استقطاب M1 و M2 الإنسان الخلايا المشتقة من Monocyte وتحليل مع تدفق قياس الخلايا على عدوى السل المتفطرة

يوفر هذا البروتوكول الفرصة لمتابعة الاستقطاب المناعي للخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية بناء على التصور والتوصيف العميق لبروتين الفلورسنت الأخضر المسمى Mtb في مجموعات فرعية متنوعة من البلاعم باستخدام 10 قياس تدفق الألوان. يمثل هذا طريقة فعالة وقابلة للتكرار لدراسة الاستجابات لعدوى Mtb في البلاعم المستقطبة M1 أو M2 ، بما في ذلك تقييم النمط الظاهري والوظيفة قبل وبعد العدوى. لعزل PBMC عن المعاطف المصنوعة من المتبرعين البشريين ، استخدم ماصة لتراكب 15 مل من دم المعطف المصقول ببطء على جانب أنبوب سعة 50 مليلتر على 15 مل من وسط تدرج الكثافة وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

استخدم ماصة باستور معقمة لإزالة طبقة البلازما العلوية ونقل طبقة الخلية أحادية النواة بعناية إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. أضف وسيط RPMI الخالي من المصل إلى الخلايا إلى حجم نهائي يبلغ 50 مل واقلب الأنبوب برفق عدة مرات قبل الطرد المركزي. ثم أعد تعليق الخلايا في 20 مل من الوسط الخالي من المصل للعد.

لبدء تمايز البلاعم ، قم بتخفيف الخلايا إلى 5 أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر من تركيز متوسط خال من المصل وزرع ملليلترين من الخلايا في آبار فردية من صفيحة من ستة آبار. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق بقيعان الآبار. في نهاية الحضانة ، اغسل الآبار ثلاث مرات بمليلتر واحد من الوسط الخالي من المصل لكل غسلة ، وأضف ملليلترين من وسط RPMI الكامل المكمل ب 50 نانوغرام لكل مليلتر من GM-CSF أو 50 نانوغرام لكل مليلتر من M-CSF للتمايز M1 أو M2 على التوالي لكل بئر من الخلايا الملتصقة.

بعد ثلاثة أيام من بدء الاستقطاب ، استبدل بعناية ملليلتر واحد من المادة الطافية من كل بئر بمليلتر واحد من الوسط الكامل الطازج المكمل بعوامل النمو المناسبة. في اليوم السادس من الاستزراع ، أضف 50 نانوغرام لكل مليلتر من إنترفيرون جاما و 10 نانوغرام لكل مليلتر من LPS إلى الآبار المعالجة GM-CSF و 20 نانوغراما لكل مليلتر من IL-4 إلى الآبار المعالجة M-CSF. تحقق من مورفولوجيا مزارع الخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة بانتظام عن طريق المجهر الضوئي للتأكد من أن الخلايا الوحيدة الأصغر تتمايز إلى خلايا أكبر تشبه البلاعم.

لإعداد مزرعة Mtb ، في مرفق السلامة الحيوية من المستوى الثالث ، قم بخلط كمية ملليلتر واحدة من معلق البكتيريا المذابة مع تسعة ملليلتر من وسط السل الكامل في أنبوب غطاء مفلتر سعة 50 مليلتر من أجل حضانة لمدة 24 ساعة في الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا. في اليوم التالي ، اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 15 إلى 20 مل من وسط السل الطازج الكامل في أنبوب ثقافة غطاء جديد مفلتر سعة 50 مليلتر قبل إعادة البكتيريا إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد سبعة إلى 10 أيام من المزرعة ، اغسل البكتيريا مرتين في 35 إلى 40 مل من محلول الغسيل المعقم لكل غسلة ، مع تعليق البكتيريا في ملليلتر واحد من وسط RPMI الخالي من المصل بعد الغسيل الثاني.

