بروتوكولات لتنفيذ و كولاي وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام تعبير خال من الخلايا قائم على الإشريكية القولونية يشار إليه باسم ترجمة النسخ أو TX tl. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع ثلاثة مكونات أولية أولا لمستخلص الخلايا الخام TX TL ومحلول الأحماض الأمينية ومحلول الطاقة. سيتم دمج محلول الأحماض الأمينية ومحلول الطاقة لاحقا لعمل المخزن المؤقت TX TL.

الخطوة الثانية هي معايرة مستخلص الخلايا الخام لتحديد تركيزات المغنيسيوم والبوتاسيوم والDTT المثلى لإنتاج تفاعلات TX TL بأقصى مستويات التعبير. بعد ذلك ، يتم استخدام نتائج المعايرة لصنع نظام TX TL ثلاثي الأنابيب مصنوع من مستخلص الخلايا الخام العازلة والحمض النووي. الخطوة الأخيرة هي تنفيذ تفاعل TX TL باستخدام الكواشف التي تم إجراؤها للتو.

في النهاية ، يتم استخدام TX TL لإظهار دوائر البيولوجيا التركيبية بالإضافة إلى تطبيقات التعبير التقليدية الخالية من الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في اختبار الدوائر في مجال البيولوجيا التركيبية من خلال توفير بيئة متساوية في المختبر ، والتي تحاكي ذلك في الجسم الحي. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو زيادة سرعة التصميم البيولوجي الاصطناعي عن طريق إزالة الحاجة إلى إجراء جميع خطوات النماذج الأولية في الجسم الحي.

ستساعد كلير هايز ، مساعدة باحثة في مجموعتنا. يرجى ملاحظة أن هذا الفيديو سيمر فقط بأقسام محددة من البروتوكول الهامة للتصوير. البروتوكول الكامل متاح مع النص المقالة.

في وقت سابق من هذا البروتوكول ، نمت الخلايا البكتيرية وحبيباتها. الآن سيتم تحلل الخلايا البكتيرية باستخدام مضرب الخرزة. احتفظ بجميع أنابيب الصقر سعة 50 ملليلتر التي تحتوي على تعليق الخلية على الجليد.

لأغراض هذا الفيديو ، سيتم عرض ديكور الخرز لأنبوب واحد فقط. يجب إضافة الخرزات بشكل متقطع إلى أنبوب الصقر في ثلاث حصص لكل منها باستخدام ثلث إجمالي الخرز. أضف أول كمية من الخرزات إلى دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية وضعها على الجليد.

بنفس الطريقة ، أضف الكمية الثانية من الخرز والدوامة وضعها على الجليد. بعد إضافة آخر حصة ودوامة تأكد من توزيع الخرزات بشكل موحد ، يجب تشكيل عجينة سميكة بعد خطوة الدوامة الثالثة. ضع الأنبوب على الثلج.

قم بإعداد طرف ماصة بحجم خمسة ملليلتر باستخدام مقص معقم لقطع النهاية. لإنشاء فتحة من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات، اطلب الماصة إلى ملليلترين. ضع 20 أنبوبا معقما من الخرز على الثلج.

استخدم الماصة المعدلة للتحقق من اللزوجة العالية لمحلول خلية الخرزة. يجب أن تكون لزجة لدرجة أنها بالكاد تخرج من طرف الماصة. أثناء الإخراج ، قم بإزالة محلول خلية الخرزة من أنبوب فالكون وانقله إلى أنبوب ديكور الخرز.

يملأ هو ثلاثة أرباع تدور كاملة جدا لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغيرة. لإزالة فقاعات الهواء دون إعادة توزيع الخرزات ، قم بإنهاء إضافة محلول خلية الخرزة إلى الأنبوب لتشكيل الغضروف المفصلي المقعر. بعد ذلك ، أضف قطرة صغيرة جدا من محلول خلية الخرزة إلى داخل غطاء أنبوب الديكور من الخرز.

الحرص على عدم وضع المحلول في الشفة الخارجية للغطاء. خلاف ذلك ، لن يغلق أنبوب حبة الخرز بشكل كاف. اضغط على الغطاء على سطح مستو وتحقق من عدم وجود فقاعات هواء في الجزء السفلي من الغطاء.

