قياس الكالسيوم داخل الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تقلبات الكالسيوم داخل الخلايا في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام الأصباغ الفلورية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير عينة الحيوانات المنوية بطريقة السباحة للأعلى (swim up)، وتعزيز عملية التأهيل (capacitation) إذا لزم الأمر. وتتمثل الخطوة الثانية في تحميل الحيوانات المنوية بصبغة فلورية للكالسيوم.

بعد ذلك، وباستخدام قياس الفلورية التقليدي أو قياس الفلورية بتدفق متوقف، أو قياس التدفق الخلوي، أو تصوير الخلية الواحدة، يتم إجراء التجربة وتسجيل قياسات الكالسيوم. وفي النهاية، تُحلل النتائج لتحديد التغيرات في تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا التي يحفزها البروجسترون أو التي تحدث أثناء عملية التكثيف. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تلك التي تتضمن النشاط الإشعاعي، في كونها إجراءً عالي الحساسية.

تتميز هذه الطريقة بأنها آمنة وسهلة التنفيذ. ويمكن لهذا المنهج أن يساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إشارات الكالسيوم باستخدام رنين البلازمون السطحي (SPR)، مثل تحديد المركبات التي تحفز زيادة الكالسيوم داخل الخلايا بدقة مكانية وزمنية عالية، وتحديد المجموعات الخلوية الفرعية المختلفة في عينة واحدة. وتمتد تداعيات استخدام تقنية قياس التدفق الخلوي، على سبيل المثال، نحو تشخيص مشكلات الخصوبة من خلال تحليل الحالة الفسيولوجية للأمشاج الذكرية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى معمقة في دراسة تعبئة الكالسيوم في الحيوانات المنوية البشرية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من الخلايا، مثل الأمشاج الذكرية من أنواع أخرى أو أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا العصبية أو الخلايا العضلية. وبشكل عام، قد يواجه الأفراد الذين يستخدمون هذه الطريقة صعوبة لأن التعامل مع الحيوانات المنوية ليس أمراً سهلاً، ومن الضروري الحفاظ على الظروف المناسبة للحصول على خلايا حيوية ومتحركة طوال فترة التجربة. وقد قمنا بتفعيل استخدام هذه التقنيات من خلال دمج استراتيجيات مستمدة من مجالات مختلفة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً هاماً لأن تحضير العينة والتعامل معها، وكذلك إضافة المركبات، يصعب تعلمها نظراً لإمكانية تضرر الخلايا الحيوانية خلال الإجراء، واحتمالية ظهور نتائج مضللة في الاستجابات أثناء إضافة المركبات. لتحضير عينة الحيوانات المنوية، يجب وضع 1 mL من وسط hams F 10 بعناية كطبقة فوق كل 500 µL من السائل المنوي المميع. وبشكل دقيق، المس جدار الأنبوب بطرف الماصة الدقيقة ووزع الوسط برفق فوق العينة.

من الضروري القيام بذلك ببطء لتجنب خلط طبقات العينة والوسط. يتم تدعيم الوسط بـ 2mM من كلوريد الكالسيوم و 5mg/mL من BSA. ولتعزيز عملية التمكين (capacitation) في المختبر، قم بإمالة الأنابيب بعناية إلى زاوية 30 درجة تقريباً.

سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح بين السائلين، مما يعزز إزاحة أو صعود الخلايا الحيوانية المنوية من العينة إلى الوسط أثناء الحضن. بعد ذلك، ضع أنابيب الاختبار المائلة داخل حضانة عند 37 درجة Celsius و 5% carbon dioxide و 95% air لمدة ساعة واحدة، ثم أخرجها بعد مرور الساعة.

استخدم ماصة دقيقة لإزالة 700 µL العلوية من وسط hams F 10 الذي يحتوي الآن على حيوانات منوية متحركة من كل أنبوب بعناية. اجمع كل العينات المجموعة في أنبوب زجاجي نظيف واحد، مع تجنب تكوين فقاعات. ضع 10 µL من العينة المجمعة على الزجاج المسطح البصري لقاعدة غرفة عد ماكلور ثم ضع غطاء الزجاج.

تأكد من تجنب تكون الفقاعات داخل الغرفة لأن ذلك سيؤدي إلى عدد خلايا غير دقيق. افحص العينة تحت مجهر مركب مجهز بعدسة شيئية 20 x. تحتوي الشريحة الغطائية لغرفة عد الخلايا على مربع كبير يتكون من 100 مربع أصغر.

