تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل الخصائص المشبكية والاستثارة لأسماك الحمار الوحشي الجنينية التي تدم خلاياها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح جنين أسماك الحمار الوحشي أولا لفضح السطح البطني للدماغ الخلفي. الخطوة الثانية هي وضع المستحضر المفصل على مسرح مجهر المشبك الرقعة ، وتحديد الفم في خلاياهم.

التصحيح التالي. قم بتثبيته على الخلايا M باستخدام وضع التسجيل المناسب وسجل النشاط المشبكي وخصائص الاستثارة. الخطوة الأخيرة هي تحليل البيانات المسجلة للتأكد من خصائص التشابك أو الاستثارة.

في النهاية ، يتم استخدام لقط التصحيح من هذه الخلايا لإظهار خصائص المستقبلات المشبكية في الكائن الحي النامي. بشكل عام ، سيكون لدى الأفراد الجدد في هذه الطريقة مجالين رئيسيين من الصعوبة. الأول هو التشريح.

يمكن أن يكون التشكيل الثاني لمشهد الحفلة أمرا صعبا. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررت العمل على مستحضر سمكة الزرد حيث تم ربط الدماغ الخلفي بالحبل الشوكي ، مما يدل على أن الإجراء سيكون بورام روي ، طالب دراسات عليا في مختبري ، ابدأ هذا الإجراء بإعداد طبق التشريح المبطن بالسرد. أولا ، قم بتثبيت الغسالات على الشريحة بالشحوم.

ثم أضف الشارد السائل إلى وسط الغسالة. عادة ما يشفى القرميد بين عشية وضحاها ويشكل سريرا دائريا صغيرا على الشريحة الزجاجية ، والذي يصبح قاعدة طبق التشريح. بعد وضع زلة غطاء على الشريحة ، ضع الشريحة في غرفة التسجيل لتكون بمثابة قاعدة للتشريح.

بعد ذلك ، قم بإعداد الحلول المطلوبة. يجب ترك المحاليل خارج الخلية في درجة حرارة الغرفة بينما يجب أن تبقى المحاليل داخل الخلايا معقمة. يمكن للمرء أيضا إضافة 0.1٪ فضفاضة للأصفر إلى المحلول داخل الخلايا ، بحيث يمكن إجراء تصور لمورفولوجيا الخلايا M في نهاية التجربة لتأكيد هوية الخلية.

بعد ذلك ، قم بتربية أجنة أسماك الحمار الوحشي من النوع البري في ماء البيض عند 28.5 درجة مئوية وجمعها ومرحلتها وفقا للمنشور السابق. للتشريح ، انقل الأجنة إلى طبق التشريح الذي يعمل أيضا كغرفة تسجيل. ثم قم بتخديرها لمدة سبع إلى 10 دقائق.

في محلول ملح مخدر يقترب عن كثب من المحلول الملحي الفسيولوجي ، يمكن للمرء تحديد ما إذا كان مخدرا بشكل كاف من خلال فحص الاستجابة لقرصة الذيل اللطيفة. بعد ذلك ، قم بتثبيت الأجنة من خلال عدم الاتفاق وعلى طبق خط الحماية SIL بسلك تنجستن 0.001 بوصة تحت مجهر تشريح بتكبير 25 ×. اضبط التكبير على نطاق التشريح إلى 40 إلى 50 × لإجراء التشريح.

الآن ، قم بإزالة عيني الفك والدماغ الأمامي باستخدام زوج ناعم من الملقط. قشر الدماغ الخلفي برفق بعيدا عن سلك العقدة الأساسي عن طريق عمل الملقط بعناية بين سلك العقدة والدماغ. ثم اقلب الدماغ الخلفي برفق بحيث يكون السطح البطني متجها لأعلى.

يوفر هذا الموضع وصولا جيدا إلى الخلايا M ، والتي عادة ما تكون في نطاق خمسة إلى 10 ميكرومتر من السطح البطني في الأجنة الصغيرة و 20 إلى 50 ميكرومتر في اليرقة الأكبر سنا. بعد ذلك ، انقل التحضير بعناية إلى إعداد التسجيل حيث يمكن إجراء تجربة مشبك التصحيح. يتم تصور الخلايا M بتباين التداخل التفاضلي ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام طرق أخرى للتصوير للتحضير لقط التصحيح.

