التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة

لتوليد البلاعم المشتقة من نخاع العظم لتحليل الاستقطاب. يتم عزل عظام عظم الفخذ والساق من الفئران ويتم جمع خلايا نخاع العظام. ثم يتم زراعة الخلايا في وسط يحتوي على عوامل نمو للحث على تكوين البلاعم.

بعد سبعة أيام من الاستزراع ، يتم التعامل مع البلاعم المشتقة من نخاع العظم بمحفزات مختلفة وبلاعم مستقطبة. يتم تحليل استجابات التنشيط عن طريق قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي ، ويتم الحصول على نتائج تحليل blos الغربية التي تظهر نقاء عاليا من البلاعم المشتقة من نخاع العظم مع استجابات تنشيط مستقطبة إما ل M1 أو M اثنين. كذبة المحفزات.

يتمثل الأثر الضمني لهذه التقنية في الوقوف نحو علاج أو تشخيص الأمراض المرتبطة بالتنوع ، بما في ذلك مقاومة الأنسولين و CROs لأن البلاعم المتسللة للتائي هي لاعب رئيسي في هذا السياق ، ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تسريع خلية نخاع العظم صعب إلى حد ما والعائد أمر بالغ الأهمية للحصول على إعداد كاف لخلية الدراسة للحث على تكوين البلاعم العمل في غطاء معقم. ابدأ هذا البروتوكول بعظام عظم الفخذ والساق المعزولة من الفئران التي يبلغ عمرها ستة إلى ثمانية أسابيع في طبق زراعة الأنسجة. اشطف العظام في PBS ثم استخدم المقص لفتح طرفي العظام ، مع الحرص على عدم إزالة الكثير أثناء إمساك العظم بالملقط.

أدخل إبرة قياس 21 على 23 مع حقنة 10 ملليلتر تحتوي على PBS بارد مع 2٪ FBS منشط للتسخين في أحد طرفي العظم. اضغط على المكبس لطرد النخاع إلى طبق جديد لزراعة الأنسجة. بعد ذلك ، مرر النخاع عبر نفس الإبرة أربع إلى ست مرات لفصل الخلايا.

ثم صب الخلايا في مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة كتل الخلايا والعظام والشعر والخلايا أو الأنسجة الأخرى. اجمع التدفق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بمجرد مرور المحلول عبر المرشح ، أضف ثلاثة أحجام من 0.8٪ كلوريد الأمونيوم إلى التدفق واحتضانه على الجليد لمدة 10 دقائق.

لإزالة خلايا الدم الحمراء بعد الحضانة ، قم بتدوير الخلايا عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 إلى 50 مل من PBS البارد مع 2٪ FBS. عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

قم بتدوير الخلايا عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق أربع درجات مئوية. بعد صب supinate. تابع للحث على تكوين BMDM كما هو موضح في القسم التالي من البروتوكول للحث على تكوين BMDM Resus ، قم بتعليق خلايا نخاع العظم المعزولة في وسط نمو BMDM بتركيز مرتين.

قم بتوسيط الخلايا الست لكل بذرة مليلتر من واحد إلى اثنين في 10 إلى الخلايا الست في كل بئر من صفيحة زراعة أنسجة بئر من ستة أو 12 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. البذر عند هذا التركيز سيسهل الانفصال عن قياس التدفق الخلوي بعد ثلاثة أيام. قم بالتغيير إلى وسط نمو BMDM الطازج في اليوم السابع.

يتم تقييم تكوين BMDM الناضج باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي والأجسام المضادة المترافقة بالفلورول للكشف عن الخلايا التي تعبر عن CD 11 B و F four 80. بعد التحقق من تكوين BMDM الناضج ، التغيير إلى وسيط الصدى المعدل ل cove مع 10٪ FBS و LPS أو LPS والإنترفيرون جاما لتنشيط M1 أو IL أربعة أو IL 13 لتنشيط M اثنين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بعد 24 ساعة.

اجمع MDMs المحفزة عن طريق فصلها عن الطبق. للقيام بذلك ، قم بإزالة الوسط من الخلايا وغسله باستخدام PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. ثم أضف 0.05٪ التربسين الدافئ الذي يحتوي على 0.48 مللي مولار ، ويحتضن EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 10 دقائق لتجنب فقدان البروتينات السطحية بسبب الإفراط في الهضم.

ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الذي يحتوي على 10٪ FBS ونقلها إلى أنابيب عينة سعة 1.2 ملليلتر. استخدم الأجسام المضادة للكشف عن التعبير عن مستضدات سطح الخلية بما في ذلك CD 11 BF four 80 أو CD 11 C أو CD 2 0 6 أو CD 69 أو CD 80 أو CD 86 في نقاط زمنية مختلفة. استخدام إجراءات تلطيخ قياس التدفق الخلوي القياسية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

تحديد مستويات التعبير عن IL واحد بيتا TNF ألفا و IL ستة لتقييم تنشيط M1 أو IL 10 IL 13 و arginase one و PPAR gamma لتقييم تنشيط M اثنين. أخيرا ، قم بإجراء النشاف الغربي لتقييم تنشيط مسارات إشارات الخلية المشاركة في تنشيط M1 أو M اثنين من الضامة لتقييم نقاء BMDM الناضج. بعد التحليل الخلوي للتدفق التعريفي ، تم إجراء الأجسام المضادة ضد CD 11 BF أربعة 80 و CD 11 C و CD 2 0 6 B.MDMs تم تسييلها أولا على FSC و SSC لإزالة DRI والمقارنتين.

تم تعريف MDMs الناضجة b على أنها CD 11 B إيجابية F أربعة 80 مجموعات سكانية فرعية إيجابية ، والتي تظهر في الجزء العلوي الأيمن من هذه المؤامرة وأضرت بنسبة 95 إلى 99٪ من السكان المسورين لتقييم استقطاب البلاعم. تم إجراء مزيد من التحليل. تم إجراء البوابة الأولى لتحديد البلاعم المتسللة إلى الأنسجة ، وهي CD 11 B إيجابية F أربع خلايا موجبة 80.

من بين تلك البلاعم M1 ، التي تكون CD 11 C موجبة و CD 2 0 6 سالبة تظهر في الربع الثاني ، في حين أن M اثنان من البلاعم ، وهما CD 11 C سالب و CD 2 0 6 إيجابي يظهر الربع أربعة. لتقييم خلايا تنشيط البلاعم ، تم تحضينها إما باستخدام LPS للحث على تنشيط M1 أو IL أربعة لتنشيط M الثاني. عند التنشيط ، زاد حجم البلاعم كما يتضح من تحول FSCA من M1 أو M اثنين من البلاعم في 24 ساعة بعد التحفيز مقارنة ب M صفر غير معالج.

كما تم تحليل علامات السطح المتعلقة بتنشيط البلاعم بعد التحفيز. تم تقييم علامات الاستجابة المبكرة CD 69 بعد خمس أو 24 ساعة من التحفيز ، وتم تحليل علامات CD 80 و CD 86 في 48 ساعة بعد التحفيز. كما هو موضح هنا ، شوهدت زيادة وفرة السطح CD 69 و CD 80 و CD 86 في البلاعم المحفزة لتقييم التنشيط الكلاسيكي والبديل للضامة.

تم جمع تلك التي تم تحفيزها إما باستخدام LPS أو IL أربعة لمدة 24 ساعة وتم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي للتحليل بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي كما هو موضح هنا. تم الكشف عن ارتفاع تعبير الأرجيناز الأول وتعبير جاما PPAR في M اثنين من البلاعم مقارنة بالتعبير عن الضامة غير المعالجة للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات. زاد إنترلوكين واحد بيتا نخر نخر ألفا في البلاعم M1 لتقييم تنشيط مسار NF kappa B بواسطة الأجسام المضادة LPS ضد P 65 و Fophospho المرتبط P 65 تم استخدامه في تحليل اللطخة الغربية كما هو موضح هنا.

يظهر شريط أقوى ضد P 65 الفسفوري مع أخذ علاج LPS. تشير هذه البيانات معا إلى البلاعم المشتقة من نخاع العظام مع استجابات تنشيط مستقطبة إما لمحفازين M1 أو M. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد البلاعم المشتقة من نخاع العظام ، متبوعا بتحليل التنشيط المستقطب.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقييم نقاء البلاعم المتمايزة قبل اختبار استجابتها. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة مثل التعدي العابر للجينات أو SHRA من أجل الإجابة على سؤال إضافي مثل ، كيف تشارك الجينات في تنظيم تنشيط البلاعم؟