تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد

يعرض هذا الفيديو مجموعة من أربع تجارب تُستخدم لتحديد أنماط بروتينية وظيفية لبروتين HIV-1 Nef ولتطوير مثبطات قائمة على الببتيدات. إن الببتيدات القصيرة المحددة والمشتقة من الأنماط الموجودة في البروتينات كاملة الطول، تحتفظ بوظيفتها البيولوجية وتثبط تنافسياً وظيفة البروتين كامل الطول لتحديد أنماط الموت الخلوي المبرمج. في بروتين HIV-1 Nef، تُعرَّض خلايا Jurkat لببتيدات مسح Nef ويُجرى فحص TUNEL للموت الخلوي المبرمج لتحديد الببتيدات التي تحفز الموت الخلوي المبرمج.

مجموعة ثانية من الببتيدات تحتوي على تنويعات في نمط إفراز NEF. يتم ترانسفكشن منطقة تعديل الإفراز أو SMR في الخلايا جنباً إلى جنب مع NPH GFP، حيث يؤدي التثبيط التنافسي إلى فقدان الوظيفة والذي يظهر من خلال انخفاض إفراز nph. ويتم تقييم GFP بواسطة قياس الفلورية لتحديد العوامل الخلوية التي تتفاعل مع منطقة تعديل الإفراز أو SMR الخاصة بـ nef.

يتم إجراء ترسيبات Co-IP باستخدام NPH من النوع البري لـ SMR كطُعم. وأخيراً، لاختبار ما إذا كانت هذه التفاعلات تؤثر على الإفراز، يتم ترصيف أجسام مضادة ضد شركاء الارتباط الذين تم تحديدهم في الخلايا. ولتقييم ما إذا كانت هذه الأجسام المضادة تعارض إفراز مـوتيف NF، تحدد النتائج التي تم الحصول عليها مـوتيفين موتين وظيفيين في NEF وببتيد مثبط يعارض مـوتيف إفراز NEF وظيفي بالإضافة إلى شركاء ارتباطه الخلويين المطلوبين للإفراز.

الهدف العام من هذه المجموعة المكونة من أربع تجارب هو تسريع عملية تحديد الزخارف الوظيفية في البروتينات المستهدفة، ومن ثم استخدام هذه البيانات لتطوير مثبطات ببتيدية لهذه الزخارف الوظيفية. لقد كانت هذه المجموعة من البروتوكولات مفيدة لمجموعتنا في مساعدتنا على الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بإمراضية HIV، مثل فهم دور الإفراز الذي يحفزه neff في الإمراضية، وفك رموز الآليات الكامنة وراء قدرة neff على التلاعب بمسار نقل الإكسوسومات. ستقوم الدكتورة Ming Bo Huang، وهي محاضرة بحثية في مختبري، بشرح هذه الإجراءات اليوم.

ابدأ هذا الإجراء باستخدام مجموعة من الببتيدات التي تمسح المنطقة ذات الصلة بهذه التجربة. تم الحصول على ببتيدات بطول 20 حمضاً أمينياً مع تداخل قدره 10 أحماض أمينية تغطي بروتين HIV one NPH بالكامل من برنامج كواشف الإيدز. ولتحديد أنماط NPH المحفزة للموت الخلوي المبرمج، قم بإجراء مقايسة الموت الخلوي المبرمج باستخدام ببتيدات مسح NEF بشكل فردي على النحو التالي: أضف 1 mL من وسط الزرع الذي يحتوي على 10 ng/mL من الببتيد لكل طبق قطر 35 mm من مزارع خلايا jerk hat، ثم قم بتحضين المزارع لمدة 24 ساعة عند 37 °C.

بعد عملية الحضن، قم بإجراء اختبار TUNEL أو اختبار وسم النيك والبيوتين لـ DUTP بوساطة إنزيم deoxy nucleotide transferase النهائي لتقييم الموت الخلوي المبرمج. وللقيام بذلك، اغسل الخلايا أولاً بمحلول PBS، ثم اشفط محلول PBS وأضف Paraform aldehyde بتركيز 4% في محلول PBS، واحضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا. بعد تثبيت الخلايا، اغسلها بمحلول PBS وأضف Triton X 100، ثم احضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لنفاذيتها. بعد تثبيت الخلايا وجعلها نفاذة، أضف كاشف TUNEL واحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بعد عملية النفاذ.

اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS. ثم حدد نسبة الخلايا المصبوغة عن طريق الفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) باستخدام نظام مجهري يتم التحكم فيه بواسطة الحاسوب. بعد ترانزفيكشن خلايا jca باستخدام NPH، وبلازميد GFP، وتنوعات مختلفة من ببتيد SMR باستخدام مجموعة كاشف توصيل البروتين chariot كما هو موضح في المستند المرفق، قم بجمع الوسط لتحديد كفاءة الترانزفيكشن عن طريق المجهر الفلوري.

