قياس الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تقلبات الكالسيوم داخل الخلايا في المنوية البشرية بأصباغ الفلورسنت. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير عينة المنوية أولا بطريقة السباحة وإذا لزم الأمر ، تعزيز القدرة. الخطوة الثانية هي تحميل المنوية بصبغة فلورية من الكالسيوم.

بعد ذلك ، باستخدام القياس الفلوري التقليدي ، أوقف قياس التدفق الفلوري أو قياس التدفق الخلوي أو التصوير أحادي الخلية ، قم بإجراء التجربة وتسجيل قياسات الكالسيوم. في النهاية ، يتم تحليل النتائج لتحديد التغيرات في تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا التي يسببها هرمون البروجسترون أو أثناء عملية السعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تلك التي تنطوي على النشاط الإشعاعي هي أن هذا إجراء حساس للغاية.

إنه آمن وسهل التنفيذ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات الكالسيوم SPR ، مثل تحديد المركبات التي تحفز الكالسيوم داخل الخلايا ، ويزداد مع الدقة المكانية والزمانية العالية وتحديد مجموعات فرعية خلوية مختلفة في عينة سيمن. تمتد الآثار المترتبة على استخدام ، على سبيل المثال ، تقنية قياس التدفق الخلوي نحو تشخيص مشاكل الخصوبة من خلال تحليل الحالة الفسيولوجية للتدرجات الذكورية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدراسة تعبئة الكالسيوم للحيوانات المنوية البشرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع أخرى من الخلايا مثل التدرجات الذكرية من الأنواع الأخرى أو أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا العصبية أو خلايا العضلات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الذين يستخدمون هذه الطريقة لأن التعامل مع المنوية ليس سهلا ومن المهم الحفاظ على الظروف المناسبة للحصول على خلايا حركية قابلة للحياة من خلال التجربة. قمنا بتنفيذ استخدام هذه التقنيات من خلال الجمع بين الاستراتيجيات باستخدام مجالات مختلفة.

العرض المرئي لهذه الطريقة مهما حيث يصعب تعلم إعداد العينة والتعامل معها ، بالإضافة إلى إضافة المركبات لأن خلايا المنوية يمكن أن تتلف أثناء الإجراء ويمكن الحصول على القطع الأثرية في الاستجابات أثناء إصدار المركبات. لتحضير عينة الحيوانات المنوية ، يجب وضع ملليلتر واحد من وسط لحم الخنزير F 10 بعناية فوق كل 500 ميكرولتر من السائل المنوي. Eloqua ، المس جدار الأنبوب بطرف الماصة الدقيقة واستغني برفق عن الوسط فوق العينة.

من الأهمية بمكان القيام بذلك ببطء لتجنب خلط العينة والطبقات المتوسطة. يتم استكمال الوسط باثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولار وخمسة ملليغرام لكل مليلتر من BSA. لتعزيز السعة في المختبر ، قم بإمالة الأنابيب بعناية بزاوية 30 درجة تقريبا.

سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح بين السائلين ، وبالتالي تعزيز إزاحة أو تسبح خلايا المنوية من العينة إلى الوسط أثناء الحضانة. بعد ذلك ، ضع أنابيب الاختبار الخالية من الدهون داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. 95٪ هواء لمدة ساعة واحدة بعد ساعة واحدة.

استخدم ماصة صغيرة لإزالة 700 ميكرولتر علويا من وسط لحم الخنزير F 10 الذي يحتوي الآن على المنوية النشطة من كل أنبوب بعناية. قم بتجميع جميع العينات التي تم جمعها في أنبوب زجاجي نظيف واحد ، وتجنب تكوين الفقاعات. ضع 10 ميكرولترات من العينة المجمعة على الزجاج المسطح البصري لقاعدة غرفة العد البقعي وضع زجاج الغطاء.

تأكد من تجنب تكوين الفقاعات داخل الغرفة لأن ذلك قد يؤدي إلى عدد الخلايا غير الدقيق. راقب تحت مجهر مركب مجهز بهدف 20 ×. يحتوي زجاج الغطاء لغرفة العد البقعي على مربع كبير يتكون من 100 مربع أصغر.

