بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

يستخدم هذا الإجراء أنسجة شبكية الفأر لتوضيح كيفية تثبيت الأنسجة العصبية الحساسة للحفاظ على السلامة الهيكلية. خلال عدة خطوات من التلوين الكيميائي المناعي ، قم أولا بنواة العين ، وإزالة القرنية وفصل شبكية العين عن الصلبة. قم بعمل شقوق في كوب العين الشبكي لتسطيح الأنسجة.

ثم قم بتوصيل شبكية العين بغشاء مسربي حلقي باستخدام نقل الشفط دون التلاعب المباشر للحفاظ على سلامة الأنسجة. الآن انقل الحلقة إلى لوحة متعددة الآبار للتلطيخ. تظهر نتائجنا أنه يمكن استخدام هذه التقنية بشكل فعال في الأنسجة الحية وتوفر ركيزة فائقة لتصوير البروتينات المشبكية مقارنة بالمعادن الموجودة في التعامل مع شبكية العين التشريح.

تسمح هذه التقنيات بنقل الأنسجة الحساسة بأقل قدر من التلاعب الجسدي. سيؤدي ذلك إلى تقليل فرصة التشويه والتلف. خطرت لنا هذه الفكرة لأول مرة عندما احتجنا إلى التسجيل من الأنسجة المسطحة المثبتة في RD فأر واحد ، وهو نموذج لتنكس الشبكية ، وشبكية العين هذه رقيقة للغاية وهشة بسبب فقدان الخلايا الواسع النطاق الناجم عن الطفرة رئيس.

سينضم إلي باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا في توضيح الإجراء. أولا ، قم بنواة عيون الفأر المخدر ونقل العينين إلى محلول رنين مخزن أكوام مؤكسجة. لإزالة القرنية ، أمسك العين عند الأطراف بالملقط ، ثم قم بقطع مسار دائري على طول أورا سيراتا.

اسحب العدسة للخارج باستخدام ملقط لحقن البلعة والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. استخدم ملقط الحواف المخلوطة لإزالة أكبر قدر ممكن من الجسم الزجاجي. الآن قم بتثبيت كوب العين عن طريق إمساك الصلبة بإحكام باستخدام ملقط.

ضع مجموعة ثانية من الملقط بين شبكية العين وكوب العين. حرك الملقط ببطء حول المحيط. قطع العصب البصري بين شبكية العين وكوب العين ، وإزالة كوب العين بالمقص.

قم بعمل شقوق من محيط الشبكية وصولا إلى العصب البصري. بدلا من ذلك ، لاستخدام شبكية العين بأكملها ، قم بعمل شقوق من المحيط في منتصف الطريق إلى العصب البصري لتقصير الحامل. قم بإزالة الجزء الزائد بمخرطة.

ثم قم بتلميع الأسطح الخشنة بورق صنفرة ناعم. قم بإزالة القدمين من أسفل الحلقة. اقطع الطرف الضيق للماصة البلاستيكية.

ثم انقل الأنسجة مع بعض المحلول إلى الغشاء. قم بإزالة المحلول تدريجيا أثناء نشر شبكية العين وافتح الأنسجة. الآن قم بتوصيل شبكية العين بالغشاء بحيث تكون الخلايا العقدية متجهة لأعلى.

اقطع طرف عقد حقنة سعة مليلتر واحد وضعها مباشرة تحت الأنسجة. اسحب المكبس للخلف إلى حجم حوالي 0.3 مل لربط الأنسجة داخل الغشاء جسديا. اسحب بعض الماصات الشعرية الشعرية من سيليكات البورو باستخدام مقاومة تبلغ ميجا واحدة تقريبا.

ثم اكسر طرف كل ماصة رقعة برفق. بعد ذلك ، أضف 0.3 ميكرولتر من محلول وصمة عار مخزون selectin إلى 10 ميكرولتر من محلول الرنين المخزن في أكوام. الآن ضع الغشاء في غرفة التسجيل المليئة بمحلول رنين مخزن بأكوام مؤكسجة دافئة.