التقط صوراً فلورية وصوراً بالمجال المضيء وحدد النسبة المئوية للخلايا. ولتقييم تثبيط إفراز NPH GFP بعد عملية عفن الخلايا، انقل 100 µL من الوسط المشروط الخالي من الخلايا إلى آبار منفصلة في لوحة معايرة دقيقة سوداء ذات 96 بئراً. استخدم مقياس الفلورية بطول موجي للإثارة 485 nanometers وطول موجي للانبعاث 515 nanometers لقياس فلورية GFP في الوسط بوحدات الفلورية النسبية.

بعد اكتمال القراءة، انقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر. اضبط مستوى فلورية GFP في الوسط الضابط عند 100%، ثم قارن ذلك بمستوى فلورية GFP في الوسط المستخلص من الخلايا التي تم نقلها مشتركاً مع ببتيدات SMR المختلفة لتحديد التغييرات في إفراز NPH GFP. وتعد عملية الترسيب المناعي المشترك (co IP) لعزل شركاء ارتباط الزخرفة خطوة صعبة.

تأكد من تقليب الخرزات بشكل جيد أثناء فترات الحضن، ومن إزالة أكبر قدر ممكن من السائل من الخرزات خلال كل خطوة غسيل. يتم إنماء خلايا jerk hat في وسط RPMI 1640 يحتوي على 10% FBS عند 37 degrees Celsius في دورق زراعة أنسجة T 75، ثم يتم تجميع الخلايا في شكل كريات عن طريق الطرد المركزي عند 1000 times G لمدة 20 دقيقة عند four degrees Celsius. أعد تعليق كريات الخلايا في 1 milliliter من PBS وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter.

قم بالتدوير بجهاز الطرد المركزي بسرعة 1000 ×g لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول Anti-Flag lysis Buffer عن طريق السحب اللطيف باستخدام الماصة في جهاز طرد مركزي دقيق.

يتم طرد المعلقات مركزياً عند 2000 ×g لمدة خمس دقائق، ثم عند 13,000 ×g لمدة 10 دقائق، وذلك لترسيب حطام الخلايا والـ DNA على التوالي؛ ثم تُجمع المادة الطافية التي سيشار إليها فيما يلي باسم المستخلص الخلوي. بعد تحديد تركيز البروتين، يُضاف 1 mg من بروتين المستخلص الخلوي و 1 µg من ببتيد SMR من النوع البري أو ببتيد SMR الطافر إلى 20 µL من هلام الألفة Anti-Flag M2.

يُشار إلى هلام الألفة هذا فيما يلي باسم الراتنج؛ أحضر الخليط إلى حجم نهائي قدره 1 mL في منظم co IP. قم أيضاً بتحضير ضابط سلبي يتم فيه دمج المستخلص مع الراتنج في غياب أي من الببتيدين. قم بحضن الخلائط عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل مع تدويرها بشكل شاقولي.

في اليوم التالي، قم بترسيب الراتنج عن طريق الطرد المركزي الدقيق بسرعة تتراوح من 5,000 إلى 8,000 ×g لمدة 30 ثانية. بعد عملية الطرد، انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل التعامل مع العينات للسماح للراتنج بالاستقرار في الأنبوب. تخلص من السائل الطافي باستخدام رأس ماصة ضيق الطرف أو سرنجة هاميلتون، مع مراعاة عدم نقل أي جزء من الراتنج.

اغسل الراتنج أربع مرات عن طريق إعادة التعليق، حيث يتم تعليقه في 500 microliters من محلول غسيل منظم، يليه طرد مركزي دقيق. ولشطف البروتينات الخلوية المرتبطة، أضف 15 micrograms من فائض ببتيد three x flag إلى الأنبوب في 50 microliters من محلول غسيل منظم، ثم حضّن المزيج على هزاز مائل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ وبعد انتهاء فترة التحضين، قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة تتراوح من 5,000 إلى 8,000 ×g لمدة 30 ثانية.

بعد ترك الأنابيب لتستقر لمدة دقيقتين، يتم جمع وحفظ السائل الطافي الذي يحتوي على البروتينات المستخلصة. وبعد تركيز الـ EITs عن طريق الترسيب بالأسيتون، تُغلى العينات في محلول لالي المنظم (laemmli sample buffer). ثم تُفصل البروتينات بواسطة SDS page على هلام صبّ مسبق التجهيز (precast gel) من نوع triss, HCL بتركيز يتراوح من 40 إلى 20%، ويُصبغ الهلام بصبغة kumasi brilliant blue R two 50.

