التجميعي تقسيم وبركة وتوصيف الببتيد المكتبة أميد العالي
يونيو 20, 2014
الببتيد الأميدات العالي (اتفاقيات التجارة التفضيلية) هي الفصيلة من peptidomimetics التي تشمل ولكن لا تقتصر على الببتيدات، peptoids والببتيدات ميثليته N-. نحن هنا تصف طريقة الاصطناعية الذي يجمع بين كل تقسيم وحمام سباحة واستراتيجيات مونومر فرعية لتجميع، حبة واحدة مكتبة المجمع واحدة من اتفاقيات التجارة التفضيلية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تصنيع المكتبات الاندماجية التي تحتوي على وحدات الببتيد الثلاثية أو PTA. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير مونومر فرعي PTA أولا من الأحماض الأمينية الطبيعية. الخطوة الثانية هي تجميع منطقة رابط الببتيد على دعامة صلبة.
بعد ذلك ، يتم تصنيع مكتبة اندماجية تحتوي على وحدات فرعية PTA والببتيد. الخطوة الأخيرة هي توصيف المكتبة المركبة لضمان جودة التوليف. في النهاية ، يتم تصنيع مكتبة اندماجية تحتوي على وحدات فرعية مقيدة من PTA ويمكن استخدام هذه المكتبة للفحص عالي الإنتاجية لتوفير روابط البروتين ويؤدي إلى اكتشاف دواء جديد.
لذلك تم تطوير الكيمياء التي هي موضوع هذه المقالة في محاولة لمحاولة العثور على جزيئات أكثر صلابة من بعض الببتيدات والأشياء الأخرى التي عملنا معها سابقا. الفكرة هي أنه إذا حدد المرء مكتبات من الجزيئات الأكثر صلابة وسوف ترتبط بأهداف البروتين ذات الصلات الأعلى بكثير ، واعتقدنا أن هذا مهم جدا جدا في محاولة تطوير الأدوية التي تمضي قدما أو حتى جزيئات مسبار مثيرة للاهتمام. يعد العرض المرئي لتوليف PTA الفرعي أمرا بالغ الأهمية حقا حيث يصعب تعلم التوليف لأن التحكم في درجة الحرارة والتوقيت أمران حاسمان حقا لنجاح التوليف.
أولا ، أضف 8.9 جراما من العشاء و 11.9 جراما من بروميد البوتاسيوم إلى قارورة قاع مستديرة سعة 500 ملليلتر بثلاثة رقبة مع قضيب تحريك مغناطيسي. ثم أضف 100 مل من محلول بروميد الهيدروجين 30٪ المعد مسبقا إلى القارورة. بعد وضع القارورة في سالب 10 درجات مئوية من الإيثيلين جلايكول ، قم بفقاعة حمام الثلج الجاف من خلال إبرة طويلة من أسفل القارورة لمدة 10 دقائق.
قلب المحلول باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي عند 300 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف محلول نتريت الصوديوم المعد مسبقا إلى قمع إسقاط معادلة الضغط المتصل بالرقبة الثلاثة ، قارورة القاع المستديرة وأغلقها بحاجز. افتح صمام قمع السقوط ببطء ، مما يسمح لمحلول نتريت الصوديوم بالتنقيط في القارورة.
تحكم في الصمام لضبط معدل التنقيط إلى قطرتين تقريبا في الثانية. بعد اكتمال إضافة نتريت الصوديوم ، استمر في تقليب المحلول لمدة ثلاث ساعات أخرى ، مما يسمح لدرجة الحرارة بالارتفاع من سالب 10 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. إذا كان لون المحلول داكنا جدا ، فاستخدم فراغا لإزالة أكاسيد النيتروجين الزائدة والبروم المحتمل المتولد أثناء التفاعل.
بمجرد نقل المحلول إلى قمع الاستخراج ، استخرج المنتج ثلاث مرات باستخدام 35 مل من داثيل الأثير. بعد الجمع بين المرحلة العضوية وغسلها بمحلول ملحي مشبع ، اجمعها في قارورة وجففها فوق كبريتات الصوديوم لمدة ست ساعات. بعد ترشيح كبريتات الصوديوم ، قم بتبخير المذيب تحت الفراغ للحصول على زيت صاف إلى أصفر باهت.
قم بتنقية المنتج الخام عن طريق كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا بثلاثة إلى واحد من أسيتات إيثيل الهيكسان لوضع العلامات النظيرية قم بإذابة 300 ملليغرام من L ألانين مع 10 ملليلتر من الماء الممزول في أنبوب بولي إيثيلين سعة 50 ملليلترا. بعد إضافة 10 ملليغرام من ألفا كيتوجلوتارات كركيزة cos ، قم بتسخين الأنبوب إلى 37 درجة مئوية. عند الانتهاء ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.5 إلى 8.7 باستخدام محلول أكسيد الصوديوم المولي الواحد وشرائط اختبار الأس الهيدروجيني.
