Name: 1 F O أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: تعلم عزل الحويصلات دون الخلوية الغنية بمركبات F1FO ATP synthase من دماغ الجرذ. تتيح هذه الطريقة دراسة نشاط ATPase وتعديله باستخدام تقنية التسجيل المشبك التصحيح.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. الدماغ الميتوكوندريا العزلة (مقتبس من براون MR آخرون. 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران باستخدام أساليب وافقت عليها اللجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان (IACUC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الحيوان عن طريق قطع الرأس، وقطع الجلد وفضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجمجمة بلطف عن طريق قطع مع مقص أو مقراض. إزالة الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم ناعما الدماغ من دون المخيخ في العزلة عازلة (انظر الجدول 1) وتحويلها إلى 5 مل زجاج / تفلون الخالط (انظر قائمة المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الأنسجة بلطف 10 مرات (أي فقاعات)، حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لعينة في 1،500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ طاف (الميتوكوندريا وsynaptosomes) وتجاهل بيليه (المواد النووية والحطام الخلية). الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبذطاف وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من الاحتياطي العزلة. تعطيل synaptosomes مع سفينة تمزيق الخلايا (انظر قائمة المعدات). تطبيق الضغط من 1،200 رطل لمدة 10 دقيقة، تليها إزالة الضغط السريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة الخليط على Ficoll التدرجات (انظر الجدول 2)، ومكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 126،500 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في نابذة فائقة السرعة (انظر قائمة المعدات). بيليه هو تنقية الميتوكوندريا، وطبقة بين كثافات مختلفة من Ficoll هو synaptosomes undisrupted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه بواسطة الطرد المركزي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. </li></ol> 2. Submitochondrial الحويصلات (SMV) العزلة (مقتبس من تشان وآخرون. 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر العازلة عزل جنبا إلى جنب مع حجم مساو من 1٪ ديجيتونين والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المزيد من العزلة بوفإيه وأجهزة الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. القيام بذلك مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر العازلة عزل وإضافة 2 ميكرولتر من 10٪ Lubrol PX (C12E9). خلط والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خليط طبقة عازلة على العزلة، مكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 182،000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل النهائي بيليه بواسطة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي المنضدي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. تسجيل الكهربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتضمن الكهربية تلاعب نموذجي مكبر للصوت، وجهاز كمبيوتر PC مجهزة Digidata 1440A تحويل واجهة التناظرية إلى الرقمية بالتعاون مع pClamp10.0 البرمجيات، والمتلاعبين، المجهر، جدول العزلة الاهتزاز، قفص فاراداي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تندس البورسليكات أنابيب زجاجية الشعرية إلى يلهب / براون مجتذب micropipette نموذج P-87. هو الأمثل برنامج ماصة مجتذب إلىتوليد ماصات مع المقاومة بين 80-100 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع SMVs في حل داخل الخلايا الفسيولوجية (يضاف ATP في الوقت المناسب أثناء التسجيل) (الجدول 3). تمتلئ ماصات المشبك التصحيح مع نفس الحل (لا ATP). يتم إجراء التسجيلات من خلال تشكيل ختم جيجا أوم على SMVs في درجة حرارة الغرفة. الحويصلات هي تصور بواسطة المجهر المرحلة على النقيض مع نيكون أو زايس مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحفاظ على غشاء المحتملة في الفولتية التي تتراوح بين -100 بالسيارات إلى + 100 بالسيارات لفترات من 10 ثانية. يتم تصفيتها التسجيلات في 5 كيلو هرتز باستخدام الدوائر مكبر للصوت. مستوى الضجيج الكهربائي أو غير محددة الضالة من أقل من 1 باسكال تكون مرغوبة للتسجيل ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل البيانات مع Clampfit 10.0 البرمجيات على سبيل المثال لتحديد التردد والسعة من الأحداث قناة واحدة. يتم تحديد الاعتماد التيار الكهربائي من خلال التآمر علاقة الجهد الحالي. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصفت وسائل تمكين هنا عزلة الميتوكوندريا نقية في نهاية الخطوة 1 والحويصلات submitochondrial (SMVs) بعد الخطوة 2 من الدماغ كله دون تمييز من خلية phenotypes.SMVspurified بواسطة هذه الطريقة هي مجانية أساسا من التلوث بواسطة العضيات التحت خلوية أخرى كما هو مبين في الشكل (1) والعمل السابق لدينا (علويان KN وآخرون. 8) والمحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية قبل التجميد. بعد تجميد والذوبان، عزل الميتوكوندريا أو تستخدم SMVs للتسجيلات وفحوصات البيوكيميائي...

