التجميعي تقسيم وبركة وتوصيف الببتيد المكتبة أميد العالي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تخليق مكتبات تركيبية تحتوي على وحدات أميد ثالثي الببتيد أو PTA. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير مونومر فرعي من PTA أولاً من أحماض أمينية طبيعية، ثم تتلى هذه الخطوة بتخليق منطقة رابط ببتيدي على دعامة صلبة.

بعد ذلك، يتم تخليق مكتبة توافقية تحتوي على وحدات فرعية من PTA والببتيد. وتتمثل الخطوة النهائية في توصيف المكتبة المُخلّقة لضمان جودة عملية التخليق. وفي النهاية، يتم تخليق مكتبة توافقية تحتوي على وحدات فرعية من PTA مقيدة تشكلياً، ويمكن استخدام هذه المكتبة في الفحص عالي الإنتاجية لتوفير ربيطات بروتينية والتوصل إلى اكتشاف أدوية جديدة.

لقد تم تطوير الكيمياء التي يتناولها هذا المقال في محاولة لإيجاد جزيئات تكون أكثر صلابة بكثير من بعض الببتيدات والأشياء الأخرى التي عملنا عليها سابقاً. تكمن الفكرة في أنه إذا تم تحديد مكتبات من الجزيئات الأكثر صلابة، فإنها سترتبط بالأهداف البروتينية بتقارب أعلى بكثير، وقد اعتقدنا أن هذا أمر بالغ الأهمية في محاولة تطوير الأدوية مستقبلاً، أو حتى في تطوير جزيئات مسبارية مثيرة للاهتمام. يعد العرض المرئي لتخليق PTA suborder أمراً بالغ الأهمية حقاً، لأن تعلم عملية التخليق صعب نظراً لأن التحكم في درجة الحرارة والتوقيت يعتبران حاسمين لنجاح عملية التخليق.

أولاً، أضف 8.9 grams من dine و11.9 grams من بروميد البوتاسيوم إلى دورق مستدير القاع ثلاثي العنق سعة 500 milliliter مع قضيب تحريك مغناطيسي. ثم أضف 100 milliliters من محلول بروميد الهيدروجين بتركيز 30% تم تحضيره مسبقاً إلى الدورق. بعد وضع الدورق في حمام من إيثيلين جلايكول وجليد جاف عند درجة حرارة negative 10 °C، قم بتمرير غاز الأرجون عبر إبرة طويلة من قاع الدورق لمدة 10 minutes.

قُم بتقليب المحلول باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي بسرعة 300 RPM. بعد ذلك، أضف محلول نتريت الصوديوم المُحضّر مسبقاً إلى قمع تنقيط معادِل للضغط متصل بقارورة مستديرة القاع ذات ثلاث فتحات، ثم أغلقه بسدادة مطاطية (septum). افتح صمام قمع التنقيط ببطء، للسماح لمحلول نتريت الصوديوم بالتقطير داخل القارورة.

تحكم في الصمام لضبط معدل التنقيط إلى قطرتين تقريباً في الثانية. بعد اكتمال إضافة نتريت الصوديوم، استمر في تقليب المحلول لمدة ثلاث ساعات إضافية، مع السماح لدرجة الحرارة بالارتفاع من -10 °C إلى درجة حرارة الغرفة. إذا كان لون المحلول داكناً جداً، فقم بتطبيق تفريغ هوائي لإزالة أكاسيد النيتروجين الزائدة والبروم المحتمل تولده أثناء التفاعل.

بمجرد نقل المحلول إلى قمع فصل، استخلص المنتج ثلاث مرات باستخدام 35 milliliters من dathyl ether. وبعد تجميع الطور العضوي وغسله بمحلول ملحي مشبع، اجمعه في دورق وجففه فوق كبريتات الصوديوم لمدة ست ساعات. وعقب ترشيح كبريتات الصوديوم، بخر المذيب تحت التفريغ للحصول على زيت يتراوح لونه من الشفاف إلى الأصفر الشاحب.

قم بتنقية المنتج الخام باستخدام كروماتوغرافيا العمود بهلام السيليكا مع الهكسان وأسيتات الإيثيل بنسبة ثلاثة إلى واحد. ولغرض الوسم النظيري، أذب 300 mg من L alanine في 10 mL من الماء المديتر (deuterated water) داخل أنبوب بولي إيثيلين سعة 50 mL. وبعد إضافة 10 mg من alpha ketoglutarate كركيزة مساعدة، قم بتدفئة الأنبوب حتى 37 °C. وعند الانتهاء، اضبط الـ pH ليكون بين 8.5 و 8.7 باستخدام محلول sodium dute oxide بتركيز 1 M وشرائط اختبار الـ pH.

