Biopanning المعالجة البيولوجية القائمة على الاستشعار الحيوي واستراتيجية تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق العالمي من التفاعلات البروتين المخدرات
ديسمبر 1, 2020
هدفت هذه الدراسة إلى تقديم استراتيجية لتحديد التفاعلات الببتيد المخدرات. وتنطوي الاستراتيجية على التحريك الأحيائي للببتيدات القصيرة التي تعترف بالمخدرات استنادا إلى جهاز استشعار دقيق للكوارتز والكريستال ، يليها تحليل المعلوماتية الحيوية لإجراء تقييم كمي للمعلومات التي تم الحصول عليها للتعرف على المخدرات وشرح مواقع ربط المخدرات بالبروتينات.
تحديد تفاعلات البروتين الجزيئي الصغير أمرا ضروريا للبحث والتطوير للأدوية بالإضافة إلى تعزيز فهمنا للآليات المرضية الكامنة وراء DTCs للفيروس. تسهل هذه الطريقة الترجمة الحيوية عالية الإنتاجية للأدوية التي تتعرف على الببتيدات والتحقق العالمي من مواقع ربط الأدوية على البروتينات للأدوية الجزيئية الصغيرة ذات الأهمية. لتحضير شريحة مستشعر QCM ، قم بتوصيل شريحة مستشعر خزفية بمذبذب جهاز QCM بتردد 27 ميجاهرتز وسجل التردد الجوهري في طور الهواء قبل تثبيت الجزيئات الصغيرة.
بعد التسجيل ، افصل الشريحة وأضف بعناية قطرة 20 ميكرولتر من محلول مشتق جزيء صغير واحد مليمولار في 70٪ من الإيثانول لإنشاء طبقة أحادية مجمعة ذاتيا على القطب الذهبي لشريحة المستشعر. ضع الشريحة في طبق بتري مبطن بأنسجة مبللة ، وحمايتها من الضوء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل سطح القطب برفق بالماء النقي للغاية. جفف الشريحة بتطبيق لطيف للهواء وقم بتحميل الشريحة على جهاز QCM.
بعد ساعة واحدة ، سجل انخفاض التردد في طور الهواء لقياس كمية الجزيء الصغير الذي تم تجميده. بالنسبة إلى T7 Phage Library Biopanning ، ضع كوفيت مع محرك مغناطيسي مخصص على المستشعر الحيوي QCM المضبوطة على 1000 دورة في الدقيقة وأضف ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى الكوفيت أثناء تقليب المخزن المؤقت قم بتوصيل شريحة مستشعر QCM بالمذبذب اضغط مع الاستمرار على ذراع المذبذب لغمر الشريحة في المخزن المؤقت وابدأ في مراقبة تردد QCM. عندما يوازن جرام المستشعر إلى حوالي ثلاثة هرتز في الدقيقة من انجراف التردد ، قم بحقن ثمانية ميكرولترات من مكتبة العاثيات T7 في الكوفيت وقم بتمييز نقطة الحقن على المستشعر.
راقب تقليل التردد الناجم عن ارتباط العاثيات T7 بالجزيء الصغير الثابت على سطح القطب الذهبي. بعد 10 دقائق ، أوقف جهاز مراقبة تردد QCM وارفع المذبذب بسرعة لإزالة شريحة المستشعر من الدفعة ، وافصل شريحة المستشعر عن المذبذب وقم بإزالة المخزن المؤقت من الشريحة. ضع شريحة المستشعر المجففة في طبق بتري رطب وأضف قطرة 20 ميكرولترا من الخلايا المضيفة للإشريكية القولونية في مرحلة السجل على القطب الذهبي.
احتضن الطبق على خلاط 96 بئر عند 37 درجة مئوية و 1000 إلى 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة ، محمي من الضوء لتعزيز استعادة العاثيات السبعة T7 المقلدة. في نهاية الحضانة ، انقل 20 ميكرولترا من تعليق الإشريكية القولونية إلى 200 ميكرولتر من وسط LB. وفقا للإجراء العام ، قم بإجراء عزل لوحة العاثية في الوسط وتسلسل الحمض النووي الذي يشفر الدواء ، والتعرف على تسلسل الببتيد المعروض على كل قفيصة العاثية.
كصيانة بعد رقاقة المستشعر ، استخدم قطعة قطن مبللة بمحلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 1٪ لتنظيف سطح القطب ، وغسل سطح الذهب بالماء النقي للغاية ، وتجفيف القطب بالهواء. ثم عالج سطح القطب بخمسة ميكرولترات من محلول بارانا الطازج لمدة خمس دقائق متبوعا بغسل بالماء فائق النقاء وتجفيف الهواء مرتين. لإجراء تحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام RELIC ، قم بفك ضغط برنامج RELIC المستقل على جهاز كمبيوتر مزود بنظام تشغيل windows واستخدم تسلسل الأحماض الأمينية للدواء المحدد 15 ببتيدا ميريا أو بروتينات مفردة أو متعددة في كل ملف نصي بتنسيق A سريع.
