طريقة حساسة لقياس خلايا السرطان هرمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الشيخوخة الخلوية بطريقة سريعة وحساسة. ونوضح هنا فائدة هذه الطريقة في فحص الأدوية الكيميائية المحتملة. أولاً، يتم تحفيز الشيخوخة الخلوية.

يتم إضافة دواء الدوكسوروبيسين العلاجي الكيميائي إلى الخلايا السرطانية. بعد ذلك، يُطبق Bain A one لمعادلة الرقم الهيدروجيني الحمضي لليسوسومات الخلوية. ثم تُضاف مادة C 12 FDG، وهي ركيزة بيتا جالاكتوز النافذة عبر الخلايا، بمجرد امتصاصها خلويًا.

يتم تحلل C 12 FDG ويصدر فلورة. ونظرًا لأن beta GCSEs تتركز في الليزوزومات الخاصة بالخلايا الهرمة، فإن هذه الخلايا تصبح أكثر فلورة من الخلايا غير الهرمة. ولتحديد الفرق في الفلورة كمياً، يتم تمرير الخلايا عبر جهاز قياس التدفق الخلوي (flow Cytometer)، ويسمح تحليل البيانات الناتجة بتحديد النسبة المئوية للخلايا السرطانية الهرمة تحت ظروف علاجية مختلفة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مقايسة بيتا-جالاكتوزيداز، في أنها تسهل التحديد الكمي السريع والحساس للخلايا الهرمة. وفي الواقع، خطرت لنا فكرة هذه الطريقة عندما واجهنا صعوبات في التحديد الكمي للخلايا الهرمة باستخدام مقايسة بيتا-جالاكتوزيداز الشائعة. وبالرغم من أننا نستخدم هذه التقنية للكشف عن الهرم في الخلايا السرطانية، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً في الخلايا الطبيعية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة سريعة في مجال السرطان، مثل ما إذا كان دواء العلاج الكيميائي قد حفز الخلايا السرطانية على السس، مما قد يعزز الخباثة. وبذلك، يمكن لهذه التقنية أن تساعد في نهاية المطاف في تحديد علاجات علاجية جديدة للسرطان. عند العمل داخل غطاء fume hood كيميائي، يتم إذابة مسحوق C 12 FDG في DMSO للوصول إلى تركيز نهائي قدره 20 millimolar، ثم يتم تقسيم المحلول إلى أنابيب einor سعة 0.5 milliliter وتخزينها في درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.

يجب استخدام DMSO في ظروف سلامة مناسبة، كما يتم إذابة مسحوق CIN A في DMSO للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.1 Millimolar. يتم توزيع المحلول في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.5 milliliter وتخزينها عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

ملاحظة، يجب استخدام CIN مع اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة. يمكن تنفيذ هذا الإجراء باستخدام خلايا ملتصقة أو غير ملتصقة. هنا يتم توضيح الإجراء باستخدام خط خلايا المايلوما البشري RPMI 8 2 2 6.

تنمو هذه الخلايا في معلق، لذا يتم استنبات خلايا RPMI 8 2 2 6 في وسط يحتوي على 10%FBS و1%antibiotics عند درجة حرارة 37 degrees Celsius و5%carbon dioxide. قبل 24 ساعة من إجراء التجربة، يتم استزراع الخلايا في أطباق ذات ستة آبار بحيث تكون في طور النمو اللوغاريتمي لمنحنى التكاثر الخلوي. وفي وقت التجربة، ولتحديد نسبة الخلايا الهرمة، ستكون هناك حاجة إلى ثلاث عينات خلوية: خلايا غير معالجة وغير مصبوغة بـ ST، وخلايا غير معالجة مصبوغة بـ C 12 FDG، وخلايا معالجة مصبوغة بـ C 12 FTG.

لكل حالة، يلزم توفير خمسة في 10⁵ خلية كحد أدنى لقياس التدفق الخلوي لشيخوخة الخلايا السرطانية المستحدثة. عند إضافة الدواء الكيميائي doxorubicin، يجب تكييف تركيز الدواء ومدة العلاج وفقاً لنوع الخلايا. تم الاختبار على خلايا rpmi 8 2 2 6.

يمكن تحفيز الشيخوخة عن طريق معالجة 10 من الخلايا الست لكل ملليلتر بـ 15 nanomolar من doxorubicin لمدة 48 ساعة. لا تنسَ تضمين عينة غير معالجة كضابط سلبي مع الحضن عند 37 °C و 5% CO2. قد تؤدي المعالجة بالأدوية الكيميائية إلى موت الخلايا المبرمج.

وبناءً على ذلك، بعد يومين، يتم فحص حيوية الخلايا عن طريق استبعاد صبغة tripan blue باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) ومجهر. إذا كانت نسبة الحيوية أقل من 70%، يتم إزالة الخلايا الميتة باستخدام طقم مناسب، مثل dead cell removal kit من شركة Milton E، لضمان عدم تأثير الخلايا الميتة على التحليلات اللاحقة. وخلاف ذلك، يتم إزالة وسط الزرع عن طريق تدوير الخلايا بسرعة 300 GS لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، وبعد إزالة السائل الطافي، يتم الإضافة المسبقة لوسط زراعة طازج يحتوي على 100 anom or cin، A one لمعادلة الرقم الهيدروجيني الحمضي لليزوسومات، ثم التحضين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide. يتم إذابة ركيزة beta galacto C 12 FDG في وسط زراعة طازج مُدفأ مسبقاً ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2 millimolar، وذلك بعد التحضين مع beil mycin.

