون من موجبة مزدوجة ساطعة مع بعض الإيجابية المزدوجة الباهتة و CD أربعة إيجابية CD ثماني خلايا منخفضة. هنا توضح المشية الإيجابية TCR R beta العالية CD 69 مجموعة الخلايا التي تلاحق الاختيار الإيجابي مباشرة ، والتي تتكون من قرص مضغوط مزدوج إيجابي مملة أربعة إيجابي ، و CD ثمانية منخفض ، و CD أربع خلايا موجبة مفردة.

أخيرا ، تظهر مشية TCR beta العالية CD 69 السلبية مجموعة أكثر نضجا من الخلايا التي تتكون بشكل أساسي من CD أربعة و CD ثماني خلايا موجبة مفردة. قد يكون غياب TCR R beta الوسيط CD 69 الإيجابي و TCR R beta المرتفع CD 69 مؤشرا على ضعف تغيرات الانتقاء الإيجابية في نسبة CD أربعة إيجابية مفردة إلى CD ثمانية. قد تشير الخلايا الموجبة المفردة داخل مجموعة CD 69 السلبية عالية TCR beta إلى تغييرات في التزام النسب.

يعكس فقدان TCR beta high CD 69 الإيجابي و TCR beta High CD 69 السلبي مشكلات البقاء على قيد الحياة بعد الانتقاء الإيجابي. يعد فحص TCR beta بواسطة CD five استراتيجية أخرى لتحديد مجموعات الاختيار الإيجابية قبل وبعد الاختيار. تتكون هاتان المجموعتان الأوليان بشكل أساسي من الخلايا الزعترية اللامعة الإيجابية المزدوجة.

يمثل TCR beta low CD five السكان المنخفضين الاختيار المسبق الخلايا الزعترية الإيجابية المزدوجة ، ويتكون TCR beta الوسيط CD الخمسة من الخلايا التي تبدأ الانتقاء الإيجابي. يشير ضعف الجيل من هذا السكان أو السكان السابقين إلى اختيار إيجابي معيب. ومع ذلك ، فإن TCR R beta الوسيط CD الخمسة المرتفع يمثل الخلايا الزعترية في عملية الخضوع للانتقاء الإيجابي ويتكون بشكل أساسي من موجبة مزدوجة مملة و CD أربعة موجبة.

CD ثمانية الخلايا الزعترية المنخفضة. يتكون TCR beta high CD five high population بشكل أساسي من اختيار ما بعد الإيجابية. تتغير الخلايا الزعترية الموجبة المفردة في نسبة القرص المضغوط أربعة ، موجبة واحدة إلى CD ثمانية.

قد تشير الخلايا الإيجابية المفردة داخل هذه المجموعة ، على الرغم من المجموعات السكانية السابقة الطبيعية ، إلى تغييرات في التزام النسب. علاوة على ذلك ، قد يشير غياب هذه المجموعة إلى انخفاض بقاء الخلايا الزعترية بعد الانتقاء الإيجابي لأن الانتقاء السلبي ينطوي على حذف مجموعات صغيرة محددة من المستضد. من الأفضل ملاحظة العيوب في هذه العملية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا TCR في HY CD ، يمكن اكتشاف أربعة فئران من الخلايا الزعترية التي تعبر عن H-Y-T-C-R المعدلة وراثيا باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة T 3.7.

يتعرف H-Y-T-C-R على مستضد HY الخاص بالذكر المقدم داخل معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى ديسيبل. وهكذا HY CD تخضع أربعة فئران ذكور لاختيار سلبي للخلايا الزعترية الإيجابية H-Y-T-C-R كما يتضح من انخفاض في T بثلاث نقاط 70 إيجابية مزدوجة إيجابية من CYMOTESTES ، وانخفاض أكثر دراماتيكية في T 3.7 CD الإيجابي ثمانية ، أرقام الخلايا الزعترية الإيجابية المفردة. في المقابل ، تخضع أربع فئران من إناث HY CD لاختيار إيجابي لتوليد T 3.7 CD إيجابي ثماني خلايا تائية موجبة مفردة.

في حين أن الانخفاض في الأرقام الإيجابية المزدوجة يدل على الانتقاء السلبي ، فإن عدم وجود الخلايا الزعترية الموجبة المفردة الخاصة بالمستضد هو المقياس الأكثر دقة. يكشف الفحص الإضافي لعدد قليل من T 3 نقاط 70 CD إيجابيا ثمانية خلايا الغدة الزعترية مفردة إيجابية في HY CD أربعة ذكور من الفئران أن معظمها عبارة عن خلايا CD 24 عالية غير ناضجة. في حين أن معظم T ثلاثة نقاط 70 CD إيجابي ثمانية خلايا الغدة الصعترية مفردة إيجابية في HY CD أربع إناث قد وصلوا إلى مرحلة النضج وهم CD 24 منخفضون ، مما يوفر مزيدا من الدعم ، فإن هذا الاختيار السلبي يحدث في HY CD أربعة ذكور من الفئران.

أحد التحذيرات للنماذج المعدلة وراثيا TCR هو أنه من الصعب توصيف الاختيار الإيجابي بشكل أكبر من خلال تحديد المجموعات السكانية بناء على TCR و CD 69 أو CD 5 التعبير بسبب تعبير TCR العالي طوال تطور CYTE ، HY CD أربع إناث لديها عدد كبير من T ثلاثة نقاط 70 إيجابية الخلايا الغدة الزعترية الإيجابية المزدوجة التي تخضع للاختيار الإيجابي. كما يتضح من الزيادة في عدد السكان الإيجابيين CD 69 مقارنة بالاختيار السلبي من النوع البري ينطوي على حافز TCR تقارب أعلى من الانتقاء الإيجابي. يشار إلى ذلك من خلال التعبير العالي عن القرص المضغوط 69 على T ، وثلاث نقاط 70 إيجابية ، والخلايا الزعترية الإيجابية المزدوجة في HY CD ، وأربعة ذكور من الفئران ، مما أدى إلى تحول ذروة الرسم البياني إلى اليمين.

تظهر اتجاهات مماثلة مع التعبير الخاضع للقرص المضغوط عند تحليل اختيار الغدة الصعترية في الفئران التي تم التلاعب بها وراثيا. يمكن أن يحدد فحص تعبير CD 69 أو CD Five ما إذا كان العيب يكمن في إشارات TCR أو نتيجة نهائية لتحفيز TCR. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ساعتين ونصف لإعداد الخلية وتلطيخها ، بالإضافة إلى ساعة إضافية لجمع البيانات على مقياس التدفق الخلوي.

إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ، فسيضيف كل ماوس إضافي حوالي 30 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الخلايا الغدة الصعترية بلطف والتأكد من أنك خططت لاستراتيجية التلوين مسبقا. باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء فحوصات أخرى مثل فحوصات القتل أو فحوصات إنتاج السيتوكين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت الخلايا الزعترية المصدرة تعمل بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تطور موقع الغدة الصعترية باستخدام قياس التدفق الخلوي.