قم بتغطية أنبوب الضرب بالخرز. إذا تم القيام به بشكل صحيح ، فيجب إغلاق الغطاء بإحكام. يجب ألا تكون فقاعات الهواء مرئية ويجب أن يفيض القليل من محلول خلايا الخرزة من الآن فصاعدا ، مطلوب شخصين لإنجاز حبة الخرزة بكفاءة.

قم بتسليم الأنبوب المملوء إلى مساعد لتزيين الخرز بينما يستمر المتظاهر الأول في ملء المزيد من أنابيب الديكور بمحلول خلية الخرزة المتبقي. خذ أنبوب الديكور المملوء وضعه على الثلج. بمجرد جمع أنبوبين مملوءين بالخرز وظلوا على الجليد لمدة دقيقة على الأقل.

ابدأ حبة الخرز أنبوب واحد لمدة 30 ثانية عند 46 دورة في الدقيقة. ضعه رأسا على عقب على الثلج لمدة 30 ثانية أثناء ضرب الأنبوب الآخر. كرر الديكور والجليد بحيث يتم ضرب كل أنبوب حبة مملوء لمدة دقيقة واحدة.

بمجرد معالجة جميع أنابيب الديكور بالخرز المملوءة ، قم ببناء جهاز تصفية من أنبوب صقر سعة 15 مل. أولا ، أضف غطاء حبة جديد من الخرز جزءا مسطحا متجها لأعلى إلى أسفل الأنبوب. ثم قم بإزالة الغطاء من أنبوب الديكور المعالج واضغط على عمود كروماتوغرافيا دقيق بقوة على نهاية أنبوب الديكور المعالج حتى يتم إغلاقه تماما.

التقط الطرف الملحقي لعمود الكروماتوغرافيا الدقيقة وضعه elucian. ينتهي في أنبوب الديكور الفارغ. ضع هذا المركب في أنبوب الصقر سعة 15 مل.

قم ببناء أجهزة الترشيح لجميع أنابيب ضرب الخرز المملوءة واحتفظ بها على الجليد. عند اكتمال جهاز الطرد المركزي ، يتم فك غطاء أجهزة التصفية أنبوب Falcon عند 6 ، 000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لفصل المستخلص والحبيبات عن الخرز. بعد الطرد المركزي ، تحقق من أن كل أنبوب حبة حبة قد أنتج مستخلص قابل للحياة.

يكون المستخلص المخفوق بشكل صحيح عكرا وستحتوي الحبيبات على طبقتين متميزتين كما هو موضح في الأنبوب الموجود على اليسار. يجب التخلص من الأنابيب العكرة كما هو موضح في المثال على اليمين. انقل المادة الطافية من الأنابيب غير التوريدية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.75 مليلتر ، مع أخذ أقل قدر ممكن من الحبيبات.

استمر في وضع الثلج حتى تتم معالجة جميع أنابيب الديكور بالخرز. بعد ذلك ، قم بتدوير أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وجمع المادة الطافية. بعد دمج 500 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الحبيبات في أنبوب ديكور حبة جديد.

احتضان الأنابيب مع إزالة الأغطية عند 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى هضم الأحماض النووية المتبقية باستخدام نوكلياز خارجي داخلي المنشأ يتم إطلاقه أثناء عملية تزيين الخرز. عند اكتمال الحضانة ، يجب أن يبدو المستخلص عكرا.

قم بتوحيد المستخلص في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.75 مليلتر حتى 1.5 مل لكل جهاز طرد مركزي أنبوبي عند 12،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة ، قم بدمج المادة الطافية الخالية من الحبيبات إما في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.75 مليلتر للحصول على عوائد أصغر أو أنبوب صقر سعة 15 مليلتر للحصول على عوائد أكبر على الجليد. قم بتغطية الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق قلبه.

احتفظ ب 10 ميكرولترات من المادة الطافية على الجليد لقياس تركيز البروتين لاحقا. تحديد الكمية الإجمالية للمستخلص المنتج وترطيب العدد اللازم من 10 أشرطة غسيل الكلى المقطوعة بالوزن الجزيئي عن طريق الغمر في المخزن المؤقت S 30 B لمدة دقيقتين. قم بتحميل الكاسيت بما يصل إلى 2.5 مل من المستخلص.

