الإجراء لتنمية متعدد عمق التعميم مستعرضة Endothelialized Microchannels على واحد في رقاقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير قنوات بطانية دائرية متعددة العمق على شريحة ، والتي تحاكي الهندسة ثلاثية الأبعاد في الجسم الحي ، والأوعية الدقيقة ، وتعمل تحت تدفق وفرة مستمر متحكم فيه. يتم تحقيق ذلك من خلال أول صورة تصنع الطباعة الحجرية قالبا رئيسيا بشبكة قناة صغيرة مقطعية نصف دائرية باستخدام مقاومة صور إيجابية قابلة لإعادة التدفق. تتمثل الخطوة الثانية في استخدام القالب الرئيسي لتكرار قناتين ميكرويتين من ثنائي ميثيل ثنائي ميثيل ، ومحاذاتهما وربطهما لإنشاء شبكة أسطوانية مصغرة.

بعد ذلك ، يتم وضع الخلايا البطانية للوريد السري البشري الأساسي داخل شبكة القنوات الدقيقة قبل زراعة الخلايا في ظل ظروف نضح متوسط مستمر خاضع للرقابة لفترة زمنية تتراوح بين أربعة أيام وأسبوعين. في النهاية ، يتم تطوير طبقة أحادية لخلية التقاء يشار إليها بوقوف الغشاء والنوى التي تقف تحت المجاهر على طول السطح الداخلي لشبكة القنوات الدقيقة لحساب الأوعية الدقيقة الوظيفية التي يمكن أن توفر منصة لدراسة ظاهرة الأوعية الدموية المعقدة. ومع ذلك ، فإن فحوصات الأوعية الدقيقة الفردية التقليدية مثل فحوصات هجرة الخلايا اللاصقة ، وبالتالي فحوصات التكوين ، والمقايسات الحلقية اليمنى والمتقطعة تقتصر على إعادة إنشاء الأوعية الصغيرة الفردية فيما يتعلق بالهندسة ثلاثية الأبعاد والتحكم المستمر في التدفق.

الميزة الرئيسية لتقنياتنا ، طريقة التصنيع الدقيق الحالية لدينا ، هي أنه يمكنها تقليديا تصنيع شبكة قنوات موائع دقيقة متعددة العمق تحاكي الأشكال الهندسية ثلاثية الأبعاد المعقدة للأوعية الصغيرة في الجسم الحي التي لها مقاطع عرضية مستديرة. كما يسمح بتصميم أنظمة مغناطيسية حيوية للوعائية الدقيقة ، والتي تطيع تقريبا بشكل أبطأ وتحافظ على تدفق السوائل عند المستوى المطلوب بحيث تكون مقاومة القناة الإجمالية منخفضة والتدفق الذي فقدناه يكون أكثر اتساقا في جميع أنحاء الشبكة مما يدل على أن الإجراء سيكون طالب دراسات عليا من مختبري. يبدأ هذا الإجراء بتصنيع قالب رئيسي مقاوم للضوء يتكون من قنوات صغيرة بأقطار تتراوح بين 30 ميكرون و 60 ميكرون كما هو مفصل في بروتوكول النص ، ونقل مقاومة صورة إعادة التدفق لفترة وجيزة من الثلاجة عند أربع درجات مئوية إلى الغرفة النظيفة قبل 24 ساعة من الاستخدام ، والسماح لها بالتسخين إلى درجة حرارة الغرفة.

ابدأ بتدوير طبقة مقاومة صور إعادة التدفق الإيجابي على ركيزة سيليكون نظيفة مسبقا باتباع الإجراء الوارد في بروتوكول النص. ثم قم بتعريض مقاومة الضوء للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع منقوش قبل تطوير القنوات الدقيقة المنقوشة. أخيرا ، بعد إعادة التدفق ، قم بإنشاء شبكة قناة صغيرة مقطعية نصف دائرية.

