قياس النمو وحيوية التعبير الجيني للورم استهداف S. تيفوميوريم البكتيريا

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة ديناميكيات التعبير الجيني في الجسم الحي لبكتيريا S tyrian التي تنمو داخل الأورام. أولا في نموذج سرطان الطعم الخارجي للفأر ، يتم حقن البكتيريا عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيلي. تستعمر البكتيريا الورم وتنمو بشكل كبير بينما يتم تصور التعبير الجيني باستخدام مراسلي الإنارة

يتم إجراء تصوير التلألؤ البيولوجي للحيوان بالكامل باستخدام نظام التصوير الطيفي IVUS. يتم التقاط أكثر من 24 إلى 48 ساعة من صور IVUS. ترتبط سلسلة الصور هذه بعدد المستعمرات الناتجة عن تجانس الأورام وطلاءها.

تسمح لنا هذه البيانات معا بقياس التعبير الجيني والديناميكيات السكانية للبكتيريا المستهدفة بالورم في الجسم الحي في ممر تحضير الخلايا في الوقت الفعلي ، وخطوط الخلايا باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية. في هذه التجربة ، استخدمنا الخلايا الإجمالية لثماني خلايا ocar إلى طلاقة مشتركة مستهدفة من 80 إلى 100٪ حصاد وعد الخلايا على DMEM وخالي من الهيمو ، ومقياس الخلوي ، وإعادة التركيب ، والتعليق ، والفينول الأحمر الخالي من DMEM بتركيز مستهدف من خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر ، أو حوالي 200 ميكرولتر لكل قارورة. أضف 15٪ عامل نمو منخفض matrigel وحافظ على تعليق الخلية على الجليد حتى زرع الورم.

قام الرانيس بتخدير إناث الفئران العارية البالغة من العمر أربعة أسابيع باستخدام 3٪ من الفلور. قم بتحميل الخلايا 100 ميكرولتر لكل ورم في حقنة مطحنة واحدة وقم بإرفاق إبرة قياس 27 ونصف لكل من موقعي حقن الجناح الخلفي الثنائي. ارفع الجلد برفق باستخدام الملقط لعمل خيمة وحقن الخلايا في القاعدة.

احرص على عدم اختراق الدم العميق جدا. استخدم الملقط لإزالة المحقنة برفق دون تناثر. راقب نمو الورم يوميا لمدة 10 إلى 20 يوما حتى يتم الوصول إلى قطر الورم من ملليمترين إلى أربعة ملليمترات.

تحضير البكتيريا ، ابدأ زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها في وسائط ثلاثة مل رطل بالإضافة إلى المضادات الحيوية من مخزون فريزر ناقص 80 أو طبق مبرد. في هذه التجربة استخدمنا سلالة التاير ELH أربعة 30 صباحا. خفف الثقافة من واحد إلى 100 إلى رطل مفلتر وتنمو إلى OD 600 من 0.4 إلى 0.6.

قم بالدوران واغسله ثلاث مرات في محلول ملحي مخزن بالفوسفات وأعد تعليقه عند OD 600 نهائي من 0.1 أو حوالي مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع لكل مل. حقن البكتيريا وتخدير ووضعه مع الذيل مشيرا إلى يدك المهيمنة. حدد موقع وريد الذيل وقم بتوسيع باستخدام الماء الدافئ أو المصباح الحراري.

قم بتحميل البكتيريا 100 ميكرولتر لكل فأر في حقنة ميل واحد وثني الرقاقة أقل بقليل من 90 درجة. قم بمحاذاة طرف المحقنة مع وريد الذيل ، واخترق على عمق ضحل لا تشعر بأي مقاومة وحقن البكتيريا. مراقبة إزاحة تدفق الدم لحقن ناجح.

انتظر ما يقرب من 12 إلى 18 ساعة قبل التصوير حتى يحدث الاستعمار. تصوير الفئران يخدر في غرفة الحث. ثم ضع كل فأرة على منصة التصوير.