بعد ذلك، أضف 0.1 milligrams من alanine transaminase إلى المحلول. ضع الأنبوب في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C واتركه يحضن طوال الليل مع رج خفيف بسرعة تتراوح من 10 إلى 30 RPM. في هذه المرحلة، قم بنقع جرام واحد من حبيبات الجل بحجم 90 micron و 10 مع Ram linker في 10 milliliters من dimethylformamide لمدة ثلاث ساعات في مفاعل حقنة سعة 12 milliliter مع رج خفيف، ثم قم بتصريف dimethylformamide من المفاعل وأضف 10 milliliters من محلول 20%pi Perine dimethylformamide لإزالة حماية مجموعة FOC من rink amid linker.

بعد رجّ الخرز مع محلول Pepperdine بتركيز 20% لمدة 30 دقيقة، اغسل الخرز خمس مرات باستخدام dimethyl forma meat لإزالة كل الـ Pepperdine. بعد ذلك، أخرج بضع خرزات من المحقنة واختبرها باستخدام اختبار chloral. أضف 2 mL من محلول bromo acetic acid في dimethylformamide بتركيز 2 M إلى الخرز ورجّ المزيج برفق.

ثم أضف 2 mL من محلول diop propyl carbo diamine في dimethylformamide بتركيز 2 M إلى الخرزات. بعد إغلاق المحقنة بالمكبس، رج الخرزات على جهاز الرج لمدة 10 دقائق. وبمجرد غسل الخرزات جيداً باستخدام dimethylformamide، أضف إليها 2 mL من محلول methoxy ethyl dimethylformamide بتركيز 1 M تم تحضيره مسبقاً.

بعد رج الخرز وغسله خمس مرات باستخدام dimethylformamide، يتم فحص عدد قليل من الخرزات بواسطة اختبار chloral. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من محلول di chloral methane dimethylformamide بنسبة واحد إلى واحد إلى المحقنة المستخدمة سابقاً. قم بتوزيع كافة الخرزات التي تزن one gram بالتساوي على ثلاثة مفاعلات محقنة سعة five milliliters باستخدام ماصة 1000 microliter ذات طرف مقطوع.

بعد غسل المحاقن الثلاث ثلاث مرات باستخدام الكلوروميثان، اغسل المحاقن التي تحمل العلامتين r و s ثلاث مرات باستخدام رباعي هيدرو فوران اللامائي، والمحقنة التي تحمل العلامة B ثلاث مرات باستخدام ثنائي ميثيل فورماميد. من أجل اقتران tristine بـ bromo propan NOIC acid، أضف حوالي 200 milligrams من tristine إلى قارورة داخل خزانة استخلاص الغازات. وبمجرد إغلاق القارورة بالغطاء، قم بوزن كمية tristine الموجودة في القارورة.

بعد ذلك، أضف الكمية المناسبة من tetra hydro ferran اللامائي إلى القارورة لتحضير محلول Tri phosgene tetra hydro ferran بتركيز 20 mg/mL. ولتحضير خليط bromo acids tri phosgene، أضف 89 µL من R two Bromo propan NOIC acid و S two Bromo propan NOIC acid D four في قارورتين صغيرتين بشكل منفصل، ثم أضف إلى كل قارورة 5 mL من محلول tristine tetra hydro furan. بعد إغلاق القارورات بإحكام، ضعها في مجمد عند درجة حرارة -20 °C لمدة 20 دقيقة.

في هذه الأثناء، أضف 1,125 µL من محلول tetra hydro furan di isopropyl amine بنسبة 2:1 إلى المحقنتين r و s. وبشكل منفصل، أضف 356 µL من 2,4,6 trimethyl purine إلى كل قارورة تحتوي على خلائط bromo acids phosgene المبردة، مما يؤدي إلى تكون رواسب بيضاء. قم بتطبيق المعلق المقابل مباشرة على الخرزات الـ ified، ثم ضعها على جهاز هزاز للرج بسرعة 120 RPM لمدة ساعتين.

لربط حمض البرومو أسيتيك مع ثنائي أيزوبروبيل كاربودياميد، أضف 5 mL من محلول حمض البرومو أسيتيك بتركيز 2 M في ثنائي ميثيل فورماميد إلى السرنجة B. بعد الرج، أضف 5 mL من محلول ثنائي بروبيل كاربودياميد بتركيز 2 M في ثنائي ميثيل فورماميد إلى السرنجة نفسها ورجها برفق، ثم ضع السرنجة B على نفس جهاز الرج مع السرنجتين r و s. بعد ذلك، رج السرنجات لمدة ساعتين بعد غسلها جيداً باستخدام ثنائي كلورو ميثان وثنائي ميثيل فورماميد. اجمع كافة الخرزات من السرنجات R و s و B في مفاعل سرنجة واحد سعة 12 mL.

