بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية
December 13th, 2013
البروتوكول الموصوف هنا مخصص للتقييم الهيكلي لإعداد الشبكية الكاملة. يتضمن ذلك أوصافا لتشريح الأنسجة ، والتركيب على غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين مجفف بالماء (PTFE) ، وتحميل البلعة بعلامات الفلورسنت ، ومقارنة التثبيت مع الكربوديميد وبارافورمالديهايد للتحليل الكيميائي المناعي للمكونات الخلوية والمشبكية.
يستخدم هذا الإجراء أنسجة شبكية الفأر لتوضيح كيفية تثبيت الأنسجة العصبية الحساسة للحفاظ على السلامة الهيكلية. خلال عدة خطوات من التلوين الكيميائي المناعي ، قم أولا بنواة العين ، وإزالة القرنية وفصل شبكية العين عن الصلبة. قم بعمل شقوق في كوب العين الشبكي لتسطيح الأنسجة.
ثم قم بتوصيل شبكية العين بغشاء مسربي حلقي باستخدام نقل الشفط دون التلاعب المباشر للحفاظ على سلامة الأنسجة. الآن انقل الحلقة إلى لوحة متعددة الآبار للتلطيخ. تظهر نتائجنا أنه يمكن استخدام هذه التقنية بشكل فعال في الأنسجة الحية وتوفر ركيزة فائقة لتصوير البروتينات المشبكية مقارنة بالمعادن الموجودة في التعامل مع شبكية العين التشريح.
تسمح هذه التقنيات بنقل الأنسجة الحساسة بأقل قدر من التلاعب الجسدي. سيؤدي ذلك إلى تقليل فرصة التشويه والتلف. خطرت لنا هذه الفكرة لأول مرة عندما احتجنا إلى التسجيل من الأنسجة المسطحة المثبتة في RD فأر واحد ، وهو نموذج لتنكس الشبكية ، وشبكية العين هذه رقيقة للغاية وهشة بسبب فقدان الخلايا الواسع النطاق الناجم عن الطفرة رئيس.
سينضم إلي باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا في توضيح الإجراء. أولا ، قم بنواة عيون الفأر المخدر ونقل العينين إلى محلول رنين مخزن أكوام مؤكسجة. لإزالة القرنية ، أمسك العين عند الأطراف بالملقط ، ثم قم بقطع مسار دائري على طول أورا سيراتا.
اسحب العدسة للخارج باستخدام ملقط لحقن البلعة والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. استخدم ملقط الحواف المخلوطة لإزالة أكبر قدر ممكن من الجسم الزجاجي. الآن قم بتثبيت كوب العين عن طريق إمساك الصلبة بإحكام باستخدام ملقط.
ضع مجموعة ثانية من الملقط بين شبكية العين وكوب العين. حرك الملقط ببطء حول المحيط. قطع العصب البصري بين شبكية العين وكوب العين ، وإزالة كوب العين بالمقص.
قم بعمل شقوق من محيط الشبكية وصولا إلى العصب البصري. بدلا من ذلك ، لاستخدام شبكية العين بأكملها ، قم بعمل شقوق من المحيط في منتصف الطريق إلى العصب البصري لتقصير الحامل. قم بإزالة الجزء الزائد بمخرطة.
ثم قم بتلميع الأسطح الخشنة بورق صنفرة ناعم. قم بإزالة القدمين من أسفل الحلقة. اقطع الطرف الضيق للماصة البلاستيكية.
ثم انقل الأنسجة مع بعض المحلول إلى الغشاء. قم بإزالة المحلول تدريجيا أثناء نشر شبكية العين وافتح الأنسجة. الآن قم بتوصيل شبكية العين بالغشاء بحيث تكون الخلايا العقدية متجهة لأعلى.
اقطع طرف عقد حقنة سعة مليلتر واحد وضعها مباشرة تحت الأنسجة. اسحب المكبس للخلف إلى حجم حوالي 0.3 مل لربط الأنسجة داخل الغشاء جسديا. اسحب بعض الماصات الشعرية الشعرية من سيليكات البورو باستخدام مقاومة تبلغ ميجا واحدة تقريبا.
