نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على ¹⁵ N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل تكوين مجمعات MultiPro في أغشية الحبل الثال في ظل ظروف مختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل أغشية الثال أولا من خلايا لامونا المعرضة للظروف اللاهوائية. بعد ذلك ، يتم إذابة أغشية الحبل الصحيح وتجزئتها على تدرج كثافة السكروز.

ثم يتم خلط أحجام متساوية من الكسور المطلوبة وفصلها في صفحة SDS. أخيرا ، يتم هضم العصابات الملطخة بالكوماسي مع التربسين. في النهاية ، يتم تحليل العينات بواسطة قياس الطيف الكتلي الكمي لمراقبة التغيرات في وفرة البروتين بين الكسور التي تم فحصها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الدراسات البروتينية الكمية التي تقارن كمية محددة من البروتين هي أنه في نهجنا ، يتم دمج كميات متساوية من العينات المجزأة وتحليلها. يسمح ذلك بدراسة سلوك هجرة البروتينات داخل التدرج ، علاوة على ذلك ، لتحليل تكوين المجمعات المختلفة غير البروتينية في غشاء المجموعة الثالثة. فيما يتعلق بالسلالات المطبقة بعد زراعة الكلاميدوموناس كبح جماح السلالات الهاردي ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم محاليل مخزون من اثنين من السكروز المولي ، و 10٪ بيتا DM في الماء ، و 0.5 درجة حموضة ثلاثية مولار 8.0.

لتحضير الحلول التالية لتدرجات كثافة السكروز لإعداد التدرجات باستخدام أنابيب الطرد المركزي 14 × 89 ملم ، ابدأ بصب مليلتر واحد ببطء من محلول 1.3 مولي ، متبوعا بمليلتر واحد من محلول 1.0 مولار. ثم صب ملليلترين لكل من المحاليل 0.85 و 0.7 0.65 وأخيرا 0.4 مولية. قم بتخزين التدرجات طوال الليل في الغرفة الباردة للحث على الظروف اللاهوائية.

في مزارع الكلاميدوموناس ، أدخل ماصة زجاجية في قوارير الاستزراع وفقاعات مع الأرجون لمدة أربع ساعات مع التحريك المستمر والإضاءة لعزل أغشية الحبل الثالي. بعد الحضانة ، ابدأ بتكوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 2 ، 500 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية. ثم يعلق resus الكريات الخلية في 30 مل من H عازلة واحدة.

كرر الطرد المركزي ومرة أخرى ، resus. الخلايا في H عازلة واحدة لكسر الخلايا ، وتمريرها عبر البخاخات بضغط نيتروجين يبلغ 1 ، 500 باسكال. تأكد من أن المسافة بين الكرة الخزفية والمعدن صغيرة بما يكفي لكسر الخلايا.

ثم قم بتدوير الخلايا لمدة سبع دقائق عند 2،500 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية. يجب أن يكون لون المادة الطافية أخضر فاتح. إذا كان كسر الخلية ناجحا ، فقم بتعليق الخلايا في 50 مل من H اثنين من المخزن المؤقت وحبيبات لمدة 10 دقائق عند 32 ، 800 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية.

ثم بعد تعليق Resus للخلايا في 10 ملليلتر من H ثلاثة عازلة ، استخدم الخزاف لتجانس الحنك المعلق. بجانب تحضير تدرجات كثافة السكروز في حبل الثال. ابدأ ب 12 ملليلتر من الخلايا في H ثلاثة عازلة.

ثم صب ببطء طبقة من 12 مل من H أربعة عازلة وانتهي ب 12 مل من H خمسة عازلة. استخدم H خمسة لموازنة الدوار وجهاز الطرد المركزي للتدرجات لمدة ساعة واحدة عند 70 ، 700 ضعف الجاذبية. قم بإزالة نطاقات TH من التدرجات واستخدم حجما مناسبا من H ستة عازلة لتخفيفها.

قم بتدوير الخلايا عند 37 ، 900 مرة من الجاذبية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. إذا لم تكن الحبيبات ضيقة ، أضف المزيد من المخزن المؤقت H six إلى خطوة الطرد المركزي. ثم resus.

قم بتعليق حبال thal في حجم صغير من H ستة عازلة لتحميل تدرج كثافة السكروز لنظام الصور. أولا ، احسب كميات حبال thal و beta DM و H ستة buffers اللازمة لكل تدرج. باتباع هذه الإرشادات ، سيحتوي كل تدرج على 0.8 ملليغرام لكل مليلتر من الكلوروفيل في 0.9٪ بيتا DM و H ستة Buffer سيرفع الحجم النهائي إلى 700 ميكرولتر.

لإذابة الثيس ، قم بإعداد Eloqua منفصل مع Thylakoids beta DM و H ستة buffer لكل تدرج. احتضن العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة واقلبها كل بضع دقائق لخلطها. بعد الطرد المركزي للعينات عند 14 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة 10 دقائق وأربع درجات مئوية.

يجب أن تكون الحبيبات صغيرة وبيضاء ، وسيكون لون المادة الطافية خضراء داكنة. قم بتحميل المادة الطافية على توازن التدرجات مع عازلة H ستة وأجهزة طرد مركزي فائقة عند 134 ، 470 مرة من الجاذبية لمدة 14 ساعة وأربع درجات مئوية. بعد الدوران ، التقط صورا للتدرجات ثم للتجزئة.

استخدم إبرة لثقب ثقب في الجزء السفلي من الأنبوب وجمع الكسور في 500 أنبوب ميكرولتر. أو عملية لوحة 96 بئر. عينات SDS الصفحة في هضم الهلام وقياس الطيف الكتلي وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح هنا ، باستخدام نتائج تحليل الدم المناعي الكسر ستة من النوع البري والكسر 13 من دلتا PS واحد.

تم اختيار كسور الذروة من A و R واحد لتحليل المكونات فائقة المعقدة لتدفق الإلكترون الدوري في هذا الشكل. تظهر نسب البروتين النسبية المصورة على أنها نوع بري فوق دلتا PS واحد 14 نيوتن على 15 نيوتن للعديد من بروتينات الحصاد الخفيفة PS واحد وكذلك للبروتينات المخصصة للمركب الفائق لتدفق الإلكترون الدوري ، تشير الاختلافات في وفرة NR واحد و CAS في الكسر السادس و 13 من النوع البري و دلتا PS واحد إلى أنها مكونات جديدة لهذا المركب الموضح فيما يلي نتائج المقارنة الكمية لمركب تدفق الإلكترون الدوري هذا بين النوع البري و PG L سلالة خروج المغلوب الواحدة. ومن المثير للاهتمام ، أن HCF 1 36 ، والسيتوكروم B ستة ، والسيتوكروم B ستة F الوحدة الفرعية الرابعة ، ويبدو أن PET C قد تم إثرائها في النوع البري بينما يبدو أن FTSH الثاني والسيتوكروم F و PET O قد تم إثرائهم في PG L واحد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية مقارنة تكوين مجمعات MultiPro في الأغشية السائلة في ظل ظروف مختلفة. ضع في اعتبارك أنه من أجل التحضير الناجح للأغشية السائلة وعزل تدفق الإلكترون الدوري ، فإن تعطيل الخلايا فائق التعقيد ، وفخار الخلايا ، وتشكيل الأغشية السائلة هي الخطوات الحاسمة. علاوة على ذلك ، يجب أن تكون تدرجات كثافة السكروز تعمل بجهاز طرد مركزي لمدة 12 ساعة على الأقل لتحقيق الفصل الكامل لمجمعات التمثيل الضوئي.