يمكن أن يستغرق كل دورق ما يصل إلى شريطين كسيليز مع التحريك عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. راجع المقالة المكتوبة لمعرفة خطوات المعالجة بعد غسيل الكلى. يتكون تفاعل ترجمة النسخ الأساسي من ثلاثة أجزاء ، مستخلص الخلايا الخام ، والمخزن المؤقت والحمض النووي.

على الرغم من أن التفاعلات يمكن أن تختلف في الحجم ، إلا أن هذا البروتوكول يستخدم نموذجا مكتوبا مسبقا لإجراء تفاعل 10 ميكرولتر. هنا. تشير العناصر باللون الأرجواني إلى قيم إدخال المستخدم ، وتشير العناصر باللون الأزرق إلى كواشف إضافية لإضافتها إلى تصميم التفاعل التجربة في sili باستخدام قسم تحضير المزيج الرئيسي وقسم تحضير الحمض النووي. بشكل عام ، يمكن وضع الثوابت في قسم تحضير المزيج الرئيسي بينما يمكن وضع المتغيرات في قسم تحضير الحمض النووي.

تقليل العينات لكل تجربة لتجنب تبخر العينة وتحيز وقت البدء التجريبي. يتم عرض نموذج إعداد في هذا الجدول. لتحضير عينات الحمض النووي لكل عينة ، قم بإخراج مياه الحمض النووي المشار إليها والعناصر التي زودها المستخدم في أنبوب طرد مركزي صغير.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد المزيج الرئيسي الذي يتكون من مستخلص عازل وأي عناصر مقدمة من المستخدم العالمي تحافظ على الجليد والدوامة. بعد إضافة كل عنصر ، أضف الكمية المناسبة من المزيج الرئيسي إلى كل عينة من الحمض النووي واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة. تعامل مع هذا على أنه وقت بدء التفاعل.

قم بتدوير كل عينة وجهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لإسقاط أي عينة متبقية وتقليل الفقاعات. قم بتشغيل التفاعل في صفيحة 384 بئر عند 29 درجة مئوية. ستختلف أوقات التشغيل حسب التجربة ، ولكنها عادة ما تستمر أقل من ثماني ساعات.

عند الانتهاء من التشغيل ، يمكن قراءة البيانات من قارئ لوحة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مدته خمسة أيام لإعداد ترجمة نسخ داخلية قائمة على الإشريكية القولونية أو نظام التعبير الخالي من الخلايا TXTL. تم تحسين ظروف التعبير لهذا النظام من خلال اختبار تأثيرات طرق معالجة البلازميد المختلفة والمخزن المؤقت elucian.

يجب معايرة بعض المتغيرات التي يتم إدخالها في نظام TXTL مسبقا للتأكد من سميتها ، على سبيل المثال ، في مقارنة طرق معالجة البلازميد طريقة تنقية ، يستخدم المرء فقط مجموعة أدوات إعداد مصغرة لكايا الإعدادية بينما في طريقة التنقية الثانية ، يتم تحضير البلازميد باستخدام نفس مجموعة الإعداد المصغرة ثم المعالجة اللاحقة باستخدام قوارب الكاياك. طقم تنقية PCR سريع. يوضح هذا الرسم البياني مضان نقطة النهاية بعد ثماني ساعات بالإضافة إلى الحد الأقصى لمعدل إنتاج البروتين بناء على متوسط متحرك لمدة 12 دقيقة ، تعد أشرطة الخطأ انحرافا معياريا واحدا عن أربعة أشواط مستقلة في أيام مختلفة.

يرجع الاختلاف في التعبير الذي لوحظ إلى الاختلاف في محتوى الملح. ومع ذلك ، قد لا تظهر العناصر الأخرى أي تأثير على TXTL مثل المخزن المؤقت elucian. تمت مقارنة تركيزات مختلفة من كلوريد TS في تفاعل التعبير الخالي من الخلايا بناء على التعبير عن مولر واحد من البلازميد.