ثم اكسر طرف كل ماصة رقعة برفق. بعد ذلك ، أضف 0.3 ميكرولتر من محلول وصمة عار مخزون selectin إلى 10 ميكرولتر من محلول الرنين المخزن في أكوام. الآن ضع الغشاء في غرفة التسجيل المليئة بمحلول رنين مخزن بأكوام مؤكسجة دافئة.
ضع الماصة المحتوية على صبغة مقابل الغشاء المحدد الداخلي باستخدام مناور ميكروم. قم بزيادة تقدم الماصة لاختراق الغشاء المحدد الداخلي. ثم قم بحقن محلول التلوين في المواقع المستهدفة الفردية أو المتعددة.
اترك الآن 10 دقائق حتى تتعافى الأنسجة من الحقن أثناء مشاهدتها تحت إضاءة التألق epi. إذا رغبت في ذلك ، انقل الملحق إلى طبق ثقافة زجاجي القاع ، وضعه جانب شبكية العين لأسفل. أضف قطرة واحدة من محلول الكومة للحفاظ على رطوبة العينة.
أيضا ، ضع ثلاث بقع من الشحوم المفرغة حول محيط الحلقة البلاستيكية لتأمين الملحق بإحكام في طبق الثقافة. انقل الطبق إلى مرحلة المجهر بعد التثبيت ، واغمر الغشاء في محاليل التدرج السكروز. استئصال الغشاء من حلقة الإدخال البلاستيكية.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام مناديل كيم المبللة وضعها على البارم بحيث تكون شبكية العين متجهة لأعلى. انقل الطفيلي مع الأنسجة إلى غرفة ناظم البرد وأضف قطرة من وسط OCT. استخدم جهاز الفريزر السريع لتسريع التجميد.
افصل العينة المجمدة واقلبها. الآن اقطع OCT المجمدة الزائدة. اترك ما يقرب من ملليمترين حول العينة من ثلاث جوانب ومليمترات من الجانب ، والتي سيتم توصيلها بالحامل.
قم بتغطية جانب الشبكية المكشوف بقطرة من OCT مع ترك المنطقة المرفقة خالية. تجميد الغشاء الذي يحتوي على أنسجة الشبكية. ضع قطرة من OCT على حلقة حامل بارد.
أدخل العينة المجمدة على الفور في القطرة. قم بقص أقسام من 10 إلى 20 ميكرون عند سالب 19 درجة مئوية وضعها على شرائح التصاق بوليسين دافئة. ضع الشرائح مع الأقسام المرفقة على منصة تسخين 41 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في الظلام.
ثم قم بتخزين العينات عند سالب 20 درجة مئوية. توضح هذه التجربة توصيفا سريعا وبسيطا لالأوعية الدموية في الشبكية كشبكة متقنة من الأوعية الدموية التي تمتد عبر طبقات متعددة من الشبكية. من خلال الجمع بين تحميل البلعة من iso selectin مع وضع العلامات على غمر sulfa rumine ، يمكن تصور الأنسجة الحية ومسحها ضوئيا على الفور تقريبا في شبكية العين ، ويمكن تمييز الأوعية الدموية من الطبقة السطحية إلى الطبقة العميقة.
على عكس الانتشار الجيد نسبيا ، فإن SRH هو selectin لا يتخلل جيدا عبر الغشاء المحدد الداخلي. هناك العديد من مزايا التثبيت باستخدام الكربيميد على التثبيت التقليدي باستخدام بارا فورمالديهايد عند وضع العلامات على البروتينات المشبكية ، على سبيل المثال ، بعد فترة قصيرة من التثبيت باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي للكربيميد للعلامة المتشابكة. كان ل PSD 95 في IPL مظهر نقطي مشرق يتوافق مع التمييز بين نقاط الاشتباك العصبي الفردية.
في المقابل ، عند استخدام مثبت الألدهيد الطفيلي التقليدي ، يكون تحديد المكونات المشبكية أقل وضوحا. تم الحصول على نتائج مماثلة في أقسام ناجمد الشبكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تركيب نسيج حساس على هذا الغشاء وكيفية تطبيق تلطيخ cyto الكيميائي على إعداد سيد واحد.