قم بعدّ الخلايا في أي شريط مكون من 10 مربعات. يمثل هذا العدد تركيز الخلايا بمليون خلية لكل مليلتر. كرر عملية العد في شريطين إضافيين مكونين من 10 مربعات، ثم احسب المتوسط الحسابي للعدات الثلاث لتحميل الخلايا بصبغة فلورية.

اجمع في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter الحجم المطلوب من معلق الحيوانات المنوية مع كمية كافية من المحلول المخزون من flu oh 3:00 AM بتركيز one millimolar للحصول على تركيز نهائي قدره two micromolar من flu oh 3:00 AM. حضن المزيج لمدة 30 minutes عند درجة حرارة 37 °C مع الحماية من الضوء، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 750 G لمدة five minutes. يشير تكون سحابة بدلاً من كريّة إلى أن الخلايا في حالة جيدة؛ لذا اسحب السائل الطافي وتخلص منه، ثم أعد تعليق الكريّة في الحجم المناسب من وسط الحيوانات المنوية البشري أو HSM. لبدء هذه التجربة، اجمع في أنبوب زجاجي مسطح القاع 570 µL من HSM و 30 µL من معلق خلايا الحيوانات المنوية المحملة مسبقاً بـ flu oh 3:00 AM والمعاد تعليقها في HSM للحصول على تركيز 1×10⁸ خلية لكل milliliter.

ضع قضيب تحريك مغناطيسي داخل الأنبوب الزجاجي وأدخل الأنبوب في غرفة القراءة بجهاز المطياف المسخن مسبقاً إلى 37 °C. يجب تحريك العينة طوال فترة الحصول على البيانات. ابدأ التجربة باستخدام برنامج oli وقم بقياس قيم الفلورة بتردد 0.5 hertz لمدة 300 ثانية.

بعد الحصول على الفلورة الأساسية لمدة 30 ثانية، استخدم حقنة Hamilton دقيقة لحقن الحجم المناسب من المركب المختبر، وفي هذه الحالة يكون البروجسترون بتركيز micromolar عند الثانية 100. أما بالنسبة لـ ionomycin بتركيز 20 micromolar، فيُستخدم كضابط موجب للحصول على أقصى قيمة للفلورة. في هذه التجربة، يتم قياس تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا بدقة زمنية عالية.

باستخدام خلاط التدفق المتوقف SFM 20 المتصل بنظام بصري للحركية السريعة، املأ إحدى حقن الجهاز بـ 1 mL من خلايا الحيوانات المنوية المحملة في الساعة 3:00 صباحاً، والحقنة الثانية بـ 1 mL من المركب المراد اختباره، وهو 20 µM من البروجسترون المذاب في HSM.

في هذا المثال، من الضروري تجنب تكون الفقاعات أثناء سحب السوائل إلى المحاقن. ارفع مكابس الجهازين حتى تلامس طرف مكابس المحاقن. اضبط إجمالي وقت أخذ العينات في هذه الحالة على 50 ثانية والتردد على 10 ملي ثانية لتقليل تلف الخلايا، واضبط معدل التدفق على الحد الأدنى من القيمة التي توفر محفز استجابة قابل للقياس.

عند خلط الكواشف، سيظهر تتبع الفلورة الخام مقابل الزمن على شاشة الكمبيوتر. كرر هذا الإجراء مع استبدال البروجسترون بـ HSM كضابط سلبي و 10 micromolar ion mycin كضابط إيجابي قبل قياس التدفق الخلوي. قم بتحضير العينات التجريبية بوضع 500 microliters من معلق الخلايا في كل أنبوب قياس تدفق خلوي لكل حالة من الحالات المراد اختبارها.

قم بإعداد التجربة باستخدام برنامج الجهاز. أولاً، أنشئ مجلداً جديداً، وحدد عينة التجربة وعدد الأنابيب. بعد ذلك، اختر إعدادات جهاز قياس التدفق الخلوي المناسبة لـ flu O 3:00 AM. استخدم مرشحات fluorescein isothiocyanate و propidium iodide.

قم بتشغيل أنابيب التحكم غير المصبوغة الأولى والثانية في جهاز قياس التدفق الخلوي. اجمع بيانات التشتت الأمامي والجانبي للتحقق من ملاءمة إعدادات العتبة ولإنشاء البوابة المقابلة من أجل تمييز الحطام عن الخلايا. قم بتشغيل الأنابيب التجريبية واجمع بيانات الفلورة من 10,000 حدث لكل عينة.

في النهاية، يتم تصدير جميع البيانات إلى البرنامج المتاح للتحليل. يتم تحضير شرائح التغطية الدائرية اللازمة لهذا الإجراء عن طريق وضع قطرة بحجم 5 µL من محلول poly L lysine في مركز كل شريحة تغطية.