عد الخلايا في أي شريط من 10 مربعات. يمثل هذا الرقم تركيز الخلية بملايين الخلايا لكل مليلتر. كرر العد في شريطين إضافيين بحجم 10 مربعات واحسب متوسط التهم الثلاثة لتحميل الخلايا بصبغة فلورية.

امزج في أنبوب فوج سعة 1.5 مليلتر ، الحجم المطلوب من تعليق المنوية مع ما يكفي من محلول مخزون إنفلونزا مليمولار واحد أوه 3:00 صباحا للحصول على تركيز نهائي من اثنين من الأنفلونزا الدقيقة أوه 3:00 صباحا احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومحمي من الطرد المركزي الخفيف الأنبوب عند 750 جم لمدة خمس دقائق. يشير تكوين سحابة بدلا من الحبيبات إلى أن الخلايا في حالة جيدة ، وتستنشق وتتخلص من المادة الطافية وتعيد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من وسط المنوية البشرية أو HSM. لبدء هذه التجربة ، امزج في أنبوب زجاجي مسطح القاع ، 570 ميكرولتر من HSM و 30 ميكرولترا من تعليق خلايا المنوية المحملة مسبقا بالأنفلونزا أوه 3:00 صباحا وتم تعليقها في HSM للحصول على واحد في 10 إلى الخلايا الثامنة لكل مليلتر.

ضع قضيب تحريك مغناطيسي داخل الأنبوب الزجاجي وأدخل الأنبوب في غرفة القراءة الخاصة بمقياس الطيف المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. يجب تقليب العينة طوال وقت الاستحواذ. ابدأ التجربة باستخدام برنامج oli واستمر في الحصول على قيم مضان بتردد 0.5 هرتز خلال 300 ثانية.

بعد الحصول على التألق القاعدي لمدة 30 ثانية ، استخدم حقنة هاميلتون الدقيقة لحقن الحجم المناسب لمركب الاختبار في هذه الحالة للهروجسترون الميكرومولار في 100 ثانية. عند 20 ميكرومولار أيون مايسين كعنصر تحكم إيجابي للحصول على أقصى قيمة مضانة. في هذه التجربة ، يتم قياس تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا بدقة زمنية عالية.

باستخدام خلاط التدفق المتوقفة SFM 20 مقترنا بنظام بصري حركي داء ، املأ إحدى محاقن الأدوات بملليلتر واحد من الأنفلونزا. 20 ميكرومولار من البروجسترون مذاب في HSM.

في هذا المثال ، من الضروري تجنب تكوين الفقاعات أثناء سحب السوائل إلى المحاقن. ارفع كلا المكابس الموسيقية حتى تلامس طرف مكاسات المحقنة. اضبط إجمالي وقت أخذ العينات في هذه الحالة على 50 ثانية والتردد على 10 مللي ثانية لتقليل تلف الخلية ، اضبط معدل التدفق على الحد الأدنى للقيمة التي ستوفر مشغل استجابة قابل للقياس.

عرض خلط الكواشف وأثر التألق الخام مقابل الزعتر على شاشة الكمبيوتر. كرر هذا الإجراء ، واستبدل هرمون البروجسترون ب HSM كعنصر تحكم سلبي و 10 ميكرومولار أيون مايسين كعنصر تحكم إيجابي قبل قياس التدفق الخلوي. قم بإعداد العينات التجريبية عن طريق وضع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل أنبوب مقياس الخلوي تحت كل حالة يتم اختبارها.

قم بإعداد تجربة باستخدام برنامج المعدات. أولا ، قم بإنشاء مجلد جديد وعينة تجربة وعدد الأنابيب. ثم حدد إعدادات مقياس الخلوي المناسبة للإنفلونزا O 3:00 صباحا. استخدم مرشحات إيزوثيوسيانات الفلورسينات ويوديد البروبيديوم.

قم بتشغيل أنابيب التحكم غير الملوثة واحد واثنين في مقياس الخلويات. جمع بيانات الانتثار الأمامي والجانبي للتحقق من أن إعدادات العتبة مناسبة وإنشاء البوابة المقابلة من أجل تمييز الحطام عن الخلايا. قم بتشغيل الأنابيب التجريبية وجمع بيانات التألق من 10،000 حدث لكل عينة.

في النهاية. تصدير جميع البيانات إلى البرنامج المتاح للتحليل. قم بإعداد زلات الغطاء المستديرة اللازمة لهذا الإجراء عن طريق تطبيق قطرة خمسة ميكرولتر من محلول بولي L ليسين على وسط كل زلة غطاء.