<table><tbody><tr><td>طاحنة أنسجة Potter-Elvehjem مع مدقة PTFE</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>وعاء تكسير الخلايا 4639</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب طرد مركزي من البوليكربونات</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>دوار SW-50.1</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي فائق L8-70M</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9)</td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز تحكم دقيق (Manipulator)</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أنبوب شعري من زجاج البوروسيليكات</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة Flaming/Brown موديل P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub&gt; أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة submitochondrial

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

وتشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية الهامة بما في ذلك التمثيل الغذائي، والبقاء على قيد الحياة 1، والتنمية، والكالسيوم مما يشير 2. ترتبط اثنين من وظائف الميتوكوندريا الأكثر أهمية بالنسبة للكفاءة الإنتاج من ATP، والعملة الطاقة للخلية، من خلال الفسفرة التأكسدية، والوساطة من إشارات لموت الخلية المبرمج 3. الإنزيم المسؤول في المقام الأول لإنتاج ATP هو سينسيز ATP-F1FO، وتسمى أيضا ATP سينسيز 4-5. في السنوات الأخيرة، تلقت دور الميتوكوندريا في موت الخلايا أفكارك ونخرية اهتماما كبيرا. في موت الخلايا أفكارك، BCL-2 البروتينات الأسرة مثل باكس دخول الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، oligomerize وpermeabilize الغشاء الخارجي، والإفراج عن العوامل الموالية لأفكارك في العصارة الخلوية 6. في موت الخلايا نخرية الكلاسيكية، مثل تلك التي ينتجها نقص التروية أو التحفيز الزائدة في الخلايا العصبية، تأه، وزيادة سيئة التنظيم في مصفوفة الكالسيوم يساهم في افتتاح مسام الغشاء الداخلي، والميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقال أو MPTP. هذا depolarizes الغشاء الداخلي ويسبب تحولات ناضح، والمساهمة في تمزق غشاء الخارجي، وإطلاق سراح من العوامل الموالية لأفكارك، وضعف التمثيل الغذائي. العديد من البروتينات بما في ذلك بي سي إل XL 7 التفاعل مع F1FO ATP سينسيز، تحوير وظيفتها. BCL-XL يتفاعل مباشرة مع الوحيدات بيتا من F1FO ATP سينسيز، وهذا التفاعل يقلل من تصرف تسرب داخل F1FOATPasecomplex، وزيادة صافي النقل من H + من قبل F1FO خلال F1FO ATPase النشاط 8 وبالتالي زيادة كفاءة الميتوكوندريا. لدراسة النشاط والتشكيل من سينسيز ATP، ونحن عزل من القوارض الدماغ الحويصلات submitochondrial (SMVs) التي تحتوي على F1FO أتباز. وSMVs الإبقاء على السلامة الهيكلية والوظيفية للF1FO أتباز كما هو مبين في علويان وآخرون. هنا، نحن تصف طريقةالتي استخدمناها بنجاح لعزل SMVs من دماغ الفئران، ونحن ترسيم تقنية المشبك التصحيح لتحليل نشاط قناة (أيون تصرف تسرب) من SMVs.