بعد ذلك ، أضف 0.1 ملليغرام من ترانساميناز ألانين إلى المحلول. ضع الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية واحتضانه طوال الليل مع اهتزاز خفيف عند 10 إلى 30 دورة في الدقيقة. عند هذه النقطة ، قم بتفجير جرام واحد من 90 ميكرون ، 10 إلى حبات هلام مع رابط رام في 10 ملليلتر من ثنائي ميثيل فورماميد لمدة ثلاث ساعات في مفاعل حقنة 12 مليلتر مع اهتزاز خفيف ، واستنزاف ثنائي ميثيل فورماميد من المفاعل وإضافة 10 ملليلتر من محلول ثنائي ميثيل فورماميد بيرين 20٪ لحماية مجموعة FOC من حلبة التزلج وسط الرابط.
بعد رج الخرزات بمحلول 20٪ Pepperdine لمدة 30 دقيقة ، اغسلها خمس مرات بلحم ثنائي ميثيل فورما لإزالة كل الفلفل. بعد ذلك ، قم بإزالة بعض الخرزات من المحقنة واختبرها باختبار الكلورال. أضف ملليلترين من محلول ثنائي ميثيل فورماميد حمض البرومو ثنائي ميثيل فورماميد إلى الخرزات ورجه برفق.
ثم أضف ملليلترين من محلول ثنائي ميثيل فورماميد ثنائي ميثيل فورماميد ثنائي الملاريين ديوب ثنائي الملار. بعد إغلاق المحقنة بمكبس ، رج الخرز على شاكر لمدة 10 دقائق. بمجرد غسل الخرزات جيدا باستخدام ثنائي ميثيل فورماميد ، أضف ملليلترين من محلول ميثوكسي إيثيل ثنائي ميثيل فورماميد مولار معد مسبقا إليها.
بعد هز الخرزات وغسلها خمس مرات بثنائي ميثيل فورماميد ، تحقق من عدد قليل من الخرزات باختبار الكلورال. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من محلول ثنائي ميثيل فورماميد ثنائي الكلور ثنائي الكلور إلى المحقنة المستخدمة سابقا. قم بتقسيم جميع حبات الجرام الواحد بالتساوي إلى ثلاثة مفاعلات حقنة سعة خمسة ملليلتر باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع طرف ماصة مبتور.
بعد غسل المحاقن الثلاث ثلاث مرات باستخدام كلورو الميثان ، اغسل المحاقن المصنفة r و s ثلاث مرات باستخدام tet hydro furin اللامائي ، والحقنة ذات العلامات B ثلاث مرات بثنائي ميثيل فورماميد. لاقتران تريستين من برومو بروبان حمض NOIC, إضافة ما يقرب من 200 ملليغرام من تريستين إلى قارورة في غطاء الدخان. بمجرد تغطية القارورة ، قم بوزن كمية التريستين في القارورة.
ثم أضف الكمية المناسبة من tetra hydro ferran اللامائي إلى القارورة لعمل 20 ملليغرام لكل مليلتر محلول ثلاثي فوسجين تترا هيدرو فيران. لتحضير خليط أحماض البرومو ثلاثي الفوسجين ، أضف 89 ميكرولترا من R اثنين من حمض بروما بروبان NOIC و S اثنين من برومو بروبان حمض NOIC D أربعة في قارورتين صغيرتين بشكل منفصل لكل قارورة ، أضف خمسة ملليلتر من محلول تريستين تترا هيدروفوران. بعد إغلاق القوارير ، ضعيها في فريزر سالب 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
في غضون ذلك ، أضف 1 ، 125 ميكرولتر من محلول أمين رباعي إلى واحد رباعي هيدروفوران دي إيزوبروبيل إلى المحقنة r و s. بشكل منفصل ، أضف 356 ميكرولتر من 2 4 6 ثلاثي ميثيل بيورين إلى كل من القوارير التي تحتوي على مخاليط الفوسجين الأحماض المبردة التي تنتج رواسب بيضاء. قم بتطبيق التعليق المقابل على الفور مباشرة على الخرز المزخرف ، ثم ضعه على شاكر للاهتزاز تحت 120 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.
لاقتران حمض الخليك برومو مع ثنائي الأيزوبروبيل كربو ديامين, أضف خمسة ملليلتر من اثنين من محلول حمض الخليك برومو اثنين من المولار إلى حقنة B.بعد الرج, أضف خمسة ملليلتر من اثنين من محلول ثنائي ميثيل فورماميد دي بروبيل كربو ثنائي المولار إلى نفس المحقنة ورجها برفق بعد هذا المكان حقنة B على نفس شاكر مثل حقنة r و s. ثم رج المحاقن لمدة ساعتين بعد غسل المحاقن جيدا ب di chloro methane و dimethylformamide. قم بتجميع جميع الخرزات من المحاقن R و s و B في مفاعل حقنة واحد سعة 12 مل.
