بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

تستخدم هذه الطريقة أنسجة شبكية الفأر لتوضيح كيفية تثبيت الأنسجة العصبية الرقيقة للحفاظ على سلامتها البنيوية. خلال عدة خطوات من الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي، يتم أولاً تفريغ محتويات العين، وإزالة القرنية وفصل الشبكية عن الصلبة. يتم إجراء شقوق في كأس العين الشبكي لتسطيح النسيج.

بعد ذلك، يتم تثبيت الشبكية على غشاء مدعم بحلقة باستخدام تقنية النقل بالشفط دون تلاعب مباشر للحفاظ على سلامة النسيج. الآن، انقل الحلقة إلى طبق متعدد الآبار من أجل التلوين. تُظهر نتائجنا أن هذه التقنية يمكن استخدامها بفعالية في الأنسجة الحية وتوفر ركيزة فائقة لتصوير البروتينات المشبكية مقارنة بطرق التعامل الحالية مع الشبكية المستأصلة.

تتيح هذه التقنيات نقل الأنسجة الرقيقة بأقل قدر من التدخل الفيزيائي، مما يقلل من احتمالية حدوث التشوه أو التلف. وقد طرأت لنا هذه الفكرة لأول مرة عندما احتجنا إلى التسجيل من أنسجة مثبتة بشكل مسطح في فأر من سلالة RD one، وهو نموذج للتنكس الشبكي، حيث تكون شبكية هذا الفأر رقيقة وهشة للغاية بسبب الفقدان الواسع للخلايا الناتج عن طفرة Chief.

سينضم إليّ باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا لتوضيح الإجراء. أولاً، يتم استئصال عيون فأر مخدر ونقل العيون إلى محلول رينجر المنظم والمؤكسج. لإزالة القرنية، يتم الإمساك بالعين عند الليمبوس باستخدام ملقط، ثم يتم القص في مسار دائري على طول ora serrata.

اسحب العدسة باستخدام الملقط لإجراء الحقن الكتلي والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. استخدم ملقطاً ذا حواف ناعمة لإزالة أكبر قدر ممكن من الجسم الزجاجي. الآن، قم بتثبيت كأس العين عن طريق إمساك الصلبة بإحكام باستخدام الملقط.

ضع مجموعة ثانية من الملاقط بين الشبكية وكأس العين. حرك الملاقط ببطء حول المحيط. اقطع العصب البصري بين الشبكية وكأس العين، ثم أزل كأس العين باستخدام المقص.

أجرِ شقوقاً من محيط الشبكية وصولاً إلى العصب البصري. وبدلاً من ذلك، لاستخدام الشبكية بأكملها، أجرِ شقوقاً من المحيط إلى منتصف المسافة باتجاه العصب البصري لتقصير الحامل. قم بإزالة الجزء الزائد باستخدام المخرطة.

بعد ذلك، قم بصقل الأسطح الخشنة باستخدام ورق صنفرة ناعم. قم بإزالة القواعد من أسفل الحلقة. اقطع الطرف الضيق لماصة بلاستيكية.

بعد ذلك، انقلي النسيج مع جزء من المحلول إلى الغشاء. قومي بإزالة المحلول تدريجياً أثناء بسط الشبكية وفرد النسيج. الآن، ثبتي الشبكية على الغشاء بحيث تكون الخلايا العقدية متجهة للأعلى.

اقطع طرف التثبيت لمحฉنة سعة 1 مل وقم بوضعها مباشرة أسفل النسيج. اسحب المكبس إلى حجم يبلغ حوالي 0.3 مل لدمج النسيج جسدياً داخل الغشاء. اسحب بعض الماصات الشعيرية المصنوعة من البوروسيليكات باستخدام مقاومة تبلغ حوالي 1 ميجا.

بعد ذلك، قم بكسر طرف كل ماصة رقعة (patch pipette) برفق. ثم، أضف 0.3 µL من محلول صبغة السلكتين (selectin) المركزة إلى 10 µL من محلول رينجر المنظم لـ HEPES. الآن، ضع الغشاء في غرفة التسجيل المروية بمحلول رينجر المنظم لـ HEPES الدافئ والمؤكسج.