حافظ على تحديد المواقع بدقة لضمان النتائج الكمية بين النقاط الزمنية ، وتصوير باستخدام نظام التصوير Ibis Spectrum. في حالة تصوير أكثر من واحد ، ضع حواجز ضوئية بينهما لمنع تشريح بإضاءة متقاطعة ، مع إمساك الورم بالملاقط. قم بإزالة الجلد باستخدام حركة مقص عكسية.

الحركة: عندما يتم فصل غالبية الجلد ، قم بإزالة الورم بالكامل باستخدام الملقط. ضع الأعضاء وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة الموزونة مسبقا. نظرا لأن كتلة هذه الأنابيب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ، فمن المهم وزنها مسبقا للحصول على نتائج كمية.

من خلال تحديد التوزيع الحيوي البكتيري لكل نقطة زمنية ، وزيادة وزن الأورام ، إضافة 500 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى 15٪ من الجلسرين وتجانسها باستخدام تمزق الأنسجة ، ويولد تخفيفا تسلسليا وصفيحة لنتائج تمثيلية لعد المستعمرات البكتيرية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا إنشاء بيانات حول النمو في الجسم الحي وديناميكيات التعبير الجيني للبكتيريا المستهدفة بالورم. يتم تلخيص سير العمل العام هنا.

في المرحلة الأولى ، قمنا بحقن البكتيريا وتصوير باستخدام ivus لقياس التعبير الجيني مع اللمعان كمراسل. ثم في المرحلة الثانية ، قمنا باستئصال الأورام وتجانسها وطلائها لعدد المستعمرات لتحديد عدد البكتيريا التي تنمو في الورم. يتم تصور التلألؤ البيولوجي الناتج عن السلالات البكتيرية باستخدام زيادات إشارة IVUS مع الجرعة المحقونة بجرعة استعمارية دنيا حوالي خمسة أضعاف 10 إلى خمسة في جميع الحالات بسبب التوهين.

قياس البكتيريا إما الأورام المستعمرة على وجه التحديد أو تفشل في النمو بشكل كبير في إشارة الفئران باستخدام وحدات الإشعاع للتطبيع لوقت التعرض أو القيم النموذجية التي تزيد من 10 إلى ستة أو أكثر على الاستعمار لعدوى معينة تزداد الإشارة بمرور الوقت على مدار 24 إلى 48 ساعة. تكون ذروة البداية حوالي 36 ساعة بعد الحقن هنا ، ولكن قد يختلف التوقيت اعتمادا على السلالة والبلازميد المستخدم. تأكد من وضع الماوس بنفس الطريقة تماما في كل مرة لضمان النتائج الكمية في المجموعة التالية من التجارب.

يتم قياس التوزيع الحيوي للبكتيريا لقياس نمو البكتيريا بمرور الوقت في أعضاء مختلفة ، ويتم قياس البكتيريا والأورام القابلة للحياة عن طريق استئصال الورم وتجانسه وتخفيفه التسلسلي. يمكن تحديد الأعضاء الأخرى. وبالمثل ، استخدمنا الطحال هنا لأن نسبة طحال الورم هي مقياس نموذجي لخصوصية البكتيريا بعد الحساب الخلفي باستخدام عامل التخفيف.

تسمح لنا هذه الأعداد بقياس عدد البكتيريا المحدد بمرور الوقت. على اليسار ، يمكننا أن نرى عدد البكتيريا ينمو بشكل مطرد طوال مدة التجربة. مع مضاعفة الوقت بين ساعة وثلاث ساعات ، أقل بكثير من تجارب زراعة الدفعات.

من المحتمل أن يكون هذا بسبب الظروف الغذائية السيئة في البيئة المكروية للورم. على اليمين ، قمنا بقياس نسبة طحال الورم ولاحظنا أنها تزداد طوال التجربة. الهدف من هذه التجارب هو المراقبة الكمية لديناميكيات النمو والتعبير الجيني للبكتيريا وبيئات الأورام باستخدام تقنيات التصوير IVUS وعد المستعمرات.

لقد أظهرنا أنه يمكن تمييز مجموعات البكتيريا في الجسم الحي في بيئات الورم. في المستقبل ، يمكن تصميم وهندسة برامج التعبير الجيني الأكثر تعقيدا لبناء أنظمة توصيل علاجية متطورة في البكتيريا.