نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحليل مقارن لتكوين معقدات MultiPro في أغشية الثايلاكويد تحت ظروف مختلفة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل أغشية الثايلاكويد من خلايا lamona التي تعرضت لظروف لاهوائية. بعد ذلك، يتم إذابة أغشية الثايلاكويد وتجزئتها باستخدام تدرج كثافة السكروز.

بعد ذلك، يتم خلط أحجام متساوية من الكسور المطلوبة وفصلها باستخدام SDS page. وفي النهاية، يتم هضم النطاقات المصبوغة بصبغة kumasi بواسطة trypsin. وفي الختام، تُحلل العينات عن طريق مطيافية الكتلة الكمية لملاحظة التغيرات في وفرة البروتين بين الكسور التي تم فحصها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل دراسات البروتوميات الكمية التي تقارن كمية محددة من البروتين، في أن نهجنا يعتمد على دمج وتحليل أحجام متساوية من العينات المجزأة. وهذا يسمح بدراسة سلوك هجرة البروتينات داخل التدرج، وعلاوة على ذلك، تحليل تركيب المجمعات المختلفة غير البروتينية في غشاء المجموعة الثالثة. فيما يتعلق بالسلالات المستخدمة، بعد استنبات سلالات chlamydomonas rein hardy وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم المحاليل المخزنة من السكروز 2 molar، و10%beta DM في الماء، و0.5 molar trice pH 8.0.

لتحضير المحاليل التالية لتدرجات كثافة السكروز من أجل إعداد التدرجات باستخدام أنابيب طرد مركزي بمقاس 14 في 89 مليمتر، ابدأ بصب 1 mL من محلول بتركيز 1.3 molar ببطء، يليه 1 mL من محلول بتركيز 1.0 molar. ثم صب 2 mL من كل من المحاليل بتركيزات 0.85، 0.7، 0.65، وأخيراً 0.4 molar. تُحفظ التدرجات طوال الليل في الغرفة الباردة لاستحثاث الظروف اللاهوائية.

في مستنبتات chlamydomonas، أدخل ماصة زجاجية في دوارق الاستزراع وقم بضخ غاز Argonne لمدة أربع ساعات مع التحريك والإضاءة المستمرة لعزل أغشية thal cord. بعد الحضن، ابدأ بترسيب الخلايا لمدة خمس دقائق عند 2,500 ×g و 4 °C. ثم أعد تعليق ركام الخلايا في 30 milliliters من محلول H one المنظم.

كرر عملية الطرد المركزي وقم بإعادة التعليق مرة أخرى. علّق الخلايا في محلول H one buffer لتحليل الخلايا، ثم مررها عبر مرذاذ بضغط نيتروجين يبلغ 1, 500 Pascals. تأكد من أن المسافة بين الكرة الخزفية والمعدن صغيرة بما يكفي لتحليل الخلايا.

ثم يتم طرد الخلايا مركزياً لمدة سبع دقائق عند 2,500 ×g ودرجة حرارة 4 °C. يجب أن يكون لون الطافي أخضر فاتحاً. إذا تمت عملية تكسير الخلايا بنجاح، يُعاد تعليق الخلايا في 50 mL من محلول H2 المنظم، ثم تُجمع في شكل حبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 32,800 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، وبعد إعادة تعليق الخلايا في 10 milliliters من H three buffer، استخدم جهاز بوتير (potter) لتجنيس الراسب المعاد تعليقه. بعد ذلك، ولتحضير تدرجات كثافة السكروز للحبل السري، ابدأ بـ 12 milliliters من الخلايا في H three buffer.

بعد ذلك، صُب ببطء طبقة مقدارها 12 milliliters من H four buffer وأكمل بـ 12 milliliters من H five buffer. استخدم H five لموازنة الدوار وقم بطرد التدرجات مركزياً لمدة ساعة واحدة عند 70,700 ×g. قم بإزالة نطاقات TH من التدرجات واستخدم حجماً مناسباً من H six buffer لتخفيفها.