الخطوة الأولى من بروتوكول لدينا يسمح لعزل الميتوكوندريا تنقيته كما هو موضح من قبل لطخة غربية في الشكل 1. في الشكل 2 يظهر مثال على الدماغ المستمدة submitochondrial حويصلة تسجيل التصحيح. باستخدام التكوين التصحيح من الداخل إلى الخارج ونحن لشرح نشاط قناة عن طريق التضمين ATP. عنصر التحكم (CTL) تسجيل (يسار) ويظهر نشاط قناة متعدد تصرف مع تصرف الذروة من 600 PS في المتوسط. الذي انخفض فور إضافة 1 ملم ATP إلى الحمام. التأثير الكلي للاعبي التنس المحترفين هو ل...

ووصف طريقة لعزل الحويصلات submitochondrial المخصب في F1FO ATP مجمعات سينسيز من دماغ الفئران. هذه الحويصلات تسمح دراسة النشاط من مجمع أتباز F1FO والتشكيل وذلك باستخدام أسلوب التصحيح تسجيل المشبك.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

تشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية الهامة، بما في ذلك التمثيل الغذائي، والبقاء1، والنمو، وتأشير الكالسيوم2. ومن أهم...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل حويصلات F1 F zero APAs من دماغ الجرذ لإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الدماغ من الجرذ ثم تجنيسه. وتتمثل الخطوة الثانية في تفكيك المناطق التشابكية عن طريق تسليط الضغط.بعد ذلك، يتم وضع السينابتوسومات في طبقات فوق تدرجات القوارير. وتتمثل الخطوة النهائية في التحضين مع digitonin و L للحصول على الحويصلات النهائية لتسجيل تثبيت الرقعة. وتعد عملية إنتاج TP عن طريق الفسفرة التأكسدية وظيفة مهمة للميتوكوندريا.الإنزيم المسؤول عن إنتاج الـ ATP هو إنزيم ATP synthase الموجود في الغشاء الميتوكوندري الداخلي. ولدراسة وظيفة ATP synthase بالتفصيل، نقوم بعزل حويصلات ميتوكوندرية فرعية خاصة نطلق عليها اسم SMVs، وهي تحتوي على إنزيم ATP synthase في تكوين معكوس (inside out).ثم نقوم بتسجيل هذه الـ SMVs باستخدام قطب تثبيت الجهد (patch clamp electrode)، ونحدد مدى نفاذية غشائها. وهذا يخبرنا عن كفاءة إنتاج الـ TP بواسطة الميتوكوندريا. التي ستقوم بتوضيح هذا الإجراء اليوم هي سيلفيا تي، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبري بجامعة ييل.في هذا الإجراء، بعد الحصول على رأس الجرذ عن طريق فصل الرأس، يتم قص الجلد لكشف الجمجمة، ثم فتح الجمجمة برفق عن طريق قصها باستخدام مقص أو قصاصة Rons. بعد ذلك، يتم استخراج الدماغ، ثم فرم الدماغ بدون المخيخ، وفي النهاية عزله في محلول منظم، ثم نقله إلى مجانس زجاجي من التيفلون سعة 5 mL، حيث يتم تجنيس النسيج برفق 10 مرات، لمدة خمس دقائق تقريباً في المجمل. بعد ذلك، يتم طرد العينة مركزياً بسرعة 1,500 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.احفظ السائل الطافي الذي يحتوي على الميتوكوندريا والجسيمات المشبكية وتخلص من الراسب. بعد ذلك، قم بطرد مركزه مرة أخرى بسرعة 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي. ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول عزل منظم، وقم بتفكيك الجسيمات المشبكية باستخدام وعاء تفكيك الخلايا عن طريق تطبيق ضغط قدره 1,200 PSI لمدة 10 دقائق، يليه تخفيف سريع للضغط. ضع الجسيمات المشبكية المفككة فوق أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على تركيزين مختلفين من fial واللذين سيشكلان طبقتين.