سيستغرق الأمر 15 دقيقة لتوصيل شبكية العين بالفلتر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتقييم البنية الهيكلية لمستحضرات شبكية العين كاملة باستخدام أنسجة شبكية العين للفأر. ويوضح بالتفصيل عمليات التشريح، والتركيب، والتلطيخ للحفاظ على سلامة الأنسجة للتصوير البروتينات المشبكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء المناعية المجهرية
- بيولوجيا الشبكية
الخلفية
- السلامة الهيكلية للأنسجة العصبية ضرورية للحصول على تصوير دقيق.
- قد تؤثر الطرق الحالية على جودة الأنسجة أثناء التشريح.
- تعزز العلامات الفلورية تصور المكونات الخلوية.
- مقارنة طرق التثبيت ضرورية للحصول على أفضل النتائج.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول موثوق لتحضير أنسجة الشبكية.
- لتقييم فعالية طرق التثبيت المختلفة.
- لتحسين تقنيات التصوير للبروتينات المشبكية.
الطرق المستخدمة
- نوى العين وإزالة القرنية.
- فصل الشبكية عن الصلبة وتسطيح الأنسجة.
- إرفاق الشبكية بغشاء باستخدام النقل بالشفط.
- تلطيخ وتصوير البروتينات المشبكية.
النتائج الرئيسية
- يحافظ البروتوكول بشكل فعال على سلامة الأنسجة.
- توفر العلامات الفلورية تصورًا أفضل.
- يؤدي مقارنة طرق التثبيت إلى رؤى هامة.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على تصوير الأنسجة الحية.
الاستنتاجات
- يعزز الطريقة الموضحة التقييم البنيوي لأنسجة الشبكية.
- يوفر ركازًا موثوقًا لتصوير البروتينات المشبكية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى أنواع أخرى من الأنسجة العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical challenge in neuroscience drug discovery: preserving the structural integrity of fragile neural tissue during immunohistochemical processing. By enabling reliable visualization of synaptic proteins and vascular networks in retinal wholemounts, it supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease models. The method enhances predictive confidence in preclinical assays by minimizing tissue distortion artifacts that could confound target engagement readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic protein localization and retinal vasculature architecture in disease models.
- Operational Value: Provides a stabilized platform for consistent antibody staining and fluorescent marker delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of synaptic marker puncta and vascular networks.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats for standardized immunostaining and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from live tissue imaging to fixed tissue analysis for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in histological preparations, improving reproducibility across preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing in neural tissue to preclinical validation of modulator effects on synaptic integrity and vascular function.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by enabling clear visualization of synaptic protein distribution and neurovascular unit integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immunofluorescence outputs suitable for high-content analysis of compound effects on retinal structure.
- Analytics: Generates puncta density and vascular network metrics that support comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of retinal synaptic and vascular biomarkers with preclinical disease progression and treatment response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue stabilization platform applicable to multiple neural tissue types and staining protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through unambiguous synaptic and vascular visualization in fragile neural tissue.
- Operational Value: Improves assay reproducibility and reduces failure rates in immunohistochemical processing of delicate preparations.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives from tissue damage during preparation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective compounds based on reliable structural and functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and tissue handling techniques.
- Depends on access to ring-supported hydrophilized PTFE membranes and suction transfer apparatus.
- Necessitates standardization of fixation, staining, and imaging protocols across research teams.
- Involves adaptation considerations for varying tissue thickness and fragility across neural models.
- Practical limitations include the need for specialized equipment to prepare and maintain the supporting membrane system.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:50
Mounting onto Hydrophilized PTFE Membrane Insert
3:43
Bolus Injection of Isolectin Alexa 488
5:05
Vertical Sectioning of Membrane-mounted Tissue
6:45
Results: Hydrophilized PTFE Membrane for Wholemount Retina
1:38
Dissection of Wholemount Retina
8:04
Conclusion
