طريقة حساسة لقياس خلايا السرطان هرمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد شيخوخة الخلايا بطريقة سريعة وحساسة. نوضح هنا فائدة هذه الطريقة في فحص أدوية العلاج الكيميائي المحتملة. أول من يحفز الشيخوخة الخلوية.

عقار العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين إلى الخلايا السرطانية. التالي Bain A يتم تطبيقه لتحييد الرقم الهيدروجيني الحمضي للجسيمات الحالة الخلوية. ثم تتخلل الخلية الركيزة بيتا جالاكتو C 12 FDG عند الامتصاص الخلوي.

يتم تحلل C 12 FDG ويتألق. نظرا لأن بيتا GCSEs يتم إثرائه في الجسيمات الحالة للخلايا العمرة ، فإنها تصبح أكثر فلورية من الخلايا غير الشائخة. لتحديد الفرق في التألق ، يتم تشغيل الخلايا على تحليل مقياس التدفق الخلوي للبيانات الناتجة يسمح بتقدير النسبة المئوية للخلايا السرطانية الشائخة في ظل ظروف العلاج المختلفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل بيتا جالاكتوز ، على سبيل المثال ، هي أنها تسهل القياس الكمي السريع والحساس للخلايا الشائخة. في الواقع ، نضيف أولا فكرة هذه الطرق عندما نواجه صعوبة في تحديد الخلايا العمرة باستخدام بيتا جالاكتوز شائع الاستخدام. على الرغم من أننا نستخدم هذه التقنية للكشف عن الشيخوخة على الخلايا السرطانية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا على الخلايا الطبيعية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة سريعة في مجال السرطان ، مثل ما إذا كان دواء العلاج الكيميائي قد حفز الخلايا السرطانية على المرض ، مما قد يعزز الأورام الخبيثة. وبالتالي ، يمكن أن تساعد هذه التقنية في النهاية في إخطار العلاجات العلاجية الجديدة للسرطان. العمل في غطاء الدخان الكيميائي يذوب مسحوق C 12 FDG في DMSO إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمولار في أنابيب einor سعة 0.5 ملليلتر وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

يجب استخدام DMSO مع ظروف السلامة المناسبة ، وكذلك الذوبان. CIN A مسحوق واحد في DMSO إلى تركيز نهائي قدره 0.1. Millimolar Eloqua المحلول في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 ملليلتر وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

لاحظ أنه يجب استخدام CIN مع احتياطات السلامة المناسبة. يمكن تنفيذ هذا الإجراء باستخدام خلايا ملتصقة أو غير ملتصقة. هنا يتم توضيح الإجراء باستخدام خط خلية الورم النقوي البشري RPMI 8 2 2 6.

تنمو هذه الخلايا في معلق ، وتزرع RPMI 8 2 2 6 خلايا في وسط يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل 24 ساعة من إجراء التجربة ، بذر الخلايا في ستة ألواح جيدة بحيث تكون في مرحلة السجل من منحنى التكاثر الخلوي. في وقت التجربة لتحديد النسبة المئوية للخلايا العمرة ، ستكون هناك حاجة إلى ثلاث عينات من الخلايا. الخلايا غير المعالجة وغير الملطخة ب ST ، والخلايا غير المعالجة الملطخة ب C 12 FDG ، والخلايا المعالجة الملطخة ب C 12 FTG.

لكل حالة ، يلزم ما لا يقل عن خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لشيخوخة الخلايا السرطانية الناجمة عن قياس التدفق الخلوي. بإضافة عقار العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين ، يجب تكييف تركيز الدواء ومدة العلاج مع نوع الخلية. تم اختباره ل rpmi 8 2 2 6 خلايا.

يمكن إحداث الشيخوخة عن طريق علاج 10 من الخلايا الست لكل مليلتر ب 15 نانومولار دوكسوروبيسين لمدة 48 ساعة. لا تنس تضمين عينة غير معالجة كحضانة تحكم سلبية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قد يؤدي العلاج بأدوية العلاج الكيميائي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا.

لذلك ، بعد يومين ، تحقق من صلاحية الخلية عن طريق استبعاد ثلاثي اللون الأزرق باستخدام hemo ومقياس الخلوي والمجهر. إذا كانت النسبة المئوية للبقاء أقل من 70٪ ، فقم بإزالة الخلايا الميتة باستخدام مجموعة مناسبة مثل مجموعة إزالة الخلايا الميتة من Milton E للتأكد من أن الخلايا الميتة لن تتحيز التحليل اللاحق. خلاف ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة عن طريق تدوير الخلايا لأسفل عند 300 GS لمدة خمس دقائق.

ثم بعد إزالة المادة الطافية في وسط الاستزراع الطازج Prewarm الذي يحتوي على 100 أنوم أو سين ، يتم تحييد الرقم الهيدروجيني الحمضي للجسيمات الحالة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون يذوب بيتا جالاكتو الركيزة C 12 FDG في ثقافة ما قبل الحرب. تركيز متوسط إلى نهائي من ملليمولار. بعد الحضانة مع بيل مايسين.