بمجرد أن يصبح القالب الرئيسي جاهزا ، قم بإعداد محلول بولي ميثيل أو PDMS بنسبة وزن 10 إلى قاعدة واحدة لعامل المعالجة واخلطه جيدا باستخدام خلاط طرد مركزي كوكبي. صب محلول PDMS على القالب الرئيسي لمقاومة الصور المعاد تدفقه. ضع PDMS المصبوب في مكان جاف لمدة 15 دقيقة إلى Degas.

استخدم غاز النيتروجين لإزالة أي فقاعات متبقية إذا لزم الأمر. تخبز PDMS في فرن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات للسماح لها بالشفاء. ثم قم بإزالة طبقة PDMS المعالجة من القالب الرئيسي.

استخدم أداة ثقب حادة لإنشاء فتحات مدخل ومخرج عن طريق إحداث ثقوب في شبكة القنوات. قم بتنظيف سطح PDMS باستخدام غاز النيتروجين. عالج طبقتين من PDMS ببلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية داخل منظف البلازما عند ضغط تشغيل 45 ميلاتو ومعدل تدفق أكسجين 3.5 قدم مكعب في الدقيقة.

ثم قم بمحاذاة أسطح نظام إدارة البرمجيات الشخصية يدويا تحت المجهر البصري. استخدم قطرة ماء إذا لزم الأمر للتحكم بشكل أفضل في المحاذاة. أخيرا ، اخبز الجهاز في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحقيق ثقافة الترابط الدائمة.

الخلايا البطانية للوريد السري البشري الأولي أو VE في وسط المزرعة مع L-glutamine المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪. عالج الجهاز ببلازما الأكسجين لمدة خمس دقائق بضغط تشغيل يبلغ 45 ميلا ومعدل تدفق الأكسجين 3.5 قدم مكعب في الدقيقة. ثم قم بتحميل الجهاز بالماء منزوع الأيونات ومعالجته بالأشعة فوق البنفسجية لمدة ثماني ساعات في غطاء السلامة الحيوية الرقائقي للتعقيم.

قبل يوم واحد من أن تصبح الخلايا جاهزة ، اغسل الجهاز بمحلول ملحي مخزن للفوسفات x أو PBS ثم قم بتغطيته بالفبرونكتين. احتضنها في الثلاجة عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بمجرد أن تتلاقى الخلايا ، قم بحصادها عن طريق شطف الخلايا أولا بمحلول ملحي مخزن في أكوام ، ثم معالجة الخلايا باستخدام التربسين EDTA بعد إضافة التربسين.

احتضان الخلايا لمدة دقيقتين إلى ست دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد اكتمال التربسين ، قم بتحييد التربسين في EDTA باستخدام محلول تحييد التريبسين. عد الخلايا ، ثم طردها قبل إعادة التقشير.

استخدام التعليق في وسط الاستزراع مع دكسترين 8٪ من دكسترين لزيادة اللزوجة المتوسطة للمساعدة في تحسين جلوس الخلية وتثبيتها بعد طلاء FI enc ENC. اغسل الجهاز بجهاز XPBS واحد ثم قم بتحميل الجهاز بوسط الاستزراع قبل احتضانه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يتم تحميل الخلايا التالية في وسط زراعة دكسترين 8٪ بتركيز ثلاثة إلى 4 ملايين خلية لكل مليلتر في الجهاز.

ضع قطرة 20 ميكرولتر من الخلايا عند مدخل واحد للجهاز وقم بإمالتها لإدخال الخلايا في قناة الموائع الدقيقة. بعد 15 إلى 20 دقيقة ، ستبدأ الخلايا في الالتصاق بالجدران الجانبية للقنوات. قم بتدوير الجهاز كل 15 دقيقة لإنشاء توزيع أكثر اتساقا للخلايا.

إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء تحميل إضافي. بعد خمس إلى ست ساعات من الثقافة الساكنة ، ستبدأ الخلايا المرفقة في الانتشار بالكامل. قم بإعداد التروية طويلة الأمد باستخدام نظام مضخة حقنة يتم التحكم فيه عن بعد مع تدفق ثابت يبلغ 10 ميكرولتر في الساعة ، ويمكن تعديل التروية للحصول على معدل تدفق أعلى ويمكن أن يستمر لفترة زمنية تتراوح بين أربعة أيام وأسبوعين.

