تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد
June 30th, 2013
تم وصفها تقنيات لتشريح الآليات الكامنة وراء من إفراز من فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف في exosomes. تم استغلال الببتيدات قصيرة محددة المستمدة من NEF وترنسفكأيشن البروتين لتحديد هيكل، وظيفة، والشركاء ملزم من نيف للسفر إفراز تعديل المنطقة. هذه الإجراءات ديك صلة عامة بالموضوع في العديد من الدراسات الآلتي.
يقدم هذا الفيديو مجموعة من أربع تجارب تستخدم لتحديد أشكال بروتين NPH الوظيفية لفيروس نقص المناعة البشرية ولتطوير مثبطات قائمة على الببتيد. الببتيدات القصيرة المحددة المشتقة من الزخارف الموجودة في البروتينات كاملة الطول ، تحتفظ بوظيفتها البيولوجية وتمنع بشكل تنافسي وظيفة البروتين كامل الطول لتحديد الزخارف موت الخلايا المبرمج. في فيروس نقص المناعة البشرية ، تتعرض خلايا قطط أحطر NEF لببتيدات مسح NEF ويتم إجراء اختبار موت الخلايا المبرمج النفقي لتحديد الببتيدات التي تحفز موت الخلايا المبرمج.
مجموعة ثانية من الببتيدات تحتوي على اختلافات في شكل إفراز NEF. يتم نقل منطقة تعديل الإفراز أو SMR إلى الخلايا جنبا إلى جنب مع فقدان NPH GFP للوظيفة بسبب التثبيط التنافسي المشار إليه من خلال انخفاض إفراز nph. يتم تقييم GFP عن طريق القياس الفلوري لتحديد العوامل الخلوية التي تتفاعل مع منطقة تعديل الإفراز أو SMR من nef.
يتم تنفيذ هطول الأمطار باستخدام SMR البري من النوع NPH كطعم. أخيرا ، لاختبار ما إذا كانت هذه التفاعلات تؤثر على الإفراز ، يتم نقل الأجسام المضادة ضد شركاء الارتباط المحددين إلى الخلايا. لتقييم ما إذا كانت تتعارض مع إفراز شكل NF ، تحدد النتائج التي تم الحصول عليها اثنين من أشكال موت الخلايا المبرمج الوظيفية في NEF وببتيد مثبط يعادي شكل إفراز NEF الوظيفي بالإضافة إلى شركائها في الارتباط الخلوي المطلوبين للإفراز.
الهدف العام لهذه المجموعة المكونة من أربع تجارب هو تسريع تحديد الزخارف الوظيفية في البروتينات المستهدفة ثم استخدام تلك البيانات لتطوير مثبطات قاعدة الببتيد لهذه الزخارف الوظيفية. كانت هذه المجموعة من البروتوكولات مفيدة لمجموعتنا في مساعدتنا على الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتسبب في فيروس نقص المناعة البشرية ، مثل فهم دور الإفراز المدفوع بالنيج في التسبب في التسبب في فك رموز الآليات الكامنة وراء قدرة نيف على التلاعب بمسار الاتجار الجسدي الخارجي. اليوم سيوضح الإجراءات الدكتور مينغ بو هوانغ ، وهو مدرس أبحاث في مختبري.
ابدأ هذا الإجراء بمجموعة من الببتيدات التي تمسح المنطقة محل الاهتمام لهذه التجربة. تم الحصول على 20 ببتيدا مير مع 10 تداخل من الأحماض الأمينية التي تمتد عبر فيروس نقص المناعة البشرية بأكمله ، وتم الحصول على بروتين NPH واحد من برنامج كاشف الإيدز. لتحديد زخارف موت الخلايا المبرمج NPH ، قم بإجراء فحص موت الخلايا المبرمج باستخدام ببتيدات مسح NEF بشكل فردي على النحو التالي ، أضف ملليلترا واحدا من وسط الثقافة الذي يحتوي على 10 نانوغرام لكل مليلتر من الببتيد لكل صفيحة 35 ملم من قبعة النطر ، ومزارع الخلايا ، واحتضان المزارع لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، قم بإجراء نقل نوكليوتيدات ديوكسي طرفية بوساطة DUTP ، وشق البيوتين ووضع العلامات أو فحص النفق لتقييم موت الخلايا المبرمج. للقيام بذلك ، قم أولا بغسل الخلايا باستخدام PBS ثم استنشق PBS وإضافة 4٪ ألدهيد Paraform في PBS ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا بعد تثبيت الخلايا ، وغسلها باستخدام PBS وإضافة Triton X 100 ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتجعيدها. بعد تثبيت الخلايا ونفاذيتها ، أضف كاشف النفق واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بعد النفاذ.
اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS. ثم حدد النسبة المئوية للخلايا الملطخة عن طريق التألق epi على نظام الفحص المجهري الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر. بعد نقل خلايا jca مع NPH و GFP البلازميد والاختلافات المختلفة لببتيد SMR باستخدام مجموعة كاشف توصيل بروتين العربة كما هو موضح في المستند المصاحب ، قم بحصاد الوسيط لتحديد كفاءة التعدي بواسطة الفحص المجهري الفلوري.
التقط صورا فلورية وساحلية وحددت النسبة المئوية للخلايا. ثم تم تحويله لتقييم تثبيط إفراز NPH GFP ، ونقل 100 ميكرولتر من الوسط المكيف الخالي من الخلايا إلى الآبار الفردية لصفيحة ميكروتيتر سوداء 96 بئر. استخدم مقياس فلوري بطول موجة إثارة 485 نانومتر وطول موجة انبعاث 515 نانومتر لقياس مضان GFP في الوسط بوحدات التألق النسبية.
بعد اكتمال القراءة ، انقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر. اضبط مستوى مضان GFP في وسط التحكم عند 100٪ ثم قارن هذا بمستوى مضان GFP في الوسط من الخلايا التي تم نقلها مع ببتيدات SMR المختلفة لتحديد التغيرات في إفراز NPH GFP. يعد عنوان الملكية الفكرية المشترك لعزل شركاء ربط الحافز خطوة صعبة.
تأكد من تحريك الخرزات بشكل صحيح أثناء الحضانات وإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من الخرزات أثناء كل خطوة غسيل. قم بزراعة خلايا قبعة النطر في وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية في خلايا بيليه قارورة ثقافة الأنسجة T 75 عن طريق الطرد المركزي عند 1000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من PBS ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
تدور عند 1000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة. ثم أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من التحلل المضاد للعلم. المخزن المؤقت عن طريق سحب العينة اللطيف لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة تفاضلية.
يتم تعليق التعليق عند 2000 مرة G لمدة خمس دقائق و 13 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق. لتكسير حطام الخلية والحمض النووي ، على التوالي ، اجمع المادة الطافية المشار إليها فيما يلي باسم المحللة. بعد تحديد تركيز البروتين ، أضف ملليغراما واحدا من بروتين المحللة وميكروغرام واحد من النوع البري SMR أو الببتيد المتحور SMR إلى 20 ميكرولترا من جل التقارب المضاد للعلم M.
يشار إلى هلام التقارب هذا فيما بعد باسم الراتنج الذي يجلب الخليط إلى الحجم النهائي البالغ ملليلتر واحد في المخزن المؤقت المشترك IP. قم أيضا بإعداد عنصر تحكم سلبي يتم فيه دمج المحللة مع الراتنج في حالة عدم وجود أي من الببتيد. احتضان الخلطات عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع دوران نهاية على نهاية.
في اليوم التالي ، قم بتقطيع الراتنج عن طريق الطرد المركزي الصغير عند 5 ، 000 إلى 8 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية. بعد الدوران ، انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل التعامل مع العينات للسماح للراتنج بالاستقرار في الأنبوب. قم بإزالة المادة الطافية بطرف ماصة ضيق الطرف أو حقنة هاميلتون مع الحرص على عدم نقل أي راتنج.
اغسل الراتنج أربع مرات عن طريق إعادة التركيب ، وقم بتعليقه في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل ، متبوعا بالطرد المركزي الدقيق. لتخليص البروتينات الخلوية المقلدة. أضف 15 ميكروغراما من ببتيد العلم الزائد ثلاثة × إلى الأنبوب في 50 ميكرولتر من عازلة الغسيل واحتضنه على شاكر الروك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد جهاز الطرد المركزي للحضانة عند 5 ، 000 إلى 8 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية.
بعد السماح للأنابيب بالاستقرار لمدة دقيقتين ، اجمع واحفظ المادة الطافية التي تحتوي على البروتينات المراوغة. بعد تركيز EITs عن طريق ترسيب الأسيتون ، قم بغلي العينات في مخزن مؤقت لعينة laly. ثم افصل البروتينات عن طريق صفحة SDS على 40 إلى 20٪ تريس ، معيار HCL هلام مسبقة الصب يلطخ الجل مع kumasi الأزرق اللامع R اثنين 50.
لتقييم تثبيط الأجسام المضادة لخلية JCA التحويلية باستخدام NGFP وإما أنتيفا توبولين أو الأجسام المضادة للوفيات باستخدام مجموعة كاشف توصيل بروتين العربة كما هو موضح في الوثيقة المصاحبة ، اجمع الوسط المكيف الخالي من الخلايا من الخلايا المحصودة. انقل 100 ميكرولتر إلى آبار فردية من صفيحة ميكروتيتر سوداء 96 جيدا. ثم قم بقياس مضان GFP في الوسط باستخدام مقياس فلوري بطول موجة إثارة 485 نانومتر وطول موجة انبعاث 515 نانومتر في وحدات الفلورسنت النسبية.
