Biopanning المعالجة البيولوجية القائمة على الاستشعار الحيوي واستراتيجية تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق العالمي من التفاعلات البروتين المخدرات

تحديد تفاعلات البروتين الجزيئي الصغير أمرا ضروريا للبحث والتطوير للأدوية بالإضافة إلى تعزيز فهمنا للآليات المرضية الكامنة وراء DTCs للفيروس. تسهل هذه الطريقة الترجمة الحيوية عالية الإنتاجية للأدوية التي تتعرف على الببتيدات والتحقق العالمي من مواقع ربط الأدوية على البروتينات للأدوية الجزيئية الصغيرة ذات الأهمية. لتحضير شريحة مستشعر QCM ، قم بتوصيل شريحة مستشعر خزفية بمذبذب جهاز QCM بتردد 27 ميجاهرتز وسجل التردد الجوهري في طور الهواء قبل تثبيت الجزيئات الصغيرة.

بعد التسجيل ، افصل الشريحة وأضف بعناية قطرة 20 ميكرولتر من محلول مشتق جزيء صغير واحد مليمولار في 70٪ من الإيثانول لإنشاء طبقة أحادية مجمعة ذاتيا على القطب الذهبي لشريحة المستشعر. ضع الشريحة في طبق بتري مبطن بأنسجة مبللة ، وحمايتها من الضوء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل سطح القطب برفق بالماء النقي للغاية. جفف الشريحة بتطبيق لطيف للهواء وقم بتحميل الشريحة على جهاز QCM.

بعد ساعة واحدة ، سجل انخفاض التردد في طور الهواء لقياس كمية الجزيء الصغير الذي تم تجميده. بالنسبة إلى T7 Phage Library Biopanning ، ضع كوفيت مع محرك مغناطيسي مخصص على المستشعر الحيوي QCM المضبوطة على 1000 دورة في الدقيقة وأضف ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى الكوفيت أثناء تقليب المخزن المؤقت قم بتوصيل شريحة مستشعر QCM بالمذبذب اضغط مع الاستمرار على ذراع المذبذب لغمر الشريحة في المخزن المؤقت وابدأ في مراقبة تردد QCM. عندما يوازن جرام المستشعر إلى حوالي ثلاثة هرتز في الدقيقة من انجراف التردد ، قم بحقن ثمانية ميكرولترات من مكتبة العاثيات T7 في الكوفيت وقم بتمييز نقطة الحقن على المستشعر.

راقب تقليل التردد الناجم عن ارتباط العاثيات T7 بالجزيء الصغير الثابت على سطح القطب الذهبي. بعد 10 دقائق ، أوقف جهاز مراقبة تردد QCM وارفع المذبذب بسرعة لإزالة شريحة المستشعر من الدفعة ، وافصل شريحة المستشعر عن المذبذب وقم بإزالة المخزن المؤقت من الشريحة. ضع شريحة المستشعر المجففة في طبق بتري رطب وأضف قطرة 20 ميكرولترا من الخلايا المضيفة للإشريكية القولونية في مرحلة السجل على القطب الذهبي.

احتضن الطبق على خلاط 96 بئر عند 37 درجة مئوية و 1000 إلى 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة ، محمي من الضوء لتعزيز استعادة العاثيات السبعة T7 المقلدة. في نهاية الحضانة ، انقل 20 ميكرولترا من تعليق الإشريكية القولونية إلى 200 ميكرولتر من وسط LB. وفقا للإجراء العام ، قم بإجراء عزل لوحة العاثية في الوسط وتسلسل الحمض النووي الذي يشفر الدواء ، والتعرف على تسلسل الببتيد المعروض على كل قفيصة العاثية.

كصيانة بعد رقاقة المستشعر ، استخدم قطعة قطن مبللة بمحلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 1٪ لتنظيف سطح القطب ، وغسل سطح الذهب بالماء النقي للغاية ، وتجفيف القطب بالهواء. ثم عالج سطح القطب بخمسة ميكرولترات من محلول بارانا الطازج لمدة خمس دقائق متبوعا بغسل بالماء فائق النقاء وتجفيف الهواء مرتين. لإجراء تحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام RELIC ، قم بفك ضغط برنامج RELIC المستقل على جهاز كمبيوتر مزود بنظام تشغيل windows واستخدم تسلسل الأحماض الأمينية للدواء المحدد 15 ببتيدا ميريا أو بروتينات مفردة أو متعددة في كل ملف نصي بتنسيق A سريع.

ضع الملفات النصية المطلوبة في مجلد AA-div أو المعلومات أو الحافز أو المطابقة أو المحاذاة غير المتجانسة أو الاحتيال السريع أو المسح السريع A. انقر فوق كل ملف قابل للتنفيذ في المجلد المستقل لفتح الإصدار الشخصي من FTN 95 وأدخل اسم الملف المناسب وامتداده في سطر الأوامر لتنفيذ كل برنامج والحصول على ملف تنسيق النص الناتج. يتم عرض ملفات تنسيق النص الناتجة التي تم الحصول عليها هنا.

ثم قم بتصدير الملف النصي الناتج إلى جدول بيانات لإنشاء مخطط لمحتوى المعلومات أو درجات التشابه التراكمي المحسوبة باستخدام ضربة حوالي 62. باستخدام هذه الإستراتيجية ، تم تحديد مواقع ربط الجزيئات الصغيرة المفردة والمتعددة على البروتينات المستهدفة بنجاح لستة أدوية جزيئية صغيرة. على سبيل المثال ، تم تحديد 29 ببتيدا تتعرف على عقار Irinotecan المعتمد سريريا كطبقة أحادية التجميع ذاتيا بواسطة مستشعر QCM الحيوي القائم على دورة واحدة ، وأسفرت المحاذاة الزوجية اللاحقة ل 29 ببتيدا و acetylcholinesterase عن درجات قصوى لمخلفات الأحماض الأمينية المحددة التي كانت متوافقة مع تلك التي تشكل موقع ربط Irinotecan.

تم تحديد هذه المجموعة الفرعية نفسها من الببتيدات بنجاح بالقرب من الثالوث التحفيزي في الكربوكسيل إستيراز ، مما يشير إلى أن هذه الأحماض الأمينية تشكل سقالة للتعرف على الإيرينوتيكان أثناء إزالة الأسترة. نجحت الببتيدات ال 27 التي تتعرف على عقار أوسيلتاميفير المضاد للإنفلونزا الذي يغطي سطح القطب الكهربائي الذهبي لشريحة مستشعر QCM في اكتشاف موقع ربط أوسيلتاميفير في النورامينيداز. يتكون موقع الربط هذا من حلقات ببتيد غير منظمة من المحتمل أن تخضع لحركة ديناميكية أثناء الالتحام مع أوسيلتاميفير.

الأدوية والمناطق والمواد الكيميائية والعاثيات المؤتلفة والبكتيريا هي سماعات بيولوجية ويجب التعامل معها وفقا لبروتوكول اكتساب الثقافة. تذكر دائما ارتداء القفازات والنظارات الواقية ومعطف المختبر من أجل السلامة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن التحقق من صحة البروتينات المستهدفة للأدوية المختلفة عالميا في البشر والفيروسات المرضية وحتى النباتات لفهم الآليات الجزيئية والفعالية العلاجية المحتملة للأدوية ذات الأهمية.