تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

الهدف العام من طريقة تعدد الإرسال المحسنة هذه هو زيادة عدد عينات البروتين التي يمكن تحليلها في وقت واحد مع تقليل خطأ العينة ووقت الأداة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية والأمراض الأخرى المرتبطة بالعمر والسرطان المرتبطة بالتسبب في المرض والتقدم والتشخيص والتشخيص والأهداف العلاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء لقطة شاملة لتغيرات البروتين عبر العديد من الحالات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمرض الزهايمر في نموذج الفئران ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على عينات الأنسجة من مريض الزهايمر أو مجموعة من الاضطرابات الأخرى. بشكل عام ، سيجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة نظرا لوجود العديد من العينات للتعامل معها في وقت واحد في إطار زمني قصير. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أنه يمكن دمج الأستلة مع وضع العلامات المتساوية لنترات البروتين مما حفزنا على جعل هذه التقنية تعمل عالميا لجميع الببتيدات.

ستقوم هذه الدراسة بتحليل أنسجة الدماغ والقلب والكبد من نموذج الفئران لمرض الزهايمر وعناصر التحكم من النوع البري. انقل 60 إلى 90 ملليغرام من كل عينة من الأنسجة إلى أنبوب التحلل ، وأضف 500 ميكرولتر من PBS مع ثمانية يوريا مولية. تجانس العينات باستخدام الخالط الميكانيكي.

قم بإزالة الأنسجة المتجانسة من أنبوب التحلل ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. اشطف أنبوب التحلل ب 100 إلى 500 ميكرولتر من PBS بثمانية يوريا مولية واجمع محلول الشطف مع تجانس الأنسجة. الطرد المركزي الأنسجة متجانسة لمدة 15 دقيقة.

قبض المادة الطافية من كل عينة. بعد إجراء مقايسة BCA لتحديد تركيز البروتين ، أضف 100 ميكروغرام من البروتين من كل عينة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة بشكل فردي. أضف ديثيوثريتول إلى كل عينة.

وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. أضف اليودوأسيتاميد ، IAM ، إلى كل عينة ، واحتضن على الجليد في الظلام لمدة ساعتين. بعد ذلك ، أضف L-cysteine إلى كل عينة ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، أضف محلول تريس مع كلوريد الكالسيوم لتخفيف اليوريا إلى تركيز نهائي من ضرسين. أضف L1 tosilimitophenylethylcholer ميثيل كيتون التربسين المعالج بكل عينة. وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بإخماد هضم البروتين عن طريق تجميد العينة في النيتروجين السائل وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. قبل وضع العلامات على ثنائي الميثيل ، يتم تحلية عينات الببتيد ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، وتجفيفها عن طريق الطرد المركزي الفراغي. لبدء إجراء وضع العلامات على ثنائي الميثيل ، أعد تكوين الببتيدات في حمض الخليك 1٪ المذاب في HPLC أو ماء من الدرجة النانوية.

قم بإزالة جزء 50 ميكروغرام من كل عينة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بتخزين ما تبقى من الببتيدات المعاد تكوينها عند سالب 80 درجة مئوية للتجارب المستقبلية. في الخطوات التي سيتم عرضها بعد ذلك ، من الأهمية بمكان إضافة الكواشف بسرعة حتى تحدث تفاعلات التمكين الكيميائية لنفس القدر من الوقت لجميع العينات.

أضف ثمانية ميكرولترات من محلول الفورمالديهايد 60 ملليمولار إلى العينات لوضع العلامات بثنائي الميثيل الخفيف. أضف ثمانية ميكرولترات من محلول فورمالديهايد 60 ملليمولار من الكربون 13 ديوتيريوم المسمى إلى العينات لوضع العلامات بثنائي الميثيل الثقيل. أضف ثمانية ميكرولترات من 24 مللي مولار سيانوبوروهيدريد الصوديوم إلى العينات المسمى بثنائي الميثيل الخفيف.