بعد ذلك، ضع الأنابيب في دوار من طراز SW 50.1 وقم بالطرد المركزي عند 126,500 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وفي جهاز الطرد المركزي الفائق، تكون الراسبة هي الميتوكوندريا المنقاة. أما الطبقة الموجودة بين الكثافات المختلفة في الأنبوب فهي السينابتوزومات غير المتفككة.بعد ذلك، يتم غسل الراسب عن طريق الطرد المركزي في محلول عازل للعزل عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مكتبي. الآن، أعد تعليق الميتوكوندريا في 200 µL من محلول عازل للعزل، مضافاً إليه حجم مساوٍ من digitonin بنسبة 1%.ضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، أضف المزيد من منظم العزل (isolation buffer) وقم بالطرد المركزي بسرعة 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. كرر هذه العملية مرتين، ثم أعد تعليق الراسب في 200 µL من منظم العزل، وأضف 2 µL من مزيج Lybra PX بتركيز 10%، ثم ضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك، يتم وضع الخليط في طبقات من منظم العزل (buffer) في أنابيب الطرد المركزي. توضع الأنابيب في دوار SSW 50.1 ويتم إجراء الطرد المركزي عند 182,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة.اغسل الراسب النهائي عن طريق طرده مركزياً في محلول عازل عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. تشتمل منصة الفيزيولوجيا الكهربائية النموذجية على مضخم، وجهاز كمبيوتر شخصي مجهز بـ digi data 1, 440، وواجهة محول من تماثلي إلى رقمي بالتزامن مع برنامج P clamp, 10.0، وأجهزة تحكم دقيقة، ومجهر، وطاولة عزل للاهتزازات، وقفص فاراداي. أولاً، اسحب ماصة من أنبوب شعري من زجاج البوروسيليكات باستخدام ساحبة ماصات دقيقة تعمل باللهب.يجب أن تتراوح المقاومة المثالية للماصة بين 80 و100 mega ohm. أضف الحويصلات دون الميتوكوندريا في محلول داخل خلوي فسيولوجي. ثم املأ ماصة تثبيت الرقعة (patch clamp pipette) بنفس المحلول.قم بمعاينة الحويصلات تحت مجهر تباين الطور بعد تثبيت الحويصلات الغشائية الصغيرة (SMVs) في درجة حرارة الغرفة. سجل النشاط عند الحفاظ على الجهد الغشائي عند جهد يتراوح من -100 millivolts إلى +100 millivolts لمدة 10 seconds لكل فترة.تتم تصفية البيانات المسجلة عند تردد 5 kHz باستخدام دوائر المضخم ويتم تحليلها بواسطة برنامج clamp fit 10.0. يوضح هذا الشكل لطخة من المستخلص المحضر من السيتوزول والميتوكوندريا. ويظهر اللوح العلوي لطخة مناعية باستخدام جسم مضاد ضد البروتين السيتوزولي GA dh.تظهر اللوحة السفلية لطخة مناعية باستخدام جسم مضاد ضد بروتين الغشاء الداخلي للميتوكوندريا Cox four. وهنا يوجد تسجيلان ممثلان لتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) قبل وبعد إضافة 1 mM من ATP. جهد التثبيت هو 70 mV. يمثل الخط المتقطع 0 pA.يتم تسجيل كل أثر لمدة 10 ثوانٍ، مع وجود فاصل زمني قدره 10 ثوانٍ بين الآثار المعروضة. تظهر هنا آثار نموذجية لتغيرات شدة فلورة مؤشر CMA بمرور الوقت في وجود SMVs، وفي حالة الغياب والحضور لـ TP. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا، والحويصلات تحت الميتوكوندريا التي تحتوي على F1 FO 80 TP Synthes. علاوة على ذلك، يجب أن تفهم كيفية تشكيل ختم مقاوم لـ I باستخدام قطب كهربائي على غشاء الحويصلة لتحليل نشاط القناة لمجمع A TP Syntase.