بعد قراءة اللوحة ، انقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر واضبط مستوى مضان GFP في التحكم في التوبولين المضاد للدهون عند 100٪ قارن هذا بمستوى مضان GFP في الوسط من الخلايا التي تم نقلها بجسم مضاد مضاد للوفيات لتحديد التغييرات في إفراز NEF GFP لرسم خريطة الزخارف موت الخلايا المبرمج لفيروس نقص المناعة البشرية تم إجراء تحليل مسح الببتيد لبروتينات NPH كما هو موضح في هذا الفيديو. يظهر المحور Y النسبة المئوية للخلايا التي تم تسميتها بالنفق ويشير المحور x إلى حالة العلاج كما هو موضح هنا ، تم تحديد منطقتين منفصلتين من فيروس نقص المناعة البشرية ، تم تحديد NEF واحد يحفزان موت الخلايا المبرمج. يشار إلى ذلك من خلال زيادة وضع العلامات النفقية للخلايا المعرضة لببتيدات الكلية.
يشار إلى قمم موت الخلايا المبرمج بالحافز الأول والحافز الثاني لتقييم التثبيط التنافسي لإفراز النيف بواسطة وسط ثقافة الببتيدات من النوع البري SMR من خلايا CAT التائية النطرة المقاطعة مع استنساخ NPH GFP وكانت ببتيدات SMR المختلفة محصوسا لإفراز NPH الخارجي كما هو موضح في مضان GFP في الببتيدات المتوسطة التي تحتوي على واحد أو أكثر من أشكال تسلسل NPH SMR من النوع البري تمنع إفراز NEF exo omal بينما قلل استبدال ألانين من أي حمض أميني داخل هذه المنطقة بشكل كبير من فعالية الببتيدات. يشير هذا إلى أن الببتيد من النوع البري SM R يثبط exo omal nph ، وهو نسخة مخلوطة من 11 من الأحماض الأمينية من فكرة موت الخلايا المبرمج في neff. تم استخدام SM واحد تم وصفه سابقا وتم الحصول عليه من Sigma Genesis كعنصر تحكم سلبي ولم يكن له أي تأثير على إفراز NEP exo omal.
تظهر هذه الصورة لجل صفحة SDS الملون باللون كوماسي الترسيب المناعي المشترك لأربعة بروتينات بواسطة الببتيد من النوع البري SMR بأحجام 60 و 65 و 75 و 250 كيلودالتون. لم يلتقط الببتيد المتحور SMR للتحكم السلبي هذه البروتينات ، ولم تتفاعل هذه البروتينات بشكل غير محدد مع راتنج التقارب. في حالة عدم وجود الببتيد من النوع البري SMR ، تشير هذه النتائج إلى أن البروتينات المترسبة كانت تتفاعل على وجه التحديد مع أشكال SMR للببتيد من النوع البري SMR.
يظهر اختبار قارئ اللوحة أن تعداء المهد للجسم المضاد للموت مع بلازميد تعبير neph ألغى تماما إفراز NPH exo omal. لم يكن للجسم المضاد غير ذي الصلة أي تأثير على إفراز exo omal ne. تشير هذه النتائج إلى أن تفاعل مواهب NM السليم مطلوب لإفراز النيفون الخارجي أومال.
في الختام ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قد طورت فهما جيدا لكيفية استخدام تقنيات الوصف لتحديد الزخارف الوظيفية في البروتينات المستهدفة واستخدام تلك البيانات لتطوير مثبطات قاعدة الببتيد لهذه الزخارف الوظيفية. أثناء محاولة إجراء الملكية الفكرية المشتركة ، سيكون من الأهمية بمكان أن تتذكر إيلاء اهتمام دقيق في تنفيذ غسلات الحضانة ، والتأكد من تحريك الخرزات بشكل صحيح أثناء الحضانات وإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من الخرزات أثناء كل خطوة غسيل. أيضا أثناء غسل راتنج الخلية والمحللة ، تسمح دائما للراتنج بالاستقرار بعد الطرد المركزي.
استخدم أطراف الماصة ذات الأطراف الضيقة وقم بأربع غسلات لتقليل الخلفية بشكل كاف إلى مستويات مقبولة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة تقنيات للتحقيق في آليات إفراز HIV-1 Nef في الإكسوسومات. تسلط الضوء على استخدام ببتيدات معينة ونقل البروتين لدراسة هيكل ووظيفة منطقة تعديل إفراز Nef.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الفيروسات
- علم الأحياء الخلوية
الخلفية
- HIV-1 Nef هو بروتين حيوي متورط في التسبب في المرض الفيروسي.