أضف C 12 FDG مباشرة إلى الخلايا ومتوسط إلى تركيز نهائي يبلغ 33. يحتضن Micromolar لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جي ثانية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الدوران ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS يدور لأسفل في كل مرة كما كان من قبل وقم بإزالة المادة الطافية بعد الغسيل الثاني. يقوم Resus بتعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من PBS البارد ثم قم بإجراء وضع علامات مناعية مشتركة لتوصيف عدد الخلايا القديمة. إذا لم تكن لديك خبرة في قياس التدفق الخلوي ، فإن أصعب جانب في هذا الإجراء هو إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.

لضمان النجاح ، تأكد من تضمين الضوابط المناسبة واطلب المساعدة من شخص عديم الخبرة حسب الحاجة. قبل تشغيل العينة الأولى، قم بإعداد رسم بياني من معلمتين يعرض قناة التشتت الأمامية أو FSC مقابل SSC لقناة التشتت الجانبية. ثم قم بتشغيل العينة الأولى التي تحتوي على خلايا غير مسماة.

اضبط أنابيب المضاعف الضوئي أو PMTs وحدد منطقة الاهتمام ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام الخلوي الذي ربما يكون قد ظهر أثناء بوابة تحضير العينة. هذه المنطقة ذات الاهتمام في رسم بياني لمعلمة واحدة يعرض مضان C 12 FDG ك FL واحد على مقياس السجل للمحور x وعدد الأحداث في المحور Y. يمثل العدد الإجمالي للأحداث عدد الخلايا التي تم تحليلها.

قم بتعيين PMT بحيث تظهر الخلايا غير المسماة في العقد الأول على مقياس السجل للمحور x. حدد التألق الذاتي للخلايا إذا لزم الأمر عن طريق تشغيل الخلايا غير المسماة في التدفق. يقوم مقياس الخلوي بتشغيل العينة الثانية التي تحتوي على خلايا غير معالجة على الرسم البياني للمعلمة الواحدة التي تعرض FL في وضع واحد على المؤشر بعد السكان المصنفين بشكل خافت.

ستسمح هذه العتبة بالتمييز بين الخلايا غير الشيئة ، التي يتم تصنيفها بشكل خافت والخلايا العمرة ، والتي يتم تصنيفها بشكل ساطع. قم بتشغيل العينة الثالثة التي تحتوي على الخلايا المعالجة. تظهر الخلايا السائدة ذات العلامات الزاهية أعلى من العتبة المحددة في الخطوة السابقة.

قم بتقييم النسبة المئوية للخلايا السائدة بقسمة عدد الأحداث الساطعة على إجمالي عدد الأحداث إذا لزم الأمر. يمكن أيضا تقدير نشاط بيتا جالاكتو تاس باستخدام متوسط شدة التألق لتقييم الشيخوخة الناجمة عن إجراء العلاج الكيميائي. تم علاج خط خلايا الورم النقوي المتعدد المتاح تجاريا R RRP I 8 2 2 6 لمدة يومين باستخدام دوكسوروبيسين ، وهو دواء علاج كيميائي ومقايسة للشيخوخة كما هو موضح في هذا الفيديو ، تظهر هذه الرسوم البيانية تألق الخلايا غير المعالجة على اليسار والخلايا المعالجة على اليمين.

تظهر مجموعة من الخلايا ذات العلامات الزاهية التي تمثل الخلايا السائدة في المنطقة بالتوازي V.In ، تم تلطيخ عينة الخلية نفسها باستخدام مقايسة بيتا جالاكتو. في هذه الصورة التمثيلية ، تظهر الخلايا الزرقاء بالكامل والخلايا الزرقاء جزئيا لتوضيح صعوبة التمييز بين الخلايا العمرانية الزرقاء حقا. لتوضيح خصوصية C 12 FDG في تحديد النسبة المئوية للخلايا السائدة ، تمت معالجة الخلايا أيضا بتركيزات مختلفة من دوكسوروبيسين.

تم تحديد النسبة المئوية للخلايا السائدة بقسمة عدد الأحداث الساطعة. وفقا للعدد الإجمالي للأحداث ، كانت النسب المئوية للخلايا العمرة 0.8٪ و 15.78٪ و 26.31٪ لجرعة 5 و 25 و 50 نانومولار دوكسوروبيسين على التوالي. هذا يدل على أن وضع العلامات على C 12 FTG خاص بالخلايا القديمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الخلايا العمرة التي يمكن أن تتسلسل أم لا عن طريق قياس التدفق الخلوي باتباع هذا الإجراء من طرق مثل وضع العلامات المناعية من أجل توصيف الخلايا العمرة. لا تنس أن العمل مع DMSO أو الخلايا السرطانية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.