اتركيه لمدة ساعة على الأقل قبل الاستخدام ، اشطف المنطقة المعالجة بالماء. سيؤدي ذلك إلى إزالة البولي يسين الزائد والسماح لخلايا المنوية بالالتصاق بزلق الغطاء من رؤوسها بينما لا يزال بإمكان سوطها التحرك. قم بتجميع زلة الغطاء داخل غرفة التسجيل.

ضع 10 ميكرولتر من الأنفلونزا أوه 3:00 صباحا الخلايا المحملة بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر. في وسط زلة الغطاء. قم بتغطية الخلايا ب 200 ميكرولتر من HSM المسبق للتدفئة.

ضع الغرفة على منصة المجهر ، مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، واعرض الخلايا باستخدام تباين الطور. حدد منطقة تكون فيها كثافة الخلايا مناسبة للتصوير. تجعل الكثير من الخلايا التحليل صعبا بسبب الإشارات المتداخلة.

يجب أن تكون الخلايا متصلة بإحكام بزلة الغطاء من رأسها ، ولكن تظهر حركة سوط ، مما يؤكد الجدوى. ابدأ التجربة عن طريق تنشيط برنامج الحصول على صور السلاسل الزمنية. عادة ما تكون هناك حاجة إلى أربع صور في الثانية مع إضاءة مللي ثانية لكل صورة.

احصل على صور مضان في الوضع المباشر. لضبط التركيز والسطوع. استخدم ماصة صغيرة لإضافة هرمون البروجسترون المركب للاختبار بعناية في هذه الحالة ومواصلة الحصول على الصور حسب الحاجة.

قم بإجراء إضافتين متتابعتين للتحكم في نفس الغرفة. 20 ميكرومولار أيون مايسين للحصول على أقصى مضان وخمسة مللي مولر كلوريد المنغنيز للحصول على الحد الأدنى من التألق. قم بإجراء تحليل الصور في وضع عدم الاتصال باستخدام برنامج IQ.

ارسم مناطق الاهتمام أو عائد الاستثمار حول كل خلية أو جزء من خلية. بالإضافة إلى ذلك ، حدد منطقة خالية من الخلايا لطرح الخلفية تلقائيا بواسطة البرنامج. ثم يتم الحصول على سلسلة شدة التألق الزمني لكل عائد استثمار ويمكن تصدير هذه البيانات إلى Microsoft Excel لمزيد من التحليل.

البروجسترون هو أحد محفزات تفاعل الجسيمات الأكرومية المعروفة ، وكما هو متوقع ، يزداد تركيز الكالسيوم العابر داخل الخلايا في المنوية البشرية كما تم قياسه بواسطة القياس الفلوري التقليدي. يظهر تتبع التألق الأحمر مقابل الوقت تغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ناتجة عن إضافة أربعة هرمون هرمون من البروجسترون الميكرومولار كتحكم سلبي تمت إضافة HSM ، مما لم يتسبب في أي تغيير في مستويات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا كما هو موضح في أثر التألق الأزرق كعنصر تحكم إيجابي. يظهر التغيير الناجم عن 10 ميكرومولار أيون مايسين لكل أثر.

تؤدي إضافة أيونوفور الكالسيوم هذا إلى زيادة تركيز الكالسيوم الخلوي RA القصوى ، والتي لا تعود إلى المستويات القاعدية. أظهر هذا الرسم البياني الشريطي متوسط التغير في دلتا فلورة F من كل حالة ، زائد أو ناقص الخطأ المعياري حيث N يساوي ثلاثة وتشير العلامة النجمية إلى قيمة P أقل من 0.001 مقارنة بعنصر التحكم. تم قياس زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجمة عن هرمون البروجسترون بدقة زمنية أكبر عن طريق القياس الفلوري للتدفق المتوقف، والنتائج التمثيلية موضحة هنا.

تظهر الآثار الخام في اللوحة A ، حيث تسبب كل من هرمون البروجسترون الذي يمثله الخط الأحمر والمايسين الأيوني الذي يمثله الخط الأزرق في زيادة سريعة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. التتبع الأخضر هو التحكم السلبي حيث تم خلط الخلايا مع HSM. تظهر اللوحة B آثارا مصححة للإشارات المستحثة بالبروجسترون أو مع المايسين الأيوني الذي تم الحصول عليه عن طريق طرح إشارة التحكم من الإشارات الأولية المقابلة لها.