ضع الملفات النصية المطلوبة في مجلد AA-div أو المعلومات أو الحافز أو المطابقة أو المحاذاة غير المتجانسة أو الاحتيال السريع أو المسح السريع A. انقر فوق كل ملف قابل للتنفيذ في المجلد المستقل لفتح الإصدار الشخصي من FTN 95 وأدخل اسم الملف المناسب وامتداده في سطر الأوامر لتنفيذ كل برنامج والحصول على ملف تنسيق النص الناتج. يتم عرض ملفات تنسيق النص الناتجة التي تم الحصول عليها هنا.
ثم قم بتصدير الملف النصي الناتج إلى جدول بيانات لإنشاء مخطط لمحتوى المعلومات أو درجات التشابه التراكمي المحسوبة باستخدام ضربة حوالي 62. باستخدام هذه الإستراتيجية ، تم تحديد مواقع ربط الجزيئات الصغيرة المفردة والمتعددة على البروتينات المستهدفة بنجاح لستة أدوية جزيئية صغيرة. على سبيل المثال ، تم تحديد 29 ببتيدا تتعرف على عقار Irinotecan المعتمد سريريا كطبقة أحادية التجميع ذاتيا بواسطة مستشعر QCM الحيوي القائم على دورة واحدة ، وأسفرت المحاذاة الزوجية اللاحقة ل 29 ببتيدا و acetylcholinesterase عن درجات قصوى لمخلفات الأحماض الأمينية المحددة التي كانت متوافقة مع تلك التي تشكل موقع ربط Irinotecan.
تم تحديد هذه المجموعة الفرعية نفسها من الببتيدات بنجاح بالقرب من الثالوث التحفيزي في الكربوكسيل إستيراز ، مما يشير إلى أن هذه الأحماض الأمينية تشكل سقالة للتعرف على الإيرينوتيكان أثناء إزالة الأسترة. نجحت الببتيدات ال 27 التي تتعرف على عقار أوسيلتاميفير المضاد للإنفلونزا الذي يغطي سطح القطب الكهربائي الذهبي لشريحة مستشعر QCM في اكتشاف موقع ربط أوسيلتاميفير في النورامينيداز. يتكون موقع الربط هذا من حلقات ببتيد غير منظمة من المحتمل أن تخضع لحركة ديناميكية أثناء الالتحام مع أوسيلتاميفير.
الأدوية والمناطق والمواد الكيميائية والعاثيات المؤتلفة والبكتيريا هي سماعات بيولوجية ويجب التعامل معها وفقا لبروتوكول اكتساب الثقافة. تذكر دائما ارتداء القفازات والنظارات الواقية ومعطف المختبر من أجل السلامة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن التحقق من صحة البروتينات المستهدفة للأدوية المختلفة عالميا في البشر والفيروسات المرضية وحتى النباتات لفهم الآليات الجزيئية والفعالية العلاجية المحتملة للأدوية ذات الأهمية.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة استراتيجية لتحديد تفاعلات دواء-الببتيد باستخدام مستشعر حيوي متوازن لبلورة الكوارتز (QCM). تتضمن الطريقة فحص الببتيدات التي تتعرف على الدواء وتحليل المعلومات الحيوية لتقييم التعرف على الدواء ومواقع الارتباط على البروتينات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تطوير الدواء
- التكنولوجيا الحيوية
الخلفية
- فهم تفاعلات الجزيئات الصغيرة والبروتين أمر بالغ الأهمية لأبحاث الأدوية.
- هناك حاجة لأساليب عالية الإنتاجية لفحص الببتيدات الحيوية.
- توفر مستشعرات QCM منصة لدراسة ارتباط الدواء.
- يساعد تحديد مواقع الارتباط في تطوير العلاجات.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لتحديد الببتيدات المرتبطة بالدواء.
- للتحقق من صحة مواقع ارتباط الدواء على البروتينات المستهدفة.
- لتعزيز فهم تفاعلات الدواء على المستوى الجزيئي.
الطرق المستخدمة
- إعداد رقائق مستشعر QCM لتثبيت الجزيئات الصغيرة.
- فحص حيوي باستخدام مكتبات العاثيات T7 لتحديد الببتيدات المرتبطة.
- رصد تغيرات التردد في QCM لتقييم تفاعلات الارتباط.
- تحليل المعلومات الحيوية لتقييم تسلسل الببتيدات.
النتائج الرئيسية
- التعرف بنجاح على الببتيدات التي تتعرف على أدوية مثل إيرينوتيكان وأوسيلتاميفير.
- توصيف مواقع الارتباط على البروتينات مثل أستيل كولينستراز ونورامينيداز.
- ثبت فعالية الطريقة في التحقق من تفاعلات الدواء.
الاستنتاجات
- تحدد الاستراتيجية بفعالية مواقع الارتباط الدوائي على البروتينات.
- يمكن تطبيقها على مختلف الأدوية للحصول على رؤى علاجية.
- تعزز فهم الآليات الجزيئية في عمل الدواء.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
