الإجراء لتنمية متعدد عمق التعميم مستعرضة Endothelialized Microchannels على واحد في رقاقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير قنوات دقيقة مبطنة بخلايا بطانية ذات مقاطع عرضية دائرية وأعماق متعددة على شريحة، والتي تحاكي الهندسة ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي، وتعمل تحت تدفق تروية مستمر ومنضبط. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع قالب رئيسي باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية يحتوي على شبكة قنوات دقيقة ذات مقطع عرضي نصف دائري باستخدام مادة مقاومة للضوء إيجابية قابلة لإعادة التدفق. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام القالب الرئيسي لتكرار قناتين دقيقتين من مادة poly dimethyl siloxane، ثم محاذاتهما وربطهما لإنشاء شبكة قنوات دقيقة أسطوانية.

بعد ذلك، يتم وضع الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية الأولية داخل شبكة القنوات الدقيقة قبل زراعة الخلايا تحت ظروف تروية مستمرة ومتحكم بها للوسط الزرعي لمدة تتراوح بين أربعة أيام وأسبوعين. وفي النهاية، تتطور طبقة أحادية متصلة من الخلايا، يشار إليها بظهور الغشاء والنوى تحت المجاهر، على طول السطح الداخلي لشبكة القنوات الدقيقة، مما يتيح حساب الأوعية الدقيقة الوظيفية التي يمكن أن توفر منصة لدراسة الظواهر الوعائية المعقدة. ومع ذلك، فإن فحوصات الأوعية الدقيقة الفردية التقليدية، مثل فحوصات هجرة الخلايا، وفحوصات تكوين الأنابيب، وفحوصات الحلقة الوريدية، محدودة في إعادة إنشاء أوعية دقيقة فردية فيما يتعلق بالهندسة ثلاثية الأبعاد والتحكم في التدفق المستمر.

تتمثل الميزة الرئيسية لتقنياتنا، وتحديداً طريقة التصنيع الدقيق الحالية، في قدرتها على تصنيع شبكة قنوات مائعية دقيقة متعددة الأعماق بشكل تقليدي، بحيث تحاكي الهندسة ثلاثية الأبعاد المعقدة للأوعية الدقيقة داخل الجسم والتي تتميز بمقاطع عرضية مستديرة. كما تتيح هذه الطريقة تصميم أنظمة مغناطيسية حيوية وعائية دقيقة، والتي تلتزم تقريباً بتدفق أكثر بطئاً وتحافظ على تدفق السوائل عند المستوى المطلوب بحيث تكون المقاومة الإجمالية للقنوات منخفضة، ويكون التدفق المفقود أكثر انتظاماً عبر الشبكة؛ وسيقوم طالب دراسات عليا من مختبري بتوضيح هذا الإجراء. يبدأ هذا الإجراء بتصنيع قالب رئيسي من مادة مقاومة للضوء (photoresist) يتكون من قنوات دقيقة تتراوح أقطارها بين 30 microns و 60 microns كما هو مفصل في البروتوكول النصي؛ وباختصار، يتم نقل المادة المقاومة للضوء القابلة لإعادة التدفق من الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C إلى الغرفة النظيفة قبل 24 ساعة من الاستخدام، وتترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.

ابدأ بطلاء طبقة مقاوم الضوء الموجبة بطريقة الطلاء الدوراني على ركيزة سيليكون تم تنظيفها مسبقاً، وذلك باتباع الإجراء الموضح في البروتوكول النصي. ثم عرض مقاوم الضوء للأشعة فوق البنفسجية UV عبر قناع منقوش قبل تحميض القنوات الدقيقة المنقوشة. وأخيراً، بعد عملية إعادة التدفق، قم بإنشاء شبكة من القنوات الدقيقة ذات مقطع عرضي نصف دائري.

بمجرد تجهيز القالب الرئيسي، قم بتحضير محلول البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) بنسبة وزنية تبلغ 10 إلى 1 من المادة الأساسية إلى عامل المعالجة، وامزجه جيداً باستخدام خلاط طرد مركزي كوكبي. صب محلول PDMS فوق قالب المقاوم الضوئي الرئيسي الذي تمت إعادة صهره. ضع PDMS المصبوب في مجفف لمدة 15 دقيقة لإزالة الغازات.