اتركها لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام، ثم اشطف المنطقة المعالجة بالماء. سيؤدي ذلك إلى إزالة البولي ليسين الزائد والسماح للخلايا المنوية بالالتصاق بالغطاء الزجاجي من رؤوسها بينما تظل سياطها قادرة على الحركة. قم بتجميع الغطاء الزجاجي داخل غرفة التسجيل.

ضع 10 µL من الخلايا المحملة بـ flu oh 3:00 AM بتركيز 1×10⁷ خلية/mL في مركز غطاء الشريحة. غطِّ الخلايا بـ 200 µL من HSM المسخن مسبقاً.

ضع الحجرة على منصة المجهر، المسخنة مسبقاً إلى 37 °C، وافحص الخلايا باستخدام تباين الطور. اختر منطقة تكون فيها كثافة الخلايا مناسبة للتصوير، حيث إن كثرة الخلايا تجعل التحليل صعباً بسبب تداخل الإشارات.

يجب أن تكون الخلايا ملتصقة بإحكام بغطائها الزجاجي عن طريق الرأس، ولكن مع إظهار حركة السوط، مما يؤكد حيويتها. ابدأ التجربة بتفعيل برنامج الحصول على الصور المتسلسلة زمنياً. عادةً ما يلزم التقاط أربع صور في الثانية مع إضاءة مدتها 2 milliseconds لكل صورة.

التقط صور الفلورسنس في الوضع الحي. لضبط التركيز والسطوع. استخدم ماصة دقيقة لإضافة مركب الاختبار، وهو البروجستيرون في هذه الحالة، بعناية على شكل قطرات، واستمر في التقاط الصور حسب الحاجة.

قم بإجراء إضافتين ضابطتين متتاليتين في نفس الغرفة: 20 µM من ion mycin للحصول على أقصى درجة من الفلورة، و5 mM من كلوريد المنجنيز للحصول على أدنى درجة من الفلورة. قم بإجراء تحليل الصور خارج الخط باستخدام برنامج IQ.

ارسم مناطق الاهتمام (ROIs) حول كل خلية أو جزء من الخلية. بالإضافة إلى ذلك، حدد منطقة خالية من الخلايا ليقوم البرنامج بطرح الخلفية تلقائياً. بعد ذلك، يتم الحصول على سلسلة زمنية لشدة الفلورة لكل منطقة اهتمام، ويمكن تصدير هذه البيانات إلى برنامج Microsoft Excel لإجراء مزيد من التحليل.

يعتبر البروجسترون أحد المحفزات المعروفة لتفاعل الأكروسوم، وكما هو متوقع، فإنه يحفز زيادة عابرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الحيوانات المنوية البشرية وفقاً لما تم قياسه بواسطة الفلورومترية التقليدية. يوضح تتبع الفلورسنت الأحمر مقابل الوقت تغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناتجة عن إضافة 4 µM من البروجسترون، وكعنصر تحكم سلبي تمت إضافة HSM، والتي لم تسبب أي تغيير في مستويات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا كما يشير تتبع الفلورسنت الأزرق، وكعنصر تحكم إيجابي، تم توضيح التغيير الناجم عن 10 µM من ion mycin لكل تتبع.

تؤدي إضافة ناقل أيونات الكالسيوم (calcium ionophore) هذا إلى حدوث أقصى زيادة في تركيز الكالسيوم الخلوي في خلايا RA، وهي زيادة لا تعود إلى المستويات الأساسية. يوضح هذا الرسم البياني العمودي متوسط التغير في الفلورة delta F لكل حالة، زائد أو ناقص الخطأ المعياري حيث N تساوي ثلاثة، وتشير النجمة إلى قيمة P أقل من 0.001 مقارنة بالمجموعة الضابطة. وقد تم قياس الزيادة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا التي حفزها البروجسترون بدقة زمنية أعلى باستخدام قياس الفلورة بالتدفق المتوقف (stopped flow fluorometry)، والنتائج الممثلة معروضة هنا.

تظهر الآثار الخام في اللوحة A، حيث أدى كل من البروجسترون الممثل بالخط الأحمر والـ ion mycin الممثل بالخط الأزرق إلى زيادة سريعة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. ويمثل الأثر الأخضر المجموعة الضابطة السالبة حيث خُلطت الخلايا مع HSM. وتوضح اللوحة B الآثار المصححة للإشارات الناتجة عن البروجسترون أو الـ ion mycin والتي تم الحصول عليها بطرح إشارة المجموعة الضابطة من الإشارات الخام المقابلة لها.

