العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي
أغسطس 8, 2014
نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الظهارية أو التقنية الصعترية وتحديدها وتنقيتها. يتم تحقيق ذلك عن طريق الهضم الأنزيمي أولا وتعطيل الغدة الصعترية لفصل التكنولوجيا في معلق خلية واحدة. بعد ذلك ، يمكن تحليل التكنولوجيا عن طريق قياس التدفق الخلوي أو إثرائها عبر استراتيجية التحريك.
في النهاية ، يمكن تنقية المجموعات الفرعية الظهارية الصعترية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في مجال تطور الخلايا التائية ، مثل ، كيف تعزز الخلايا الظهارية الصعترية الانتقاء الصعترية؟ ما الذي يسبب الخلل الوظيفي في الخيوط الصعترية في المسنة وكيف يمكننا تحقيق إعادة تكوين الخلايا التائية في المختبر؟
تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في الاسترداد العالي للخلايا الجرثومية الإيمية المتغيرة ، والتخصيب غير المتحيز للخلايا الظهارية الإيمية ، والنقاء العالي الذي يمكن تحقيقه في النهاية عن طريق فرز الخلايا. لعزل الخلايا اللحمية الصعترية ، حدد أولا الغدة الصعترية ، التي تقع أسفل الأضلاع مباشرة وتبدو وكأنها فصين أبيضين رفيعين يعلوان القلب. ثم افصل النسيج الضام المحيط بالغدة الصعترية واستخدم ملقطا مسننا منحنيا لسحب الفصوص الصعترية وإزالتها برفق.
ضع الفصوص في صفيحة من ستة آبار تحتوي على خمسة ملليلتر من الوسط وقم بقص أي دهون محيطة وأنسجة ضامة. ثم نقل الفصوص المشذبة إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الإنزيم المحضر حديثا واستخدم مقصا ناعما لعمل شقوق صغيرة في الأنسجة. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية.
بعد 20 دقيقة ، قم بعمل ماصة الأنسجة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر لفصل الملاط في معلق خلية واحدة. اجمع الجزء الطافي في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من المخزن المؤقت الغني بالألبومين البارد على الجليد لتحييد الإنزيمات. ثم أضف 2.5 مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية.
احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحريك الأنسجة برفق باستخدام حقنة سعة ثلاثة ملليلتر مزودة بإبرة 18 جينا لتفتيت أي مجاميع. ثم انقل إلى أنبوب التجميع.
ثم أضف 2.5 مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة الثالثة ، كرر التحريض الميكانيكي بإبرة 20 5G.
بعد احتضان الأنسجة لمدة خمس إلى 10 دقائق أخيرة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب التجميع للطرد المركزي لتحديد التقنية المستردة عن طريق قياس التدفق الخلوي باتباع إجراءات تلطيخ الأجسام المضادة القياسية ، قم بتشغيل العينات على مقياس تدفق خلوي متعدد المعلمات وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الفاكس المناسب لإثراء التكنولوجيا بشكل أكبر باستخدام طريقة التحريك. أولا ، احتضان الخلايا بالجسم المضاد المناسب للتخصيب. بعد ذلك ، أضف تعليق الخلية إلى لوحة تحريك مشفرة مسبقا ثم قم بتدوير اللوحة وتحضنها في درجة حرارة الغرفة.
بعد 30 دقيقة ، قم بتدوير اللوحة بقوة ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي الشكل. اشطف الطبق مرتين بغسالات طازجة ومتوسطة في أنبوب التجميع. ثم بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الطازجة والمتوسطة وانقل تعليق الخلية إلى لوحة تحريك جديدة ، وجمع الخلايا بعد الدوران والحضانة كما هو موضح للتو لزيادة تنقية التكنولوجيا المخصبة في مجموعات الخلايا الصعترية الفرعية.
