فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتوصيف مضادات الفيروسات الجزيئية الصغيرة ضد فيروس اللسان الأزرق أو BTV باستخدام مقايسة بقاء الخلية القائمة على CPE. يتم تحقيق ذلك عن طريق فحص مكتبة من المركبات المضادة للفيروسات أولا باستخدام تأثير الاعتلال الخلوي أو الفحص القائم على CPE مع كاشف توهج عيار الخلية. بعد ذلك ، يتم تأكيد الفعالية المضادة للفيروسات ويتم تقييم السمية الخلوية لمضادات الفيروسات المختارة باستخدام مقايسة استجابة الجرعة.

أخيرا ، يتم إجراء اختبار وقت الإضافة لتحديد مرحلة دورة الحياة الفيروسية المحتملة لمضادات الفيروسات المختارة مما يؤدي إلى آليات العمل المحتملة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر مضادات فيروسات جديدة مع CIE مضاد للفيروسات قوي وسمية خلوية منخفضة بناء على مقايسة استجابة الجرعة ووقت مقايسة الإضافة. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل اختبار TCI D 50 في اختبار البلاك هي أن هذه التقنية توفر حساسة وقوية وعالية الإنجابية في الطريقة القابلة للقياس لفحص وتصنيف برامج مكافحة الفيروسات ضد فيروسات معينة ، بما في ذلك فيروس الغلوتين ، الذي يحفز CP القابل للقياس في خلايا الخلايا المصابة استعدادا للفحص القائم على CPE من خلايا BSR المحفوظة في DMEM المكمل باستخدام موزع تحديد التدفق الدقيق ل بذرة 20 ميكرولترا من الخلايا في 5,000 خلية لكل بئر في 384.

حسنا ، قم باحتضان الخلايا لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات للسماح لها بالالتصاق الكامل باللوحة ، ثم أضف مركبات مضادة للفيروسات بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار لكل بئر وتخلط تماما. استخدم وسيط الفحص لتخفيف البلاك المنقى والنشر BTV إلى العيار المطلوب وأضف خمسة ميكرولترات من BTV مع بيان وزارة الداخلية إلى كل بئر للتحكم. حسنا ، أضف خمسة ميكرولترات من وسط الفحص ، ضع صندوقا مبللا يحتوي على لوحة الفحص في الحاضنة واحتضن الخلايا المصابة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 80٪ إلى 95٪ رطوبة.

ثم أخرج لوحة الفحص من الحاضنة ، ثم قم بإذابة الثلج وتوازن المخزن المؤقت CTG والركيزة CTG المجففة بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تكوين محلول كاشف CTG المتجانس عن طريق خلط ركيزة الإنزيم المجفف بالتجميد والكشف العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد موازنة لوحات الفحص مع درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، استخدم موزعا لإضافة 25 ميكرولترا من كواشف CTG إلى كل بئر حاضنة لمدة 15 دقيقة في الظلام قبل استخدام قارئ متعدد الأوضاع مع وقت تكامل يبلغ 0.1 ثانية لقياس إشارات الإنارة بذرة 5 ، 000 خلية BSR لكل بئر في 384 صفيحة دقيقة لمقايسة استجابة الجرعة باستخدام 20 ميكرولترا لمقايسة الفعالية المضادة للفيروسات و 25 ميكرولترا ل مقايسة السمية الخلوية.

بعد حضانة من ساعتين إلى ثلاث ساعات ، خصص ثمانية مكررات لكل تركيز من المركب لكل اختبار كما هو موضح هنا. قم بتعيين العمود الأول كعنصر تحكم إيجابي دون إضافة مركب أو فيروس والعمود الأخير كعنصر تحكم سلبي عن طريق إضافة الفيروس فقط لفحص الفعالية المضادة للفيروسات ، وتخفيف المركبات إلى 50 ميكرومولار في وسط الفحص وإلى العمود الثاني ، أضف 20 ميكرولتر لكل بئر. باستخدام ماصة شبه أوتوماتيكية ثماني القنوات.

امزج المركب خمس مرات بتركيز 25 ميكرومولار. بعد ذلك ، انقل 20 ميكرولترا من الخليط في العمود الثاني إلى العمود الثالث واخلطه جيدا ، مما ينتج عنه تركيز 12.5 ميكرومولار. كرر هذا مرتين.

التخفيف التسلسلي حتى العمود 11 ، والذي سيكون له تركيز نهائي يبلغ 0.04 ميكرومولار. ثم أضف خمسة ميكرولترات من المتوسط إلى العمود الأول كعنصر تحكم إيجابي فقط للخلية وخمسة ميكرولترات لكل بئر من BTV إلى العمود 12 كعدوى BTV فقط. يضيف التحكم السلبي خمسة ميكرولترات لكل بئر من BTV من العمود الثاني إلى العمود 11 لمقايسة السمية الخلوية ، وتخفيف المركب إلى تركيز أولي يبلغ 200 ميكرومولار.

أضف 25 ميكرولترا لكل بئر من المركب إلى العمود الثاني واخلطه خمس مرات ليصل التركيز إلى 100 ميكرومولار. قم بإجراء التخفيف المزدوج عن طريق نقل 25 ميكرولتر من العمود الثاني إلى العمود الثالث المجاور والاستمرار في العمود 12. بعد خلط العمود 12 ، قم بالشفط والتخلص من 25 ميكرولترا من الخليط.

العمود الأول هو التحكم الوحيد في الخلية لكل من فحوصات السمية المضادة للفيروسات والسمية الخلوية. ضع صندوقا مبللا يحتوي على لوحة الفحص في الحاضنة لمدة 72 ساعة وأخرج الطبق بعد ذلك. ثم استخدم مجموعة التصوير المقطعي المحوسب G لقياس صلاحية الخلية.