- فهم آليات إفرازه يمكن أن يوفر رؤى حول بيولوجيا HIV.
- تلعب الإكسوسومات دورًا مهمًا في التواصل بين الخلايا.
- المثبطات القائمة على الببتيدات يمكن أن تساعد في دراسة وظائف البروتينات.
هدف الدراسة
- تفكيك آليات إفراز HIV-1 Nef.
- تحديد شركاء الارتباط لمنطقة تعديل الإفراز.
- تطوير مثبطات قائمة على الببتيدات تستهدف Nef.
الطرق المستخدمة
- نقل الخلايا بالببتيدات المشتقة من Nef.
- تقييم الفلورومتري لإفراز Nef-GFP.
- اختبارات الاستماتة لتحديد الأنماط الوظيفية.
- دراسات التثبيط التنافسي باستخدام الببتيدات القصيرة.
النتائج الرئيسية
- تحديد الببتيدات التي تحفز الاستماتة في HIV-1 Nef.
- تبيين انخفاض إفراز Nef-GFP بسبب التثبيط التنافسي.
- توصيف العوامل الخلوية المتفاعلة مع منطقة تعديل إفراز Nef.
- رؤى حول الوظائف البيولوجية للببتيدات المشتقة.
الخلاصات
- توفر الدراسة تقنيات قيّمة للتحقيق في HIV-1 Nef.
- النهج القائمة على الببتيدات يمكن أن تكشف عن أنماط وظيفية مهمة.
- فهم إفراز Nef قد يرشح استراتيجيات علاجية ضد HIV.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This peptide-based approach enables rapid identification of functional motifs in pathogenic proteins, supporting target validation and mechanistic de-risking in antiviral discovery. By using short overlapping peptides to pinpoint apoptosis-inducing and secretion-modifying regions, the method accelerates hypothesis testing and inhibitor design. The competitive inhibition format provides a direct path to peptide-based therapeutics that disrupt protein-protein interactions critical to viral function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies functional motifs responsible for apoptosis induction and protein secretion in HIV-1 Nef.
- Operational Value: Uses overlapping 20-mer peptides with 10-amino acid shifts to systematically scan functional domains.
- Therapeutic Value: Reveals motifs that can be competitively inhibited to block pathogenic activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Enables fluorometric quantification of secreted Nef-GFP as a measurable output for inhibition studies.
- Reproducibility: Standardizes co-immunoprecipitation with SMRwt peptide as bait to isolate specific binding partners.
- Scalability: Supports high-throughput screening of peptide variants for inhibitory potency against exosome secretion.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links Nef secretion via exosomes to HIV pathogenesis, a mechanism of intercellular viral signaling.
- Translational Continuity: Uses peptide inhibitors to validate target engagement and mechanism of action in cellular models.
- Predictive De-risking: Demonstrates that disrupting Nef-mortalin interaction abolishes exosomal secretion, supporting target essentiality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where motif mapping informs inhibitor design and target validation precedes preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking specific peptides to apoptotic and secretory functions through gain- and loss-of-function assays.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts from secreted GFP to measure inhibition of Nef exosome secretion.
- Analytics: Enables comparison of peptide variants via fluorescence intensity to rank inhibitory potency and specificity.
- Translational Research: Connects motif inhibition to reduced exosomal Nef release, a pathway implicated in viral immune evasion.
- Enterprise Reuse: The peptide scanning and co-IP workflow can be adapted to other pathogenic proteins with known functional domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into Nef-driven apoptosis and exosome secretion, reducing ambiguity in target function.
- Operational Value: Standardizes peptide-based binding assays and secretion readouts for cross-project consistency.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions by validating whether peptide inhibition phenocopies full-length protein blockade.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of motifs with dual functionality in apoptosis and secretion for broader therapeutic impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide handling, transfection, and fluorescence-based secretion assays.
- Dependent on fluorometry platforms capable of detecting GFP in conditioned medium at 485/515 nm.
- Necessitates standardized co-IP protocols with controlled bead washing to minimize background in binding partner identification.
- Must account for peptide solubility and stability when testing inhibitory concentrations across variants.
- Limited to proteins where functional motifs can be inferred from known domains or prior structural data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:55
Nef Scanning Peptide TUNEL Assay
4:43
Competitive Inhibition Analysis Using Peptides
9:25
Nef-GFP Secretion Fluorescent Plate Reader Assay of Antibody Inhibition
13:23
Conclusion
6:02
Isolating Motif Binding Partners Using Peptides as Bait
10:33
Identification of Nef Functional Motifs and their Binding Partners