تسبب البروجسترون في زيادة سريعة وعابرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، حيث ظهرت أقصى قيمة للفلورة بعد 2.7 ثانية من إضافة المحفز. ومن ناحية أخرى، تسبب CIN في زيادة سريعة ومستمرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا على مدار 50 ثانية. يوضح المربع الداخلي في اللوحة B عرضاً مكبراً لأول 500 مللي ثانية من كل استجابة.

يتوافق غياب التأخير في زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا والمحفزة بالبروجسترون مع التقارير السابقة التي تشير إلى أن البروجسترون ينشط قناة الكالسيوم cat spur بشكل مباشر دون وجود إشارات وسيطة. كما تم قياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الحيوانات المنوية البشرية المكتسبة للقدرة على الإخصاب وغير المكتسبة لها باستخدام قياس التدفق الخلوي. تظهر هذه المخططات التمثيلية للتشتت الأمامي والجانبي.

تظهر الخلايا ذات القدرة على الإخصاب باللون الأزرق، بينما تظهر الخلايا غير القادرة على الإخصاب باللون الأحمر. يشار إلى البوابة المختارة بالخط الأزرق، وقد استُخدمت الخلايا الموجودة داخل تلك المنطقة فقط لإجراء مزيد من التحليلات. يوضح اللوح B مدرج التكرار الفلوري في قناة Fitzy للحيوانات المنوية غير المصبوغة، ويوضح اللوح D مدرج التكرار الفلوري في قناة FZ للحيوانات المنوية المصبوغة بـ flu oh 3:00 AM كما هو ملاحظ في اللوح D. إن توزيع قيم الفلورية للحيوانات المنوية ذات القدرة على الإخصاب، والممثل بالمنحنى الأزرق، منزاح نحو قيم أعلى مقارنة بالحيوانات المنوية غير القادرة على الإخصاب الممثلة بالمنحنى الأحمر.

يوضح اللوح C مخطط توزيع الفلورة في قناة PI للخلايا غير المصبوغة، بينما يوضح اللوح E مخطط توزيع الفلورة في قناة PI للخلايا الميتة. يمكن ملاحظة قيم الفلورة لكل خلية فردية في مخططات النقاط الفلورية ثنائية الأبعاد الموضحة هنا. وبالنسبة للخلايا غير المصبوغة والخلايا المصبوغة مزدوجاً بـ flu oh 3:00 AM و pi، يُشار إلى النسبة المئوية للخلايا المسجلة في كل ربع بواسطة الرقم الأحمر.

ومن المهم ملاحظة أنه يمكن التخلص من الإشارة الناتجة عن الخلايا الميتة. وأخيرًا، تم قياس التغير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجم عن البروجسترون في خلايا حيوان منوي مفردة من خلال التصوير؛ وتظهر صور الألوان الزائفة التمثيلية هذه الخلايا التي تمت رؤيتها في البداية وبعد إضافة البروجسترون، وCIN، وكلوريد المنجنيز. تؤدي إضافة البروجسترون إلى زيادة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، في كل من رأس الحيوان المنوي والـ lum، ويُستخدم كلوريد المنجنيز لتقليل الـ flu.

تظهر في هذا الشكل آثار الفلورة المعيارية التمثيلية الناتجة عن إخماد الفلورة في تمام الساعة 3:00 صباحاً لتسع خلايا فردية من التجربة. وكما لوحظ في تجارب المجموعات الخلوية، كشف تحليل الخلية الواحدة عن زيادة عابرة بالنسبة للبروجسترون وزيادة مستمرة بالنسبة لـ ion mycin على التوالي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق من حيوية الخلايا وإجراء الضوابط المناسبة بعد تنفيذ هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربائية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد قنوات أيونية معينة تشارك في زيادات الكالسيوم، وذلك باستخدام محاليل وبروتوكولات محاكاة مناسبة بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فيزيولوجيا الخلية لاستكشاف ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا الحية بدقة مكانية وزمنية عالية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار التقنية الأكثر ملاءمة لقياس الزيادات في الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام الصبغات الفلورية في أي نوع من الخلايا، وذلك بناءً على السؤال المحدد الذي ترغب في الإجابة عليه. لا تنسَ أن العمل مع عينات السوائل البشرية قد يكون خطيرًا، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل استخدام متبرعين ثبتت سلامتهم الصحية، واستخدام قفازات اللاتكس أثناء العملية، والتخلص المناسب من المحاليل والمواد.