بمجرد غسل الخرزات خمس مرات باستخدام ثنائي ميثيل فورماميد ، أضف 10 ملليلتر من محلول ثنائي ميثيل فورماميد ثنائي كلورو ميثان واحدا لواحد إلى المحقنة. قسم جميع الخرزات بالتساوي إلى سبع محاقن فردية سعة ملليلتر باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع طرف ماصة مبتورة للانبعاث، وأضف خمسة ملليلترات من سبعة محلولي أمين موليين مجهزين مسبقا إلى المحقنة المقابلة. احتضان جميع المحاقن السبع في حاضنة 60 درجة مئوية مع الرج طوال الليل بعد الحضانة.
اغسل الخرزات التي تحتاج إلى شق خمس مرات بغاز الميثان ثنائي الكلورال. بعد هز الخرزات لمدة 15 دقيقة وغسلها مرة أخرى ب di chloro methane ، قم بتصريف دي كلورو ميثان من المحقنة. ثم انقل كل حبة فردية إلى طبق 96 جيدا.
باستخدام مجهر ضوئي وماصة ذات طرف مقطوع ، قم بتغطية لوحة البئر 96 بقلة غطاء وضعها في الفريزر سالب 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بمجرد إزالة اللوحة من الفريزر ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الميثان الكلورو TFA DI المبرد المحضر مسبقا إلى كل بئر يحتوي على حبة. استبدل زلة الغطاء وضع لوحة الحائط 96 على شاكر مرة أخرى في الفريزر سالب 20 درجة مئوية.
بعد الرج لمدة 20 دقيقة ، قم بإزالة لوحة الحائط 96 من الفريزر وانزع زلة الغطاء. جفف دي كلورو ميثان من كل بئر عن طريق نفخ الهواء فوقه. عند شقها تحت درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول ميثان TFA DI CHLORO بنسبة 50٪ ، لوحظ تدهور كبير.
تتوافق القمتان 593 و 484 مع الرابط وأداة تشذيب PTA على التوالي ، مما يدل على أن الجزيء بأكمله قد تم تصنيعه بنجاح على حبة ولكنه تحلل أثناء الانقسام. عند الانشقاق في ظل ظروف درجات الحرارة المنخفضة كما هو موضح أعلاه ، يتم قمع كمية التحلل الناجم عن TFA بشكل كبير. تم وصف آلية الانقسام في الأدبيات السابقة ويعتقد أنها تمر عبر جزيئات PTA وسيطة يمكن تسلسلها بواسطة Ms.MS ، ونمط التجزئة مشابه للببتيدات والببتيدات.
جزيئات PTA المركبة مع S اثنين من حمض البروبول D أربعة تعطي عموما قمما أوسع في MS و MSM. السيدة Spectra نظرا لوجود منتجات غير مكتملة مثل S two bromo propan ، وحمض NOIC D three ، يمكن استخدام هذا كمؤشر على وجود مركز R اللولبي أثناء إجراء التسلسل ، تميل جزيئات PTA أيضا إلى تكوين مقربة أكثر من الببتيد الببتيد. لذلك ، يفضل استخدام الماء منخفض الصوديوم والأجهزة البلاستيكية.
منتج ثانوي محتمل آخر هو مادة الأكريلاميد التي تتكون من التخلص من البروم أثناء الأمين. بمجرد تكوين مادة الأكريلاميد ، يتم إنهاء التسلسل. يمكن حل ذلك عن طريق خفض تركيز الأمين الأولي إلى مولر واحد لتقليل المحلول.
Basicity بمجرد إتقان مكتبة جيدة الحجم ، يمكن تحضيرها في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. الآن بعد أن تم تطوير هذه الكيمياء بالكامل وأصبح التوليف فعالا للغاية ، آمل أن يتبنى الباحثون الآخرون هذه التكنولوجيا القوية لصنع محاكاة الببتيد المقيدة توافقيا لتطوير الأدوية وتطوير المسبارات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة تركيبية لإنشاء أميد ثالثي للببتيد (PTAs)، وهي فئة من المواد المقلدة للببتيد. تجمع الطريقة بين استراتيجيات الانقسام والتجميع والاستراتيجيات تحت المونومر لتكوين مكتبة من PTAs تحتوي على مركب واحد في حبة واحدة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- تركيب الببتيد
- الكيمياء التوافقية
- اكتشاف الأدوية
الخلفية
- أميد ثالثي للببتيد هي عائلة كبرى من المركبات.
- تشمل الببتيدات والبيبتويد والبيبتيدات الميثيلة N.
- تعتبر المكتبات التوافقية قيمة للفحص عالي الإنتاجية.