بمجرد غسل الخرزات خمس مرات باستخدام dimethylformamide، أضف 10 milliliters من محلول di chloro methane dimethylformamide بنسبة واحد إلى واحد إلى المحقنة. قسّم جميع الخرزات بالتساوي على سبع محاقن فردية سعة 2 milliliter باستخدام ماصة 1000 microliter ذات طرف مقطوع للتوزيع، ثم أضف 5 milliliters من سبعة محلول amine بتركيز 2 molar محضرة مسبقاً إلى المحقنة المقابلة. قم بتحضين المحاقن السبع جميعها في حاضنة عند درجة حرارة 60 degree Celsius مع الرج طوال الليل بعد عملية التحضين.

اغسل الخرزات المراد فصلها خمس مرات باستخدام ثنائي كلورو ميثان. وبعد رج الخرزات لمدة 15 دقيقة وغسلها مرة أخرى بثنائي كلورو ميثان، قم بتصريف ثنائي كلورو ميثان من المحقنة. ثم انقل كل خرزة على حدة إلى لوح معايرة ذي 96 بئرًا.

باستخدام مجهر ضوئي وماصة ذات طرف مقطوع، قم بتغطية صفيحة الـ 96 بئراً بغطاء شريحة مجهرية وضعها في مجمد بدرجة حرارة 20- °C لمدة 15 دقيقة. وبمجرد إخراج الصفيحة من المجمد، أضف 20 µL من محلول TFA DI chloro methane المبرد والمجهز مسبقاً بنسبة واحد إلى واحد إلى كل بئر يحتوي على خرزة. أعد وضع غطاء الشريحة المجهرية وضع صفيحة الـ 96 بئراً على جهاز هزاز داخل المجمد مرة أخرى عند درجة حرارة 20- °C.

بعد الرج لمدة 20 دقيقة، أخرج لوحة الـ 96 ذات الجدران من المجمد وانزع الغطاء الواقي. جفف الـ di chloro methane من كل بئر عن طريق نفخ الهواء فوقه. عند إجراء عملية القطع في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول 50%TFA DI CHLORO methane، يلاحظ حدوث تدهور ملحوظ.

تتوافق القمم 593 و484 مع الرابط وثلاثي PTA على التوالي، مما يشير إلى أن الجزيء بأكمله قد تم تخليقه بنجاح على الخرزة ولكنه تحلل أثناء عملية الفصل. وعند الفصل تحت ظروف درجة حرارة منخفضة كما هو موضح أعلاه، يتم تثبيط كمية التحلل الناتج عن TFA بشكل كبير. وقد تم وصف آلية الفصل في الدراسات السابقة، ويُعتقد أنها تمر عبر وسيط olaine. يمكن تسلسل جزيئات PTA عن طريق Ms.MS، ونمط التجزئة مشابه للببتيدات والببتيدات.

تعطي جزيئات PTA المصنعة باستخدام S two bromo propole acid D four بشكل عام قممًا أكثر عرضًا في MS و msm. تعود أطياف MS إلى وجود نواتج تفاعل غير مكتملة مثل S two bromo propan و NOIC acid D three، ويمكن استخدام ذلك كمؤشر على وجود المركز الكيرالي R أثناء عملية التسلسل. كما تميل جزيئات PTA إلى تكوين نواتج إضافة مرتبطة بالصوديوم بشكل أكبر من الببتيدات. لذا، يفضل استخدام مياه منخفضة الصوديوم وأدوات بلاستيكية.

ومن النواتج الثانوية المحتملة الأخرى مادة الأكريلاميد التي تتكون نتيجة حذف البروم أثناء عملية الأمينة. وبمجرد تكون الأكريلاميد، تتوقف السلسلة. ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق خفض تركيز الأمين الأولي إلى 1 molar لتقليل المحلول.

بمجرد إتقان الأساسيات، يمكن تحضير مكتبة ذات حجم جيد في غضون يومين إذا تم تنفيذ العملية بشكل صحيح. والآن، بعد أن تم تطوير هذه الكيمياء بالكامل وأصبح التخليق فعالاً للغاية، آمل أن يتبنى الباحثون الآخرون هذه التقنية القوية لصنع محاكيات ببتيدية مقيدة تشكلياً من أجل تطوير الأدوية وتطوير المجسات.