تسبب هرمون البروجسترون في زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة وعابرة مع حدوث قيمة مضان قصوى بعد 2.7 ثانية من إضافة المحرض. من ناحية أخرى ، تسبب CIN في زيادة سريعة ومستدامة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا خلال 50 ثانية. تعرض الأجزاء الداخلية في اللوحة B عرضا موسعا لأول 500 مللي ثانية لكل استجابة.

يتوافق عدم وجود تأخير في زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجم عن هرمون البروجسترون مع التقارير السابقة التي تشير إلى أن هرمون البروجسترون ينشط مباشرة نتوء قناة الكالسيوم دون إشارات وسيطة. تم قياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا أيضا في المنوية البشرية السعوية وغير السعوية باستخدام قياس التدفق الخلوي. في هذه المخططات المبعثرة الأمامية والجانبية.

الخلايا السعوية باللون الأزرق والخلايا غير السعوية باللون الأحمر. يشار إلى البوابة المحددة بالخط الأزرق وتم استخدام الخلايا الموجودة داخل تلك المنطقة فقط لمزيد من التحليل. تظهر اللوحة B الرسم البياني الفلوري في قناة Fitzy من المنوية غير الملوثة ، وتظهر اللوحة D الرسم البياني الفلوري في قناة FZ من الأنفلونزا أوه 3:00 صباحا المنوية الملطخة كما لوحظ في اللوحة D. يتم تحويل توزيع قيم التألق للحيوانات المنوية السعوية التي يمثلها الأثر الأزرق إلى قيم أعلى مقارنة بالحيوانات المنوية غير السعوية التي يمثلها الأثر الأحمر.

تظهر اللوحة C الرسم البياني الفلوري في قناة PI من الخلايا غير الملوثة وتظهر اللوحة E الرسم البياني الفلوري في قناة PI من الخلايا الميتة. يمكن ملاحظة قيم التألق لكل خلية فردية في مخططات النقاط الفلورية ثنائية الأبعاد الموضحة هنا. بالنسبة للخلايا غير الملوثة والخلايا الملطخة بالأنفلونزا أوه 3:00 صباحا و pi ، يشار إلى النسبة المئوية للخلايا المسجلة في كل ربع بالرقم الأحمر.

الأهم من ذلك ، يمكن التخلص من الإشارة الناشئة عن الخلايا الميتة. أخيرا ، تم قياس تغير تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجم عن هرمون البروجسترون في خلايا المنوية المفردة عن طريق تصوير هذه الصور الزائفة التمثيلية التي تظهر الخلايا التي تم تصورها في البداية وبعد إضافات هرمون البروجسترون و CIN وكلوريد المنغنيز. تؤدي إضافة البروجسترون إلى زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، سواء في رأس المنوية أو كلوريد المنغنيز اللومي لتقليل الأنفلونزا.

أوه 3:00 صباحا ، التألق عن طريق إخماد آثار التألق الطبيعي التمثيلي لتسع خلايا فردية من التجربة موضحة في هذا الشكل. كما لوحظ في التجارب السكانية ، كشف تحليل الخلية المفردة عن زيادة عابرة ومستمرة للهروجسترون والأيونات مايسين على التوالي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من صلاحية الخلايا وإجراء الضوابط المناسبة باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد القنوات الأيونية المحددة المشاركة في زيادة الكالسيوم باستخدام حلول proppe وبروتوكولات المحاكاة بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فسيولوجيا الخلية لاستكشاف ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا الحية ذات الدقة المكانية والزمانية العالية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار الأسلوب الأنسب لقياس زيادات الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام dyDyFluorescent في أي نوع من الخلايا ، اعتمادا على السؤال المحدد الذي ترغب في الإجابة عليه. لا تنس أن العمل مع عينات سيمن البشرية يمكن أن يكون خطيرا واحتياطات مثل استخدام المتبرعين ذوي الصحة المثبتة. يجب دائما استخدام كرات اللاتكس أثناء الإجراء والتخلص المناسب من المحلول والمواد أثناء تنفيذ هذا الإجراء.