استخدم غاز النيتروجين لإزالة أي فقاعات متبقية إذا لزم الأمر. قم بخبز PDMS في فرن عند درجة حرارة 60 °C لمدة ثلاث ساعات للسماح له بالتصلب. ثم قم بإزالة طبقة PDMS المتصلبة من القالب الرئيسي.

استخدم ثاقبة حادة لإنشاء فتحات دخول وخروج عن طريق ثقب شبكة القنوات. قم بتنظيف سطح PDMS باستخدام غاز النيتروجين. عالج طبقتين من PDMS ببلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية داخل منظف البلازما عند ضغط تشغيل 45 milato ومعدل تدفق أكسجين قدره 3.5 cubic feet per minute.

بعد ذلك، قم بمحاذاة أسطح الـ PDMS يدويًا تحت مجهر ضوئي. استخدم قطرة من الماء إذا لزم الأمر لتحقيق تحكم أفضل في المحاذاة. وأخيرًا، قم بخبز الجهاز في فرن عند 60 °C لمدة 30 دقيقة لتحقيق ربط دائم للزراعة.

خلايا بطانية أولية من وريد الحبل السري البشري أو VE في وسط زراعي يحتوي على L-glutamine ومكمل بـ 10% fetal bovine serum. يتم معالجة الجهاز ببلازما الأكسجين لمدة خمس دقائق بضغط تشغيلي قدره 45 milit ومعدل تدفق أكسجين يبلغ 3.5 cubic feet per minute. بعد ذلك، يتم ملء الجهاز بالماء منزوع الأيونات ومعالجته بالأشعة فوق البنفسجية لمدة ثماني ساعات داخل غطاء أمان حيوي صفيحي من أجل التعقيم.

قبل يوم واحد من جاهزية الخلايا، اغسل الجهاز بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (phosphate buffered saline) بتركيز 1x، ثم قم بطلائه بالفيبرونيكتين (fibronectin). تُحضن العينة في الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وبمجرد وصول الخلايا إلى مرحلة التلاقي، يتم حصادها عن طريق شطف الخلايا أولاً بمحلول ملحي منظم (buffered saline solution)، ثم معالجة الخلايا باستخدام trypsin EDTA بعد إضافة التريبسين (trypsin).

يتم تحضين الخلايا لمدة تتراوح من دقيقتين إلى ست دقائق عند 37 °C. وبعد اكتمال عملية الهضم بالتريبسين، يتم تحييد trypsin EDTA باستخدام محلول تحييد التريبسين. ثم تُعد الخلايا وتُفصل بجهاز الطرد المركزي قبل إعادة تعليقها.

يُستخدم التعليق في وسط استزراع يحتوي على 8%dextrin لزيادة لزوجة الوسط للمساعدة في تحقيق تثبيت والتصاق أفضل للخلايا بعد عملية طلاء FI enc ENC. اغسل الجهاز باستخدام XPBS واحد، ثم املأ الجهاز بوسط الاستزراع قبل التحضين عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يتم تحميل الخلايا في وسط استزراع يحتوي على 8%Dextrin بتركيز يتراوح من 3 إلى 4 مليون خلية لكل milliliter داخل الجهاز.

ضع قطرة بحجم 20 µL من الخلايا عند إحدى فتحات الجهاز، ثم قم بإمالته لإدخال الخلايا إلى القناة الموائع ميكروية (microfluidic channel). بعد 15 إلى 20 دقيقة، ستبدأ الخلايا في الالتصاق بالجدران الجانبية للقنوات. قم بتدوير الجهاز كل 15 دقيقة لتحقيق توزيع أكثر تجانساً للخلايا.

يمكن إجراء تحميل إضافي إذا لزم الأمر. وبعد مرور خمس إلى ست ساعات من الزراعة الساكنة، ستبدأ الخلايا الملتصقة في الانتشار بشكل كامل. قم بإعداد التروية طويلة المدى باستخدام نظام مضخة حقنة يتم التحكم فيها عن بُعد بتدفق ثابت قدره 10 µL في الساعة، ويمكن تعديل التروية لمعدل تدفق أعلى ويمكن أن تستمر لفترة زمنية تتراوح بين أربعة أيام وأسبوعين.