التركيزات المعطاة هي التركيزات النهائية من كلوريد ثلاث. في التفاعل ، المخزن المؤقت elucian المستخدم هو 10 ملليمولار أشرطة خطأ كلوريد تريس هي انحراف معياري واحد عن ثلاثة أشواط مستقلة في أيام مختلفة. يوضح هذا الشكل مخططات معايرة نموذجية لمستخلص الخلايا الخام ، معايرة لمستويات غلوتامات المغنيسيوم الإضافية ، وغلوتامات البوتاسيوم ، ومستويات DTT.

عرض مضان نقطة النهاية بعد ثماني ساعات بالإضافة إلى الحد الأقصى لمعدل إنتاج البروتين بناء على متوسط متحرك لمدة 12 دقيقة. لاحظ أن كل مستخلص خلية خام يحتاج إلى معايرة بشكل مستقل لهذه المتغيرات الثلاثة. بشكل عام ، تشير النتائج إلى أن مستخلص الخلايا الخام هو الأكثر حساسية لمستويات غلوتامات المغنيسيوم تليها مستويات غلوتامات البوتاسيوم.

بناء على هذه المخططات ، فإن النطاق المقبول لغلوتامات المغنيسيوم الإضافية هو أربعة مللي مولار من غلوتامات البوتاسيوم من 60 إلى 80 ملليمولار و DTT هو صفر إلى ثلاثة ملليمولار تهوية على الجانب السفلي. يمكن أن تختلف الكفاءة النهائية لكل مستحضر مستخلص الخلايا الخام بناء على كفاءة المستخدم والظروف البيئية. على الرغم من أن التباين النموذجي في الغلة يتراوح بين خمسة و 10٪ ، إلا أن مضان نقطة النهاية لمستخلصين خام محضرين في تواريخ مختلفة موضح هنا.

أشرطة الخطأ هي انحراف معياري واحد عن ثلاثة عمليات تشغيل مستقلة في أيام مختلفة. لإثبات نظام التعبير الخالي من الخلايا ، تم إنشاء حلقة تغذية مرتدة سلبية تعتمد على قمع Tet واختبارها ، وأظهرت نفس الدائرة التي تعمل مع TC وبدونها تعبيرا عن نقطة النهاية سبع أضعاف. يعد تغيير مراسل D-E-G-F-P بعد ثماني ساعات من أشرطة خطأ التعبير انحرافا معياريا واحدا عن ثلاثة عمليات تشغيل مستقلة في أيام مختلفة.

تظهر الدائرة الجينية في الداخل. يصور هذا الشكل النهائي تحليل التكلفة والتعبير لمستخلصات الخلايا الخام المتنافسة. يقسم المخطط الدائري في فصل تكاليف العمالة والمواد لنظام التعبير الخالي من الخلايا TX TL بناء على تكاليف الكواشف اعتبارا من ديسمبر 2012 وتكاليف العمالة البالغة 14 في الساعة.

تقارن اللوحة B تكاليف نظام التعبير الخالي من الخلايا TX بالأنظمة التجارية الأخرى. يتم تقسيم التكاليف لكل ميكرولتر ، على الرغم من أن أحجام التفاعل قد تختلف حسب المجموعة. تبلغ تكاليف المواد لهذا النظام حوالي 3 سنتات لكل تفاعل ميكرولتر ، وهو انخفاض في التكلفة بنسبة 98٪ مقارنة بالأنظمة التجارية الخالية من الخلايا المماثلة.

توضح اللوحة C مقارنة بين إنتاجية نظام التعبير الخالي من الخلايا TX TL مقابل الأنظمة التجارية الأخرى. يمكن أن ينتج هذا النظام ما يصل إلى 0.75 ملليغرام لكل مليلتر من بروتين المراسل باستخدام إما مروج قائم على Sigma 70 مع مشغلي العاثيات Lambda أو مروج مدفوع ب T seven. تشير هذه المقارنات إلى أن نظام التعبير الخالي من الخلايا TX TL يمكن أن ينتج كميات مكافئة من البروتين حيث تضيف الأنظمة القائمة على T سبعة تخفيضا هائلا في التكلفة للأنظمة التجارية المماثلة.

نأمل أن تمهد هذه التقنية الطريق لتبسيط العملية الهندسية في البيولوجيا التركيبية.