يتم تدوير الخلايا بطرد مركزي عند 37,900 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. إذا لم تكن الكتلة المترسبة متماسكة، أضف المزيد من H six buffer إلى خطوة الطرد المركزي. ثم أعد التعليق.

قم بتعليق الحبال الثالوسية في حجم صغير من محلول H six المنظم لتحميل تدرج كثافة السكروز في نظام photo. أولاً، احسب كميات الحبال الثالوسية وbeta DM ومحلول H six المنظم المطلوبة لكل تدرج. وفقاً لهذه الإرشادات، سيحتوي كل تدرج على 0.8 mg/mL من الكلوروفيل في 0.9% beta DM، وسيعمل محلول H six المنظم على رفع الحجم النهائي إلى 700 µL.

لإذابة الـ thys، قم بتحضير Eloqua منفصلة تحتوي على Thylakoids beta DM ومحلول H six المنظم لكل تدرج. قم بحضن العينات على الثلج لمدة 20 دقيقة مع قلب الأنابيب كل بضع دقائق للمزج. بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً عند 14,000 ×g لمدة 10 دقائق ودرجة حرارة 4 °C.

يجب أن تكون الكتلة المترسبة صغيرة وبيضاء اللون، بينما يكون السائل الطافي أخضر داكناً. يتم تحميل السائل الطافي على تدرج الاتزان باستخدام محلول H six المنظم، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي الفائق بسرعة 134,470 ×g لمدة 14 ساعة عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، يتم التقاط صور للتدرجات ثم البدء في عملية الفصل الجزئي.

استخدم إبرة لثقب فتحة في أسفل الأنبوب وجمع الأجزاء في أنابيب سعة 500 microliter. أو استخدم عملية طبق 96 well plate. تُجهَّز العينات لـ SDS page في هضم الهلام ومطياف الكتلة وفقاً للبروتوكول النصي الموضح هنا، باستخدام النتائج المستخلصة من تحليل الدم المناعي للجزء السادس من النوع البري (wild type) والجزء 13 من delta PS one.

تم اختيار الأجزاء القصوى من A و R one لتحليل مكونات المعقد الفائق لتدفق الإلكترونات الدوري في هذا الشكل. تظهر نسب البروتين النسبية المتمثلة في النوع البري مقسومًا على delta PS one 14 N على 15 N لعدة بروتينات أساسية من PS one وبروتينات حصاد الضوء من PS one، بالإضافة إلى البروتينات المخصصة للمعقد الفائق لتدفق الإلكترونات الدوري. تشير الاختلافات في وفرة a NR one و CAS في الجزء السادس و13 من النوع البري و delta PS one إلى أنها مكونات جديدة لهذا المعقد. تعرض هنا نتائج المقارنة الكمية لهذا المعقد الفائق لتدفق الإلكترونات الدوري بين النوع البري وسلالة knockout لـ PG L one. ومن المثير للاهتمام أن HCF 1 36، و cytochrome B six، و cytochrome B six F subunit four و PET C تبدو متوفرة بكثرة في النوع البري، بينما يبدو FTSH two و cytochrome F و PET O متوفرة بكثرة في PG L one.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية مقارنة تكوين معقدات MultiPro في الأغشية السائلة ثنائية الطبقة تحت ظروف مختلفة. ضع في اعتبارك أن الخطوات الحاسمة لنجاح تحضير الأغشية السائلة ثنائية الطبقة وعزل تدفق الإلكترونات الدوري هي تكسير خلايا المعقد الفائق، وتجزيء الخلايا، واستقرار الأغشية السائلة ثنائية الطبقة. علاوة على ذلك، يجب طرد تدرجات كثافة السكروز مركزياً لمدة 12 ساعة على الأقل لتحقيق الفصل الكامل للمعقدات التمثيلية الضوئية.