ابدأ بسحب بعض ماصات CLA الرقعة بزجاج سيليكات بو سيليكات رقيق الجدران. في أقطار طرف الماصة الأفقية حوالي 0.2 إلى 0.4 ميكرومتر بعد تلميع الحريق إلى حافة ناعمة ، ويبلغ طول تفتق الساق حوالي أربعة ملليمترات. املأ طرف الماصة بمحلول داخل الخلايا عن طريق غمس طرفه في السائل داخل الخلايا.

ثم أدخل إبرة حقنة في الماصة وطرد المحلول داخل الخلايا برفق من المحقنة. لإنهاء ملء الماصة ، قم بتوصيل الماصة بمرحلة رأس مكبر الصوت في إعداد الفيزيولوجيا الكهربية ، من المهم الحفاظ على مرحلة الرأس بزاوية 45 درجة تقريبا للمحور الأفقي لأن هذا يضمن زاوية دخول للماصة مناسبة لتشكيل أختام عالية المقاومة مع وجود الفم في خليتها مباشرة قبل أن تنخفض الماصة في محلول الحمام مباشرة ، ضع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي على الماصة لتقليل فرصة انسداد الطرف. استمر في الاقتراب من الخلية M بكمية صغيرة من الضغط الإيجابي في الماصة.

يدفع الضغط الإيجابي الخلية برفق من جانب إلى آخر ، وعندما يتم وضعه مباشرة فوق الخلية يشكل غمازة صغيرة على غشاء الخلية. اترك الماصة الآن في مكانها لبضع ثوان لتنظيف سطح الخلية برفق بحيث يمكن تكوين ختم قوي بين الماصة والغشاء. ثم حرر الضغط الإيجابي في الماصة لبدء الختم.

كمية صغيرة من الضغط السلبي إلى جانب إمكانات الماصة السلبية إلى تكوين سدادات جيجا في غضون ثوان قليلة. بعد ذلك ، قم بتغيير إمكانات الاحتفاظ في مكبر الصوت إلى 60 مللي فولت تحت الصفر. تمزق غشاء الخلية بسلسلة من نبضات الشفط القصيرة.

ثم قم بتسجيل إمكانات الغشاء على الفور وتقليل القطع الأثرية للسعة. تعويض سعة الخلية ومقاومة الوصول بنسبة 70 إلى 85٪ يجب مراقبة مقاومة الوصول كل 30 ثانية إلى دقيقة ، وإذا كان هناك تغيير بنسبة 20٪ أو أكثر ، فقم بإجهاض التجربة. بمجرد انتهاء التجربة والحصول على بيانات كافية ، ضحي بالجنين عن طريق إزالة الدماغ الخلفي باستخدام زوج من الملقط.

يوضح هذا الشكل التسجيلات التمثيلية لتيارات مستقبلات MPA و NMDA المثيرة التي تم الحصول عليها من 48 جنينا HPF. فيما يلي PSCs العفوية A MPA ME المسجلة من خلية M بإمكانية الاحتفاظ ب 60 مللي فولت تحت الصفر. وهذا هو متوسط ME PSCs.

فيما يلي PSCs العفوية A MPA و NMDA me PSCs المسجلة من خلية M بإمكانية الاحتفاظ 40 مللي فولت. وهذا هو متوسط ME PSCs الغلوتامات لي تم تسجيل PSCs في وجود TTX ميكرومولار واحد لمنع إمكانات العمل خمسة ميكرومولار صارمة تسعة و 100 ميكرومولار ريتوكسين لمنع حدوث الجلايسين و G الموضح. فيما يلي MI PSCs العفوية المسجلة من خلية M بجهد احتجاز يبلغ سالب 60 مللي فولت.

وتم تسجيل متوسط MI PSCs MI PSCs في وجود TTX ميكرومولار واحد لمنع إمكانات العمل. حمض كيميريك مليمولار واحد لمنع نشاط مستقبلات الغلوتامات و 10 ميكرومولار بواسطة تشينغ لمنع حدوث GABA. هذه هي إمكانات الفعل المسجلة من خلية M في هذه الخلية بالذات.

أثار حافز عتبة SRA البالغ 0.48 نانو أمبير العديد من إمكانات الفعل ، لكن حافز العتبة يؤدي فقط إلى إنتاج جهد فعل واحد. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصحيح سجل المشبك من الخلايا M والخلايا العصبية الشوكية الشبكية الأخرى في أجنة الزرد.