عندما تصل الخلايا إلى مرحلة الالتحام داخل الجهاز، يتم أولاً غسل الجهاز باستخدام XPBS واحد لإزالة الوسط تماماً. بعد ذلك، يتم تحميل الجهاز بالصبغة الحمراء المخففة بعد تحضين الجهاز في الظلام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم يُغسل بوسط الزرع لإيقاف عملية التلوين.

يمكن أن يؤدي التحضين الطويل للصبغة إلى حدوث سمية خلوية وفقدان الالتصاق. بعد ذلك، قم بتحميل الجهاز بالصبغة الزرقاء المخففة بـ one XPBS، ثم حضنها في الظلام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الجهاز جيداً بـ one XPBS. افحص صبغ الخلايا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.

إذا كانت الصبغة جيدة، قم بتعبئة القنوات الدقيقة بوسط التثبيت، ثم اغمر الجهاز في وسط التثبيت وغطه بالكامل بورق الألومنيوم. يُحفظ الجهاز في الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C لمنع جفاف الجهاز وتبييضه؛ وبذلك يصبح الجهاز المثبت جاهزاً للتصوير البؤري، والذي يمكن إجراؤه بواسطة المجهر البؤري الماسح بالليزر، والمجهر الإلكتروني الماسح، والمجهر الضوئي. وقد استُخدمت هذه التقنيات لتوصيف مادة مقاومة الضوء بعد عملية إعادة التدفق وقناة PDMS المنسوخة قبل وبعد تقدم عملية إعادة التدفق.

تم توصيف الميزات الهندسية لشبكة القنوات الدقيقة المصنوعة من PDMS وعرضها هنا. تظهر المقاطع العرضية الدائرية لقوالب PDMS أبعاد القنوات عند كل مستوى من مستويات التفرع. وتظهر النتائج أن تقنية إعادة تدفق المقاوم الضوئي يمكن أن تنشئ شبكات قنوات متفرعة متعددة الأعماق بأسلوب أكثر ملاءمة من خلال تقنيات إعادة تدفق المقاوم الضوئي، وتسمح بتصميم أنظمة محاكية للأوعية الدموية الدقيقة تتبع تقريبًا قانون ماري (Murray's law) الموضح هنا؛ حيث تظهر الصور المجهرية استخدام صبغة غشاء الخلية الفلورية باللون الأحمر وصبغة نواة الخلية باللون الأزرق.

كشفت المقاطع العرضية الدائرية أن الخلايا البطانية (VE) تبطن السطح الداخلي لشبكة من القنوات الدقيقة الأسطوانية في مناطق تفرع مختلفة. ونظراً للتعقيدات الهندسية للأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي، يصعب إجراء مراقبة في الوقت الفعلي لهذه الأوعية الصغيرة. وتوفر الشريحة المطورة القائمة على PDMS خصائص بصرية جيدة وتسمح بتصوير عالي الجودة وفي الوقت الفعلي للقنوات الدقيقة المبطنة بالخلايا البطانية، كما يظهر في هذا المقطع التصويري confocal لتبطين الخلايا على طول شبكة القنوات الدائرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع التدفق العكسي لهذا النمط الكتلي. وإنشاء شبكة قنوات دقيقة من مادة PDMS ذات مقطع عرضي دائري، وتحميل الخلايا البطانية في الأجهزة، وإعداد تروية إعلامية طويلة المدى. وباختصار، توفر القنوات الدقيقة المتسلسلة للخلايا البطانية المطورة على شريحة نهجاً سريعاً وقابلاً للتكرار لإنشاء شبكات قنوات دقيقة متعددة الأعماق وذات مقطع عرضي دائري، والتي تحاكي هندسة الأوعية الدقيقة في الجسم الحي (InVivo).

يوضح هذا الإجراء استخدام القدرات الفريدة في التصنيع الدقيق المتقدم وتقنيات الموائع الدقيقة لإنشاء نموذج للأوعية الدموية الدقيقة مع تحكم في التروية المستمرة طويلة المدى، بالإضافة إلى قدرة تصوير عالية الجودة وفي الوقت الفعلي مع تزايد فائدة قنوات الموائع الدقيقة في تطبيقات بيولوجيا الخلية، وهندسة الأنسجة، والتطبيقات الحيوية الهندسية. وتعد القنوات الدقيقة المتسلسلة المبطنة بالخلايا المبطنة على شريحة اختباراً محتملاً لأبحاث الأوعية الدموية الدقيقة.