لتقييم تثبيط الأجسام المضادة، يتم إجراء ترانزفكشن مشترك لخلايا JCA باستخدام NGFP وإما Antifa tubulin أو الجسم المضاد anti mortality باستخدام طقم كاشف توصيل البروتين chariot كما هو موضح في المستند المرفق، ثم تُجمع الأوساط الشرطية الخالية من الخلايا من الخلايا المحصودة. يتم نقل 100 µL إلى آبار فردية في لوحة معايرة دقيقة سوداء ذات 96 بئراً. بعد ذلك، يتم قياس فلورة GFP في الوسط باستخدام مقياس الفلورة بطول موجي للإثارة 485 nm وطول موجي للانبعاث 515 nm بوحدات الفلورة النسبية.

بعد قراءة الطبق، انقل البيانات إلى جهاز الكمبيوتر واضبط مستوى فلورة GFP في ضابط anti-fat tubulin عند 100%. قارن ذلك بمستوى فلورة GFP في الوسط من الخلايا التي لم يتم ترانسفكشنها بـ anti mortality antibody لتحديد التغيرات في إفراز NEF GFP. لرسم خرائط لزخارف الموت الخلوي لبروتينات HIV one NPH، تم إجراء تحليل مسح الببتيدات كما هو موضح في هذا الفيديو. يوضح المحور Y نسبة الخلايا المحددة بـ tunnel، بينما يشير المحور x إلى حالة المعالجة كما هو موضح هنا، حيث تم تحديد منطقتين منفصلتين من HIV one NEF تحفزان الموت الخلوي. ويشار إلى ذلك من خلال زيادة تحديد tunnel للخلايا المعرضة لببتيدات neph.

يُشار إلى ذروات الموت الخلوي المبرمج بالنمط الأول (motif one) والنمط الثاني (motif two) لتقييم التثبيط التنافسي لإفراز NPH بواسطة ببتيدات SMR من النوع البري؛ حيث تم تحليل وسط استزراع خلايا Jurkat T التي تم ترانسفكشنها (transfected) بـ NPH GFP clone وببتيدات SMR متنوعة لتقييم إفراز NPH خارج الخلية، كما هو موضح من خلال فلورية GFP في الوسط. وقد أدت الببتيدات التي تحتوي على نمط واحد أو أكثر من تسلسلات NPH SMR من النوع البري إلى تثبيط إفراز NEF خارج الخلية، بينما أدى استبدال أي حمض أميني بـ alanine ضمن هذه المنطقة إلى تقليل فعالية الببتيدات بشكل كبير. يشير هذا إلى أن ببتيد SMR من النوع البري يثبط NPH خارج الخلية، وهو نسخة مبعثرة مكونة من 11 حمضاً أمينياً من النمط الموت الخلوي المبرمج لـ neff. وقد استُخدم SMR1 الموصوف سابقاً والمستخلص من Sigma Genesis كضابط سلبي، ولم يكن له أي تأثير على إفراز NEP خارج الخلية.

تظهر هذه الصورة لهلام SDS-PAGE المصبوغ بصبغة Coomassie الترسيب المناعي المشترك لأربعة بروتينات بواسطة ببتيد SMR من النوع البري بأحجام 60 و65 و75 و250 kilodalton. لم يقم ببتيد SMR الطافر، المستخدم كضابط سلبي، بالتقاط هذه البروتينات، كما لم تتفاعل هذه البروتينات بشكل غير محدد مع راتنج الألفة. وفي غياب ببتيد SMR من النوع البري، تشير هذه النتائج إلى أن البروتينات التي تمت ترسيبها مناعياً كانت تتفاعل بشكل محدد مع زخارف SMR الموجودة في ببتيد SMR من النوع البري.

يُظهر مقايسة قارئ الأطباق أن التعداء المشترك للأجسام المضادة anti mortal مع بلازميد تعبير neph قد أدى إلى إلغاء إفراز exo omal NPH بشكل كامل. ولم يكن للجسم المضاد غير المرتبط أي تأثير على إفراز exo omal ne. وتشير هذه النتائج إلى أن التفاعل السليم بين NM talent ضروري لإفراز exo omal neph.

في الختام، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قد اكتسبت فهماً جيداً لكيفية استخدام التقنيات الموصوفة لتحديد الزخارف الوظيفية (functional motifs) في البروتينات المستهدفة، وكيفية استخدام تلك البيانات لتطوير مثبطات ببتيدية لهذه الزخارف الوظيفية. عند محاولة إجراء عملية الترسيب المناعي المشترك (co IP)، سيكون من الضروري تذكر إيلاء اهتمام دقيق لتنفيذ عمليات غسل الحضن، مع التأكد من تحريك الخرزات بشكل مناسب أثناء فترات الحضن، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من الخرزات خلال كل خطوة غسيل. كما يجب دائماً ترك الراتنج ليستقر بعد عملية الطرد المركزي أثناء عمليات غسل الخلايا وراتنج المستخلص البروتيني.

استخدم رؤوس الماصات ذات الطرف الضيق وقم بإجراء أربع عمليات غسيل لتقليل الخلفية بشكل كافٍ إلى مستويات مقبولة.