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

ويهدف هذا كمقدمة لتصحيح تسجيل المشبك من البويضات القيطم المورق. وهو يغطي إزالة الغشاء المحي ، وتشكيل ختم gigaohm (gigaseal) ، وتحويل اختياري من التصحيح إلى طوبولوجيا خارج التدريجي.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات...

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

يصف هذا البروتوكول تقنية تسمى الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية الكاملة ، وهي طريقة لدراسة الخواص الكهربائية للخلايا العصبية Mauthner والخلايا الشبكية الشوكية الأخرى في أجنة الزرد.

الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية الكاملة: طريقة لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية

طورنا في الدماغ الشوكي الحبل إعداد سليمة لتسجيل ورصد النشاط الكهربائي عبر التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية والخلايا ماوتنر الشبكي الأخرى في الأجنة الزرد. وبالتالي، نحن قادرون على تسجيل التيارات متشابك مثير والمثبطة، والنشاط قناة الجهد بوابات وإمكانات العمل من الخلايا العصبية الرئيسية في الجنين النامية.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

لاستكمال الأساليب المستخدمة شيوعا لدراسة TRPV4، ويتم وصف طريقتين: mechanosensitivity ويمكن لها أن تدرسها كا 2 + luminometry-aequorin في الخميرة المعدلة وراثيا على التحدي للفراش لا تسبب الاسموزي. فإنه يمكن أيضا أن تدرس في TRPV4-RNA حقن البويضات القيطم من قبل خلية كاملة يومين الجهد الكهربائي المشبك المشبك أو التصحيح في خلية أو في وضع رفعه.

Luminometric الخميرة و القيطم سيت الكهربية الامتحانات من Mechanosensitivity الجزيئي للTRPV4

ويتجلى إعادة تشكيل البروتين الغشاء، KvAP، إلى الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) للطريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation، وبمساعدة هلام التورم. في كلتا الطريقتين، وتنصهر الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتين معا لتشكيل GUVs التي يمكن بعد ذلك دراستها من قبل المجهري مضان والتصحيح، المشبك الكهربية.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

تفصل مقالة هذه الطريقة الخطوات الرئيسية في قياس تسرب H + عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي باستخدام تقنية المشبك التصحيحي ، وهو نهج جديد لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا.

استخدام تقنية المشبك التصحيحي لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا

على الرغم من التقدم الأخير، العديد من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة لا تزال مع وظائفها غير معروف تماما. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الراسية، والتي كانت أساسية لتوضيح وظائفها الجزيئية.

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

تستغل هذه الطريقة مساهمة مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا في تسرب البروتون منخفض التوصيل لتحديد عتبة الجهد لفتح المسام في فئران متلازمة X الهشة لحديثي الولادة مع زيادة محتوى الإنزيم المساعد للميتوكوندريا في الخلايا العضلية القلبية Q مقارنة بالتحكم في النمط البري.

تقييم الاحتمال المفتوح لمسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا في إعداد فائض الإنزيم المساعد Q

مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة لقياس نشاط القناة الأيونية مباشرة على الحويصلات داخل الخلايا باستخدام نظام مشبك التصحيح اليدوي داخل اليزوسوم. نوضح الطريقة التي تتضمن تكبير الجسيمات الداخلية وعزل هذه الحويصلات يدويا. يضمن هذا النهج أن الباحثين يمكنهم تكرار الإجراء وتطبيقه بدقة.

تقنيات المشبك الرقعة لتحليل الحويصلة الداخلية الفردية

تعلم عزل الحويصلات دون الخلوية الغنية بمركبات F1FO ATP synthase من دماغ الجرذ. تتيح هذه الطريقة دراسة نشاط ATPase وتعديله باستخدام تقنية التسجيل المشبك التصحيح.

استكشف المزيد من الفيديوهات