بعد وضع العلامات بالأجسام المضادة المناسبة ، قم بفرز التقنية من خلال فوهة 100 ميكرومتر عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، وجمع الخلايا في 30٪ من الحجم لكل حجم FBS في المتوسط. في استراتيجية البوابات التمثيلية هذه لتحديد التكنولوجيا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، يمكن ملاحظة التعبير عن epca ، ولكن ليس CD 45 بواسطة التكنولوجيا. وبالتالي ، يمكن أن تكون التكنولوجيا مسورة وفقا لتقنية التعبير ep و camm و CD 45 الخاصة بهم وتتكون من مجموعات فرعية ظهارية قشرية أو CEC ومجموعات فرعية ظهارية نخاعية أو mtech.
يمكن تمييز هذه المجموعات الفرعية بالجسم المضاد الحي 51 ، الذي يتعرف على G glutamyl amino peptidase المعبر عنه بواسطة ctec و lectin UEA one ، والذي يرتبط ب mtech كل من ctech و Mtech التعبير عن MHC Class Two على أسطحهما. على الرغم من أنه يمكن تصنيف mtech إلى مجموعات سكانية منخفضة mtech و mtech عالية ، اعتمادا على مستوى تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير ، يمكن استرداد ما يقرب من ثماني مرات من التكنولوجيا باستخدام البروتوكول القائم على إنزيم liase الذي تم إثباته للتو مقارنة بالبروتوكول الذي يحتوي على مساحة الكولاجيناز والقرص بحوالي تسعة أضعاف 10 إلى الخامس ، ويمكن استردادها من غدة صعترية واحدة فقط لتقليل وقت الفرز وزيادة جدوى الخلايا اللحمية المستعادة. يمكن استخدام التحريك كما هو موضح للتو لاستنفاد مواقع الخلايا الصعترية مقارنة بخلايا الغدة الصعترية المحضرة بالكامل.
تزداد نسبة التكنولوجيا من أقل من 0.5٪ إلى أكثر من 15٪ في مجموعة الخلايا بعد التخصيب. بعد التحريك ، لا يتم تغيير نسب المجموعات الفرعية التقنية ، مما يشير إلى عدم فقد أي من المجموعتين الفرعيتين بشكل انتقائي أثناء التحريك. بالمقارنة مع عينة التخصيب البريين ، يبلغ معدل استرداد التكنولوجيا حوالي 85٪ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إثراء الخلايا الجرثومية من أكثر من الذعر ، وكذلك كيفية تحديد وتنقية المزيد من الانحسارات الظهارية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لعزلة وتحديد وتنقية الخلايا الظهارية للغدة الصعترية لدى الفئران (TECs). تم تصميم البروتوكول لتسهيل الدراسات حول وظيفة الغدة الصعترية، وتطور الخلايا التائية، وخلل وظيفي في الغدة الصعترية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- وظيفة الغدة الصعترية
الخلفية
- تلعب الخلايا الظهارية للغدة الصعترية دورًا حاسمًا في تطور الخلايا التائية.
- يمكن أن يوفر فهم TECs رؤى حول عمليات الانتقاء الصعترية.
- يرتبط خلل وظيفي في الغدة الصعترية بالشيخوخة وأمراض مختلفة.
- إعادة بناء الخلايا التائية أمر حيوي للاستراتيجيات العلاجية.
غرض الدراسة
- لعزل وتنقية TECs لتحليل مفصل.
- للتحقيق في آليات الانتقاء الصعترية.
- لاستكشاف أسباب خلل وظيفي في الغدة الصعترية في الشيخوخة.
الطرق المستخدمة
- التخمير الأنزيمي والتفكيك الميكانيكي للغدة الصعترية.
- قياس التدفق الخلوي لتحليل TECs.
- استراتيجية التنقية لإثراء TECs.
- فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لتنقية مجموعات فرعية من TECs.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح والتنقية للـ TECs.
- تحديد مجموعات فرعية رئيسية من TECs المتورطة في تطور الخلايا التائية.
- رؤى حول آليات الانتقاء الصعترية.
- تداعيات محتملة لعلاجات إعادة بناء الخلايا التائية.
الاستنتاجات
- الطريقة الموصوفة فعالة لدراسة TECs.
- تساهم النتائج في فهم وظيفة الغدة الصعترية وخلل وظيفتها.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذا البروتوكول لاستكشاف تطور الخلايا التائية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