قم بوضع الماصة التي تحتوي على الصبغة مقابل الغشاء المحدد الداخلي باستخدام مجهر دقيق (micromanipulator). ادفع الماصة بشكل إضافي لاختراق الغشاء المحدد الداخلي. ثم احقن محلول التلوين في موقع واحد أو عدة مواقع مستهدفة.

اترك النسيج الآن لمدة 10 دقائق ليتعافى من عملية الحقن مع مراقبته تحت إضاءة الفلورة فوق الرأسية (epi fluorescence). إذا رغبت في ذلك، انقل الغرسة إلى طبق زراعة ذو قاعدة زجاجية، مع وضع جهة الشبكية للأسفل. أضف قطرة واحدة من محلول HEPES للحفاظ على رطوبة العينة.

كذلك، ضع ثلاث نقاط من شحم الفراغ (vacuum grease) حول محيط الحلقة البلاستيكية لتثبيت القطعة المدرجة بإحكام في طبق المزرعة. انقل الطبق إلى منصة المجهر بعد التثبيت، ثم اغمر الغشاء في محلول تدرج السكروز. استخرج الغشاء من الحلقة البلاستيكية المدرجة.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام مناديل Kim wipes، ثم ضعها على قالب البارافورم بحيث تكون الشبكية متجهة للأعلى. انقل قالب البارافورم الذي يحتوي على النسيج إلى غرفة الميكروتوم المجمد (cryostat) وأضف قطرة من وسط OCT. استخدم جهاز التجميد السريع لتسريع عملية التجميد.

افصل العينة المجمدة واقلبها. الآن، قم بقص الزوائد من مادة الـ OCT المجمدة. اترك حوالي 2 mm حول العينة من ثلاث جهات، و بضعة مليمترات من الجهة التي سيتم تثبيتها في الحامل.

قم بتغطية الجانب الشبكي المكشوف بقطرة من مركب OCT مع ترك المنطقة الملتصقة خالية. قم بتجميد الغشاء الذي يحتوي على النسيج الشبكي. ضع قطرة من مركب OCT على حلقة تثبيت باردة.

أدخل العينة المجمدة فوراً في جهاز التقطيع (cryostat). قم بقطع مقاطع يتراوح سمكها من 10 إلى 20 ميكرون عند درجة حرارة 19- درجة Celsius، ثم ضعها على شرائح التصاق مغطاة بالبولي ليسين (polylysine) الدافئة. ضع الشرائح التي تحتوي على المقاطع الملتصقة على منصة تسخين بدرجة حرارة 41 درجة Celsius لمدة تتراوح من دقيقتين إلى ثلاث دقائق في الظلام.

ثم تُخزن العينات عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. توضح هذه التجربة توصيفاً سريعاً وبسيطاً للأوعية الدموية في الشبكية كشبكة معقدة من الأوعية الدموية التي تمتد عبر طبقات متعددة من الشبكية. ومن خلال الجمع بين تحميل جرعة واحدة من iso selectin مع وسم الغمر بـ sulfa rumine، يمكن تصور الأنسجة الحية ومسحها في الشبكية بشكل فوري تقريباً، حيث يمكن وسم الأوعية الدموية من الطبقة السطحية إلى الطبقة العميقة.

على عكس SRH القابل للانتشار بشكل جيد نسبياً، فإن selectin لا ينفذ جيداً عبر الغشاء المحدد الداخلي. هناك عدة مزايا للتثبيت باستخدام carbimide مقارنة بالتثبيت التقليدي باستخدام paraformaldehyde عند وسم البروتينات المشبكية، فعلى سبيل المثال، بعد فترة قصيرة من التثبيت بـ carbimide، أظهر التلوين المناعي الفلوري للعلامة المشبكية PSD 95 في IPL مظهراً نقطياً ساطعاً يتفق مع تمييز المشابك العصبية الفردية.

وفي المقابل، عند استخدام مثبت البارافورمالدهيد التقليدي، يكون تحديد المكونات المشبكية أقل وضوحاً. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة في مقاطع الشبكية المقطوعة بجهاز الميكروتوم بالتبريد (cryostat). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت الأنسجة الرقيقة على هذا الغشاء وكيفية تطبيق التصبيغ الكيميائي الخلوي على العينة.

سيستغرق الأمر 15 دقيقة لتثبيت الشبكية على المرشح.