عندما تصل الخلايا إلى التقاء داخل الجهاز ، أولا ، اغسل الجهاز باستخدام XPBS واحد لإزالة الوسيط تماما. ثم قم بتحميل الجهاز بصبغة حمراء مخففة بعد حضانة الجهاز في الظلام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسله بوسط الثقافة لوقف التلوين.

يمكن أن تسبب الحضانة الطويلة للصبغة سمية خلوية وعدم الالتصاق. ثم قم بتحميل الجهاز بصبغة زرقاء مخففة ب XPBS واحد ، احتضان في الظلام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الجهاز جيدا باستخدام XPBS واحد. افحص تلطيخ الخلية تحت المجهر البصري المقلوب.

إذا كان التلوين جيدا ، فقم بتحميل القنوات الدقيقة بوسيط تثبيت ، ثم اغمر الجهاز في وسط التثبيت وقم بتغطيته بالكامل بورق الألمنيوم. قم بتخزين الجهاز في الثلاجة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمنع الجهاز من الجفاف والتبييض أصبح الجهاز الثابت جاهزا الآن للتصوير متحد البؤر والذي يمكن إجراؤه عن طريق المجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر والمجهر الإلكتروني الماسح والفحص المجهري البصري. تم استخدامها لتوصيف مقاومة ضوء التدفق وقناة PDMS المكررة قبل وبعد تقدم إعادة التدفق.

تم تمييز الميزات الهندسية لشبكة PDMS Microchannel وعرضها هنا. تظهر المقاطع العرضية الدائرية لقوالب PDMS أبعاد القناة عند كل مستوى متفرع. تظهر النتائج أن تقنية إعادة التدفق المقاوم للصور يمكن أن تخلق شبكات قنوات متفرعة متعددة العمق في نهج أكثر ملاءمة من خلال تقنيات إعادة التدفق المقاوم للضوء وتسمح بتصميم أنظمة المحاكاة الحيوية للأوعية الدموية الدقيقة ، والتي تخضع تقريبا لقانون موراي الموضح هنا هي صور مجهرية باستخدام صبغة غشاء الخلية الفلورية باللون الأحمر والصبغة النووية للخلية باللون الأزرق.

كشفت المناظر المقطعية الدائرية أن VE يصطف على السطح الداخلي لشبكة القنوات الصغيرة الأسطوانية في مناطق متفرعة مختلفة. بسبب الأشكال الهندسية المعقدة للأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي ، فإن المراقبة في الوقت الفعلي لهذه الأوعية الصغيرة أمر صعب. توفر الشريحة المطورة القائمة على P DM S خصائص بصرية جيدة وتسمح بتصوير عالي الجودة وفي الوقت الفعلي للقنوات الدقيقة البطانية كما هو موضح في هذا الفيلم متحد البؤر لبطانة الخلية على طول شبكة القنوات الدائرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع إعادة التدفق لهذا الوضع الشامل. قم بإنشاء شبكة قناة صغيرة PDMS دائرية ، وقم بتحميل خلايا الخلايا الداخلية في الأجهزة ، وقم بإعداد وفرة الوسائط طويلة المدى. باختصار ، توفر القنوات الدقيقة المتسلسلة الداخلية المطورة على شريحة نهجا سريعا وقابلا للتكرار لإنشاء شبكات دائرية متعددة الأعماق ذات القنوات الدقيقة ، والتي تحاكي هندسة أوعية InVivo الصغيرة.

هذا الإجراء استخدام القدرات الفريدة في التصنيع الدقيق المتقدم وتقنيات الغذاء الصغير لإنشاء نموذج للأوعية الدموية الدقيقة مع التحكم المستمر في التروية على المدى الطويل ، بالإضافة إلى الجودة العالية والقدرة على التصوير في الوقت الفعلي مع زيادة فائدة القنوات الغذائية الدقيقة لبيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة وتطبيقات الهندسة الحيوية. تعد القنوات الدقيقة المتسلسلة الداخلية على رقاقة مقالا محتملا لأبحاث الأوعية الدموية الدقيقة.