ضع الماصة المحتوية على صبغة مقابل الغشاء المحدد الداخلي باستخدام مناور ميكروم. قم بزيادة تقدم الماصة لاختراق الغشاء المحدد الداخلي. ثم قم بحقن محلول التلوين في المواقع المستهدفة الفردية أو المتعددة.

اترك الآن 10 دقائق حتى تتعافى الأنسجة من الحقن أثناء مشاهدتها تحت إضاءة التألق epi. إذا رغبت في ذلك ، انقل الملحق إلى طبق ثقافة زجاجي القاع ، وضعه جانب شبكية العين لأسفل. أضف قطرة واحدة من محلول الكومة للحفاظ على رطوبة العينة.

أيضا ، ضع ثلاث بقع من الشحوم المفرغة حول محيط الحلقة البلاستيكية لتأمين الملحق بإحكام في طبق الثقافة. انقل الطبق إلى مرحلة المجهر بعد التثبيت ، واغمر الغشاء في محاليل التدرج السكروز. استئصال الغشاء من حلقة الإدخال البلاستيكية.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام مناديل كيم المبللة وضعها على البارم بحيث تكون شبكية العين متجهة لأعلى. انقل الطفيلي مع الأنسجة إلى غرفة ناظم البرد وأضف قطرة من وسط OCT. استخدم جهاز الفريزر السريع لتسريع التجميد.

افصل العينة المجمدة واقلبها. الآن اقطع OCT المجمدة الزائدة. اترك ما يقرب من ملليمترين حول العينة من ثلاث جوانب ومليمترات من الجانب ، والتي سيتم توصيلها بالحامل.

قم بتغطية جانب الشبكية المكشوف بقطرة من OCT مع ترك المنطقة المرفقة خالية. تجميد الغشاء الذي يحتوي على أنسجة الشبكية. ضع قطرة من OCT على حلقة حامل بارد.

أدخل العينة المجمدة على الفور في القطرة. قم بقص أقسام من 10 إلى 20 ميكرون عند سالب 19 درجة مئوية وضعها على شرائح التصاق بوليسين دافئة. ضع الشرائح مع الأقسام المرفقة على منصة تسخين 41 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في الظلام.

ثم قم بتخزين العينات عند سالب 20 درجة مئوية. توضح هذه التجربة توصيفا سريعا وبسيطا لالأوعية الدموية في الشبكية كشبكة متقنة من الأوعية الدموية التي تمتد عبر طبقات متعددة من الشبكية. من خلال الجمع بين تحميل البلعة من iso selectin مع وضع العلامات على غمر sulfa rumine ، يمكن تصور الأنسجة الحية ومسحها ضوئيا على الفور تقريبا في شبكية العين ، ويمكن تمييز الأوعية الدموية من الطبقة السطحية إلى الطبقة العميقة.

على عكس الانتشار الجيد نسبيا ، فإن SRH هو selectin لا يتخلل جيدا عبر الغشاء المحدد الداخلي. هناك العديد من مزايا التثبيت باستخدام الكربيميد على التثبيت التقليدي باستخدام بارا فورمالديهايد عند وضع العلامات على البروتينات المشبكية ، على سبيل المثال ، بعد فترة قصيرة من التثبيت باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي للكربيميد للعلامة المتشابكة. كان ل PSD 95 في IPL مظهر نقطي مشرق يتوافق مع التمييز بين نقاط الاشتباك العصبي الفردية.

في المقابل ، عند استخدام مثبت الألدهيد الطفيلي التقليدي ، يكون تحديد المكونات المشبكية أقل وضوحا. تم الحصول على نتائج مماثلة في أقسام ناجمد الشبكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تركيب نسيج حساس على هذا الغشاء وكيفية تطبيق تلطيخ cyto الكيميائي على إعداد سيد واحد.

سيستغرق الأمر 15 دقيقة لتوصيل شبكية العين بالفلتر.