- يمكن لأميد ثالثي للببتيد توفير روابط بروتينية جديدة لاكتشاف الأدوية.
غرض الدراسة
- لتركيب مكتبات توافقية تحتوي على وحدات PTA.
- لاستخدام الأحماض الأمينية الطبيعية في إنشاء مونومرات جزئية لـ PTA.
- لتمكين الفحص عالي الإنتاجية لاكتشاف الأدوية.
الطرق المستخدمة
- تحضير مونومرات جزئية لـ PTA من الأحماض الأمينية الطبيعية.
- تركيب منطقة رابط ببتيد على دعامة صلبة.
- إنشاء مكتبة توافقية تحتوي على وحدات فرعية لـ PTA والببتيد.
- توصيف المكتبة المركّبة لضمان الجودة.
النتائج الرئيسية
- تم تركيب مكتبة توافقية تحتوي على وحدات ثالثي للببتيد مقيدة توافقيًا بنجاح.
- يمكن استخدام المكتبة للفحص عالي الإنتاجية.
- تشمل التطبيقات المحتملة اكتشاف روابط بروتينية جديدة.
- توضح الطريقة تقنيات تركيب وتوصيف فعالة.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة التركيبية أسلوبًا قويًا لإنشاء مكتبات PTA.
- تعتبر مثل هذه المكتبات ضرورية لتطوير جهود اكتشاف الأدوية.
- يساهم هذا العمل في مجال المواد المقلدة للببتيد والكيمياء التوافقية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Conformationally constrained peptide mimetics such as peptide tertiary amides (PTAs) address a key challenge in early drug discovery: identifying high-affinity protein ligands from combinatorial libraries. By introducing steric and stereochemical constraints through side chains on both α-carbon and backbone nitrogen, PTAs enhance structural preorganization, improving the likelihood of target engagement. This approach supports mechanistic de-risking in lead generation by expanding chemical space beyond traditional peptides and peptoids, offering improved predictive confidence in ligand discovery campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through structurally constrained peptidomimetics that reduce conformational entropy upon binding.
- Operational Value: Supports biological de-risking by generating ligands with increased proteolytic stability and cell permeability, as demonstrated in prior peptoid studies.
- Predictive Value: Enhances target validation confidence by increasing the probability of identifying high-affinity binders from screened libraries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces one-bead one-compound (OBOC) libraries suitable for high-throughput screening against protein targets.
- Reproducibility: Employs split-and-pool synthesis with sub-monomer chemistry to ensure uniform bead-based compound presentation.
- Scalability: Enables generation of diverse PTA-peptide chimeric libraries amenable to automation and parallel synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a pathway from discovery-stage ligand identification to preclinical validation using MS/MS-sequenceable PTA scaffolds.
- Mechanistic De-risking: Reduces attrition risk by delivering ligands with defined conformation and reduced flexibility, improving target specificity predictions.
- Biomarker Alignment: Supports screening campaigns where conformational constraint correlates with functional activity in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling the synthesis of conformationally diverse PTA libraries that bridge peptidomimetic design and functional screening, supporting progression from target validation to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening by generating ligands with restricted conformation, improving hit-to-lead progression potential.
- Screening: Delivers OBOC libraries compatible with bead-based assays, enabling standardized, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables library characterization via MS/MS sequencing, with fragmentation patterns comparable to peptides, supporting identity confirmation and purity assessment.
- Translational Research: Supports advancement to preclinical studies by yielding proteolysis-resistant and cell-permeable scaffolds suitable for further optimization.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, platform-capable approach for generating diverse PTA libraries across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in ligand discovery by accessing chemically diverse, conformationally constrained peptidomimetic space.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible synthesis of OBOC libraries using split-and-pool and sub-monomer strategies on solid support.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by increasing the likelihood of identifying high-affinity binders, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through enhanced ligand quality and structural definition in early screening stages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic synthesis, solid-phase chemistry, and sub-monomer techniques for PTA precursor preparation.
- Depends on anhydrous conditions, low-temperature reaction control, and inert atmosphere handling during key coupling steps.
- Necessitates access to microfluidic splitting tools, syringe reactors, and purification systems such as silica gel column chromatography.
- Involves optimization of cleavage conditions to minimize TFA-induced degradation, with low-temperature protocols recommended.
- Demands careful monitoring of side products such as acrylamide from amine overconcentration, which can terminate chain elongation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Acid Bromide from Natural Amino Acids and Isotopic Labeling of Alanine Using Transaminase
4:39
Synthesis of Peptoid Linker Region
6:15
Split-and-pool Synthesis of PTA Library with (R)- and (S)-2-bromopropionic Acids
11:10
Results: Characterization of a One-Bead-One-Compound Peptide Tertiary Amine Library
13:00
Conclusion