أضف تسعة ملليلتر أخرى من وسط RPMI الخالي من المصل إلى البكتيريا وصوتنة البكتيريا في سونيكاتير حمام مائي في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم قم بقياس الكثافة البصرية لمليلتر واحد من التعليق البكتيري بطول موجي 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي الموجود داخل خزانة السلامة الحيوية. لإصابة الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية ، قم بتخفيف البكتيريا إلى 5 أضعاف 10 إلى 6 مستعمرة تشكل وحدات لكل مليلتر تركيز في وسط خال من المصل واستبدال المادة الطافية في كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا المكونة من ستة آبار بمليلتر واحد من الوسط الخالي من المصل ومليلتر واحد من تعليق البكتيريا لكل بئر للحصول على تعدد العدوى خمسة.

بعد حضانة لمدة أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا ، اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من مخزن الغسيل المعقم لكل غسلة ، مع إمالة اللوحة بعناية لإزالة الحجم الكامل للمخزن المؤقت من زوايا الآبار بعد كل غسلة. ثم أعد تعليق الخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة المصابة ب Mtb في ملليلترين من وسط كامل بدون مضادات حيوية. لتلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي ، احتضان الخلايا المصابة بملليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS المكمل ب 0.5 ملليمولار EDTA لكل بئر لمدة 30 دقيقة على الأقل.

في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا المنفصلة بسحب لطيف وانقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية مغطاة بالمسمار للطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في حوالي 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للإنسان المترافق بالفلوروكروم وصبغة الجدوى ذات الأهمية واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. بعد الغسيل ، قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من مخزن التثبيت المعد حديثا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.

بعد التثبيت والغسيل ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ونقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة مليلتر واحد. لتحليل الخلايا ، استخدم حبات التعويض لتعويض إشارة الفلورسنت لكل جسم مضاد مترافق بالفلوروكروم في الكوكتيل واستخدم الخلايا غير الملوثة لضبط البوابة لمجموعة الخلايا السالبة. ثم احصل على ما لا يقل عن 50،000 خلية لكل عينة.

تظهر كل من الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية M1 و M2 تحولا رأسيا إلى حبيبات أعلى وحجم خلية أقل عند عدوى Mtb. لوحظ أيضا موت الخلايا المعزز في خلايا M1 و M2 المصابة ب Mtb في تعدد العدوى خمسة مقارنة بخلايا M0 غير المصابة. وتجدر الإشارة إلى أنه لوحظ تعبير Mtb GFP أعلى بكثير في خلايا M2 بعد أربع ساعات من الإصابة مقارنة بخلايا M1.

يمكن تمييز خلايا M1 و M2 غير المصابة بمستقبلات CD64 و CD86 أو CD200 والتعبير المشترك CD163 على التوالي. بعد أربع ساعات من عدوى Mtb ، لوحظ زيادة في تكرار الخلايا الإيجابية لمستقبلات CD200 في الخلايا المستقطبة M1 الإيجابية Mtb GFP ، بينما يتم تقليل تعبير CD163 في خلايا M2. يمكن أيضا ملاحظة بكتيريا Mtb GFP في خلايا M1 الإيجابية CD64 وخلايا M2 موجبة CD163 عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

يكشف تحليل UMAP أن أربع ساعات من عدوى Mtb ليست كافية للتأثير على استقطاب البلاعم ، بينما ينتج عن 24 ساعة من العدوى مجموعات منفصلة بوضوح من خلايا M1 و M2 غير المصابة والمصابة التي تعبر عن ملفات تعريف تعبير علامات سطحية مميزة. علاوة على ذلك ، يظهر تحليل PhenoGraph أن 24 مجموعة مختلفة بأحجام مختلفة موزعة بشكل فريد بين الخلايا M1 و M2 غير المصابة و Mtb. يمكن أن تختلف فعالية استقطاب M1 أو M2 أو عدوى Mtb اختلافا كبيرا بين المتبرعين البشريين.

وبالتالي ، يوصى بإدراج اثنين على الأقل من المتبرعين في كل تجربة لتقليل الاختلافات التجريبية. يسمح هذا النموذج بالتقييم المتزامن للبلاعم البشرية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتحليل تعبير mRNA ، والمقايسات المتعددة للعوامل القابلة للذوبان ، والقياس الكمي البكتيري باستخدام تعبير GFP أو وحدات تشكيل المستعمرة.