استخدم برنامجا للإحصاء الحيوي والرسم لحساب متوسط القيمة وتغيرات معامل الانحراف المعياري والنسبة المئوية لصلاحية الخلية لكل تركيز مركب وإجراء تحليل الانحدار غير الخطي لتحديد EC 50 و CC 50 لكل مركب. استعد لوقت الإضافة أو اختبار TOA عن طريق بذر 5,000 خلية لكل بئر في 15 ميكرولترا في العمود الأول إلى 24 من 384. صفيحة دقيقة جيدا لكل مركب.

استخدم جميع الأعمدة ال 24 مع ثماني نسخ مكررة لكل نقطة زمنية. قم بتعيين العمود الأول كعنصر تحكم في الخلايا فقط عن طريق إضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من العمود 24 لعلامة متوسط الفحص كعدوى BTV فقط. التحكم السلبي عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات لكل بئر من متوسط الفحص وخمسة ميكرولتر لكل بئر من الفيروس بوزارة الداخلية 0.01.

في الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر لكل بئر ، حدد الأعمدة ذات الأرقام الزوجية من العمود الثاني إلى 22 كأعمدة تقييم الفعالية المضادة للفيروسات في ساعات مختلفة بعد الإصابة أو HPI في هذه الأعمدة ، وإصابة الخلايا بخمسة ميكرولترات لكل بئر من BTV عند وزارة الداخلية 0.01 في HPI مختلف ، أضف أيضا خمسة ميكرولترات لكل بئر من المركب المخفف بحجم نهائي قدره 25 ميكرولتر لكل بئر للناقص المشار إليه اثنين و ناقص HPI واحد. أضف المركب إلى خلايا BSR قبل الإصابة ب BTV لصفر HPI أضف المركب و BTV إلى المزرعة في وقت واحد. في موازاة ذلك ، قم بتعيين الأعمدة المرقمة الفردية من ثلاثة إلى 23 كعناصر تحكم مركبة فقط تتوافق مع النقاط الزمنية المختلفة في هذه الأعمدة.

أضف خمسة ميكرولترات لكل بئر من وسط الفحص وخمسة ميكرولترات لكل بئر من المركب المخفف في حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر لكل بئر. بعد احتضان الخلايا إلى 72 HPI في الحاضنة ، أخرج لوحة الفحص واستخدم مجموعة توهج عيار الخلية لتحديد صلاحية الخلية. أخيرا ، استخدم برنامجا يعالج الإشارات المضيئة التي تم الحصول عليها عبر قارئ متعدد الأوضاع لتحديد القيمة المتوسطة.

S-T-D-E-V CV والنسبة المئوية لصلاحية خلايا الحماية لكل علاج باستخدام مقايسة CPE لتحديد كمية A TP الخلوي في الخلايا الحية ، حددنا سابقا العديد من مركبات الرصاص الواعدة ذات الفعالية القوية المضادة للفيروسات والسمية المنخفضة والانتقائية العالية العالية. على سبيل المثال ، تم تحديد المركب 0 5 2 على أن يحتوي على EC 50 من 0.27 زائد أو ناقص 0.12 ميكرومولار و CC 50 من 82.69 ميكرومولار وكلاهما يظهر منحنيات تراجعية نموذجية. في إطار تحليل تحليلات الانحدار غير الخطي ، تم تحديد SI 50 من C 0 5 2 أن 306 بناء على قيمه EC 50 و CC 50 ، فإن الفعالية المضادة للفيروسات ذات النطاق المولي النانوي ، والسمية المنخفضة ، وبالتالي فإن SI 50 المرتفع يشير إلى أن C 0 5 2 قد يكون مضادا قويا وانتقائيا ضد BTV كما هو موضح هنا ، أصيبت الخلايا ب BTV عند وزارة الداخلية 0.01 في وجود 10 تركيزات مختلفة من C 0 5 2 وتم تحديد صلاحية الخلية عند 72 HPI.

باستخدام مجموعة CTG ، تمثل كل نقطة بيانات الوسائل و SD من خمس نسخ مكررة. تم استخدام اختبار TOA لتحديد المراحل المحتملة لدورة حياة الفيروس التي تستهدفها المركبات. عندما تمت إضافة C 0 5 2 قبل ساعة أو ساعتين من الإصابة ب BTV ، ظلت الفعالية المضادة للفيروسات على مقياس المولار النانوي كما هو موضح في هذا الشكل.

بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت صلاحية الخلية بشكل أكبر عند إضافة C 0 5 2 عند 32 و 48 HPI ، مما يشير إلى أن C 0 5 2 قد يعمل بعد المرحلة المبكرة من دورة حياة الفيروس ، مثل دخول الفيروس. نظرا لأن الدورة الأولى من تكاثر فيروس BTV عادة ما تكتمل في الخلايا المصابة ضمن 24 HPI ، فقد أشارت نتائجنا إلى أن C 0 5 2 قد يعمل في المراحل المتأخرة من دورة حياة فيروس BTV ، مثل تكاثر الفيروس ، والتعبئة ، والنضج ، والخروج. وفي الوقت نفسه ، من الممكن أيضا أن يعمل C 0 5 2 على الآلية الخلوية المضيفة التي تعمل خلال المراحل اللاحقة من دورة الحياة الفيروسية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام أفضل مقال CPE لتحديد وتصنيف مضاد الفيروسات المحتمل ضد الفيروسات التي تحفز CPE بعد العدوى القابلة للقياس.