أضف ثمانية ميركوليتر من 24 مللي مولار من السيانوبوروديرايد الصوديوم إلى العينات المصنفة بثنائي الميثيل الثقيل. قم بتدوير العينات ، ثم رجها برفق على شاكر أنبوبي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإخماد التفاعلات بإضافة 16 ميكرولتر من الأمونيا بنسبة 1٪ لمدة خمس دقائق.

أعد تحمض مخاليط التفاعل بإضافة ثمانية ميكرولترات من حمض الفورميك 5٪. اجمع بين الببتيدات ثنائية الميثيل الخفيفة والثقيلة لتوليد ما مجموعه ست عينات. قم بإجراء تحلية العينة كما هو موضح في بروتوكول النص.

وتجفيف العينات عن طريق الطرد المركزي بالفراغ. لتكون علامات متساوية الضغط للعينات ثنائية الميثيل ، أولا ، أعد تكوين 100 ميكروغرام من الببتيدات ثنائية الميثيل وبيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم ، أو المخزن المؤقت TEAB. بعد ذلك ، قم بإعداد الكواشف متساوية الضغط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة العلامات متساوية الضغط.

أضف الحجم المناسب ، في هذه الحالة ، 41 ميكرولترا من كاشف وضع العلامات متساوي الضغط المذاب إلى كل عينة من عينات الببتيد ، والدوامة لمدة 10 ثوان تقريبا. رج العينات على شاكر أنبوب الطرد المركزي الدقيق لمدة ساعة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. لإخماد التفاعلات، أضف 8 ميكرولترات من الهيدروكسيل لامين إلى كل عينة.

واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتجميع العينات الست المصنفة في خليط واحد وتحلىها. تحضير الببتيدات للكروماتوغروفيا السائلة عن طريق إعادة تكوين الببتيدات في ماء من درجة قياس الطيف الكتلي مع حمض الفورميك 0.1٪.

أضف الببتيدات المعاد تكوينها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على مرشح 0.65 ميكرومتر. وجهاز الطرد المركزي عند 12 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة الفلتر وتجاهله.

انقل الببتيدات المفلترة إلى قارورة أخذ العينات الآلية. حقن ستة ميكرولترات من كل عينة فصيل تبادل كاتيوني قوي في عمود فخ. حزمة إلى سنتيمترين مع الكربون 18 المواد.

قم بتشغيل طرق مطياف الكتلة للفصل التحليلي والحصول على البيانات. تم إجراء تحليل cPilot 12-plex لأنسجة الدماغ والقلب والكبد من نموذج الفئران لمرض الزهايمر وضوابط النوع البري. أظهرت بيانات السلائف الببتيدات ثنائية الميثيل الخفيفة والثقيلة التي تمثلها القمم عند m / z 643.854 و 647.875.

تم اختيار هذه الببتيدات ، وعزلها بشكل مستقل ، وتجزئتها مع التفكك الناجم عن التواطؤ لتوليد هذه الأطياف. أشارت نتائج البحث إلى أن القمم تنتمي إلى ببتيد من بروتين فوسفوغليسرات كيناز واحد. تم عزل هذه القمم بشكل أكبر من أجل قياس الطيف الكتلي الترادفي للتفكك التوازفي عالي الطاقة ، ولوحظت أيونات المراسل كما هو موضح.

كلتا المجموعتين من أطياف قياس الطيف الكتلي ثلاثية المراحل ضرورية للحصول على معلومات حول العينات ال 12. في هذا المثال ، تتشابه نسب مرض الزهايمر مع نسب التحكم في أيونات النوع البري عبر التكرارات البيولوجية لأنسجة الدماغ والكبد والقلب. تشير قيم تغيير الطية لكل مقارنة إلى أن مستويات الفوسفوجليرات كيناز في الدماغ والقلب أعلى في الفئران المصابة بمرض الزهايمر ولكنها أقل في الكبد.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس ساعات تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر عند التعامل مع العينة. مدمجة في هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق الفصل مثل التبادل الكاتيوني القوي أو تجزئة الأس الهيدروجيني العالي من أجل زيادة عمق الفرد اليومي والتغطية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحسين مضاعفة الإرسال باستخدام C-Pilot.