أضف C 12 FDG مباشرة إلى الخلايا والوسط بتركيز نهائي قدره 33 Micromolar، ثم حضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide. بعد فترة التحضين، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 Gs لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد عملية الطرد المركزي، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS مع إجراء الطرد المركزي في كل مرة كما سبق، ثم تخلص من الراشح بعد الغسلة الثانية. أعد تعليق كريس الخلايا في 500 microliters من PBS البارد، ثم قم بإجراء وسم مناعي مشترك لتوصيف مجتمع الخلايا الهرمة بشكل أكبر. إذا لم تكن لديك خبرة في قياس التدفق الخلوي، فسيكون الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو تنفيذ تحليل قياس التدفق الخلوي.

لضمان النجاح، تأكد من إدراج الضوابط المناسبة واطلب المساعدة من شخص خبير عند الحاجة. قبل تشغيل العينة الأولى، قم بإعداد رسم بياني ثنائي المعلمات يعرض قناة التشتت الأمامي (FSC) مقابل قناة التشتت الجانبي (SSC). ثم قم بتشغيل العينة الأولى التي تحتوي على خلايا غير معلمة.

قم بضبط أنابيب مضاعف التصوير الضوئي (PMTs) وحدد منطقة الاهتمام، مع استبعاد الخلايا الميتة والحطام الخلوي الذي قد يكون ظهر خلال بوابة تحضير العينة. تظهر منطقة الاهتمام هذه في مدرج تكراري أحادي المعامل يعرض فلورة C 12 FDG كـ FL1 على المقياس اللوغاريتمي للمحور السيني وعدد الأحداث على المحور الصادي. يمثل إجمالي عدد الأحداث عدد الخلايا التي تم تحليلها.

اضبط أنبوب التضاعف الضوئي (PMT) بحيث تظهر الخلايا غير الموصومة في العقد الأول على المقياس اللوغاريتمي للمحور السيني. حدد الفلورة الذاتية للخلايا إذا لزم الأمر عن طريق تمرير الخلايا غير الموصومة في جهاز قياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل العينة الثانية التي تحتوي على خلايا غير معالجة على مدرج تكراري أحادي المعلم يعرض FL1، ثم ضع المؤشر بعد المجتمع الخلوي الموصوم بشكل خافت.

ستسمح هذه العتبة بالتمييز بين الخلايا غير الهرمة، التي تظهر بوسم خافت، والخلايا الهرمة، التي تظهر بوسم ساطع. قم بتشغيل العينة الثالثة التي تحتوي على الخلايا المعالجة. تظهر الخلايا الهرمة ذات الوسم الساطع فوق العتبة التي تم تحديدها في الخطوة السابقة.

قم بتقييم النسبة المئوية للخلايا الهرمة عن طريق قسمة عدد الأحداث المضيئة على العدد الإجمالي للأحداث إذا لزم الأمر. يمكن أيضاً تقدير نشاط إنزيم beta galactase باستخدام متوسط شدة الفلورة لتقييم الشيخوخة الناتجة عن إجراء علاج كيميائي. تم معالجة خط خلايا الورم النخاعي المتعدد المتاح تجارياً R RRP I 8 2 2 6 لمدة يومين باستخدام الدوكسوروبيسين، وهو عقار علاج كيميائي، واختبار الشيخوخة كما هو موضح في هذا الفيديو؛ تظهر هذه المخططات البيانية الفلورة للخلايا غير المعالجة على اليسار والخلايا المعالجة على اليمين.

تظهر مجموعة من الخلايا المصبوغة بوضوح والتي تمثل الخلايا الهرمة في المنطقة V. وبالتوازي مع ذلك، تم صبغ عينة الخلايا نفسها باستخدام مقايسة beta galactosidase. وتوضح هذه الصورة التمثيلية خلايا زرقاء بالكامل وخلايا زرقاء جزئياً لتبيان الصعوبة في تمييز الخلايا الهرمة الزرقاء حقاً. ولتوضيح خصوصية C 12 FDG في تحديد نسبة الخلايا الهرمة، عولجت الخلايا أيضاً بتركيزات مختلفة من doxorubicin.

تم تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة عن طريق قسمة عدد الأحداث الساطعة على إجمالي عدد الأحداث؛ حيث كانت النسب المئوية للخلايا الهرمة 0.8% و15.78% و26.31% لجرعات 5 و25 و50 nanomolar من doxorubicin على التوالي. يثبت هذا أن وسم C 12 FTG محدد للخلايا الهرمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير كمية الخلايا الهرمة أو عدم هرمها عن طريق قياس التدفق الخلوي باتباع هذا الإجراء، وكيفية تنفيذ طرق مثل الوسم المناعي من أجل توصيف الخلايا الهرمة. لا تنسَ أن العمل مع DMSO أو الخلايا السرطانية يمكن أن يكون خطيراً للغاية؛ لذا يجب اتخاذ الاحتياطات دائماً أثناء تنفيذ هذا الإجراء.