₁ F _O أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل حويصلات F1 F صفر APAs من دماغ الفئران لإجراء تسجيلات مشبك التصحيح. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الدماغ أولا من الفئران وتجانسه. الخطوة الثانية هي تعطيل المناطق المشبكية عن طريق الضغط

بعد ذلك ، يتم وضع الجسيم المشبكي في طبقات على تدرجات القارورة. الخطوة الأخيرة هي الاحتضان باستخدام الرقم و L للحصول على الحويصلات النهائية لتسجيل مشبك التصحيح. وظيفة مهمة للميتوكوندريا هي إنتاج TP عن طريق الفسفرة المؤكسدة.

الإنزيم المسؤول عن إنتاج TP هو سينسيز TP الموجود في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. لدراسة وظيفة سينسيز TP بالتفصيل ، نقوم بعزل حويصلات الميتوكوندريا الفرعية الخاصة التي نسميها SMVs. أنها تحتوي على إنزيم سينسيز TP في تكوين من الداخل إلى الخارج.

ثم نسجل هذه SMVs باستخدام قطب كهربائي مشبك التصحيح ، ونحدد تسرب غشاءها. يخبرنا ذلك عن كفاءة إنتاج TP بواسطة الميتوكوندريا. ستظهر هذا الإجراء اليوم سيلفيا تي ، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبري في جامعة ييل.

في هذا الإجراء ، بعد الحصول على رأس الفأر عن طريق قطع الرأس ، قم بقص الجلد لفضح الجمجمة ، ثم افتح الجمجمة برفق عن طريق قصها بمقص أو رونز. بعد ذلك ، قم بإزالة الدماغ ، وقم بفرم الدماغ بدون المخيخ أخيرا في عزلة ، وقم بنقله إلى خالط تفلون زجاجي سعة خمسة ملليلتر ، وقم بتجانس الأنسجة بلطف 10 مرات ، أي ما يقرب من خمس دقائق في المجموع. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1 ، 500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي.

احفظ المادة الطافية مع الميتوكوندريا والمشبك وتخلص من الحبيبات. ثم قم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 16،000 مرة ، G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحنك في 500 ميكرولتر من العزل العازل ، قم بتعطيل المشابك باستخدام وعاء تعطيل الخلية عن طريق تطبيق ضغط 1 ، 200 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق ، متبوعا بطبقة تخفيف الضغط السريع لمناطق المشبك المعطلة على أنابيب الطرد المركزي بتركيزين مختلفين من الرافعة التي ستشكل طبقتين.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب في دوار SW 50.1 وجهاز طرد مركزي عند 126 ، 500 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في جهاز الطرد المركزي الفائق ، يكون الحنك هو الميتوكوندريا المنقى. الطبقة بين الكثافات المختلفة للفيال هي الجسيم المشبك غير المنقطع.

بعد ذلك ، اغسل الحبيبات عن طريق الطرد المركزي بمعزل عن غيرها. عازل عند 16 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة. الآن Resus ، قم بتعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل ، جنبا إلى جنب مع حجم متساو من 1٪ رقم توين.

ضعه على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف المزيد من العزل والمخزن المؤقت والطرد المركزي عند 16،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. كرر هذا الإجراء مرتين ، ثم أعد تعليق الحنك في 200 ميكرولتر من عازلة العزل ، وأضف ميكرولترين من حمالة الصدر 10٪ Lu ، PX ، واخلطها وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، ضع طبقة من الخليط في عزلة ، عازلة في أنابيب الطرد المركزي. ضع الأنابيب في دوار SSW 50.1 وقم بطردها عند 182،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة.

اغسل اللوحة النهائية عن طريق طردها في عازل معزول عند 16,000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. يشتمل جهاز الفيزيولوجيا الكهربية النموذجي على مكبر للصوت ، وجهاز كمبيوتر شخصي مزود ببيانات digi 1 ، 440 ، وواجهة محول تناظرية إلى رقمية جنبا إلى جنب مع مشبك P ، و 10.0 معالجات برامج ، ومجهر ، وطاولة عزل اهتزاز ، وقفص فاراداي. أولا، اسحب ماصة من أنبوب شعري من زجاج سيليكات بوروس في مجتذب ماصة صغيرة بنية مشتعلة.

يجب أن تكون المقاومة المثلى للماصة بين 80 و 100 ميجا أوم. أضف حويصلات الميتوكوندريا الفرعية في محلول فسيولوجي داخل الخلايا. ثم املأ ماصة مشبك التصحيح بنفس المحلول.

تصور الحويصلات تحت تباين الطور. الفحص المجهري بعد ترقيع SMVs في درجة حرارة الغرفة. سجل النشاط عندما يتم الحفاظ على إمكانات الغشاء عند جهد يتراوح من سالب 100 مللي فولت إلى موجب 100 مللي فولت لمدة 10 ثوان في كل فترة.

يتم تصفية البيانات المسجلة عند خمسة كيلو هرتز باستخدام دائرة مكبر الصوت وتحليلها باستخدام برنامج clamp fit 10.0. يوضح هذا الشكل بقعة المحللة المحضرة من العصارة الخلوية والميتوكوندريا. تظهر اللوحة العلوية بقعة مناعية باستخدام جسم مضاد ضد البروتين العصاري الخلوي GA dh.

تظهر اللوحة السفلية بقعة تستخدم جسما مضادا ضد بروتين الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. كوكس أربعة فيما يلي تسجيلان تمثيليان لمشبك التصحيح قبل وبعد إضافة ملي مولار واحد TP. إمكانية الاحتفاظ موجبة 70 مللي فولت. يمثل الخط المتقطع صفر بيكوأمبير.

يتم تسجيل كل تتبع لمدة 10 ثوان وهناك 10 ثوان بين التتبعات والعرض. فيما يلي أمثلة على آثار تغيرات شدة التألق لمؤشر CMA بمرور الوقت في وجود SMVs وفي غياب ووجود TP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا ، وهي حويصلة ميتوكوندريا فرعية لاحتوائها على F1 FO 80 TP Synthes. علاوة على ذلك ، يجب أن تفهم النموذج الأول ختم المقاومة مع قطب كهربائي على غشاء الحويصلة لتحليل نشاط قناة مركب A TP Syntase.