تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

الهدف العام من هذه الطريقة المتعددة المجمعة والمطورة هو زيادة عدد عينات البروتين التي يمكن تحليلها في وقت واحد مع تقليل خطأ العينة وزمن استخدام الجهاز. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات الشيخوخة، والأمراض التنكسية العصبية، وغيرها من الأمراض المرتبطة بالعمر، والسرطان، والتي تتعلق بنشوء المرض، وتطوره، وتشخيصه، والتنبؤ بسير المرض، والأهداف العلاجية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في القدرة على تكوين صورة شاملة للتغيرات البروتينية عبر العديد من الحالات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول مرض الزهايمر في نموذج فأر، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على عينات أنسجة مأخوذة من مرضى الزهايمر أو مجموعة من الاضطرابات الأخرى. وبشكل عام، سيجد الأشخاص الجدد في هذه الطريقة أنها صعبة لأن هناك عدة عينات يجب التعامل معها في وقت واحد وفي إطار زمني قصير. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن عملية الأستلة يمكن دمجها مع الوسم المتساوي الكتلة لنيترتة البروتين، مما حفزنا على جعل هذه التقنية تعمل بشكل شامل لجميع الببتيدات.

ستقوم هذه الدراسة بتحليل أنسجة الدماغ والقلب والكبد من نموذج فأر مصاب بمرض ألزهايمر ومجموعة ضابطة من النوع البري. انقل من 60 إلى 90 mg من كل عينة نسيجية إلى أنبوب تحلل، وأضف 500 µL من PBS مع urea بتركيز 8 M. قم بتجنيس العينات باستخدام مجنس ميكانيكي.

أخرج متجانس الأنسجة من أنبوب التحلل وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. اشطف أنبوب التحلل باستخدام 100 إلى 500 µL من PBS مع Urea بتركيز 8 M، ثم ادمج محلول الشطف مع متجانس الأنسجة. قم بطرد متجانس الأنسجة مركزياً لمدة 15 دقيقة.

اجمع الطافي من كل عينة. بعد إجراء مقايسة BCA لتحديد تركيز البروتين، أضف 100 micrograms من البروتين من كل عينة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مُصنفة بشكل فردي. أضف dithiothreitol إلى كل عينة.

ثم تُحضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. يُضاف iodoacetamide، المعروف بـ IAM، إلى كل عينة، وتُحضن على الثلج في الظلام لمدة ساعتين. بعد ذلك، يُضاف L-cysteine إلى كل عينة، وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، أضف منظم tris مع كلوريد الكالسيوم لتخفيف اليوريا إلى تركيز نهائي قدره two molar. أضف tpsilimitotophenylethylcholer methyl ketone-treated trypsin L1 إلى كل عينة، ثم قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، يتم إيقاف عملية هضم البروتين عن طريق التجميد السريع للعينة في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة 80- درجة مئوية لحين المعالجة اللاحقة. وقبل البدء في عملية الوسم بالثنائي ميثيل، يتم إزالة الأملاح من عينات الببتيد، كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، وتُجفف بواسطة الطرد المركزي بالتفريغ. لبدء إجراء الوسم بالثنائي ميثيل، يتم إعادة إذابة الببتيدات في حمض أسيتيك بتركيز 1% مذاب في ماء بدرجة HPLC أو ماء nanopure.

انقل جزءاً مقداره 50 µg من كل عينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL. قم بتخزين المتبقي من الببتيدات المعاد تشكيلها عند درجة حرارة 80- °C لاستخدامها في التجارب المستقبلية. في الخطوات التي سيتم عرضها تالياً، من الضروري إضافة الكواشف بسرعة لضمان حدوث التفاعلات الكيميائية المُمكّنة في نفس المدة الزمنية لجميع العينات.

أضف 8 µL من محلول فورمالدهيد بتركيز 60 mM إلى العينات المخصصة للوسم بالدمثيلة الخفيفة. أضف 8 µL من محلول فورمالدهيد بتركيز 60 mM والموسوم بالكربون 13 والدوتيريوم إلى العينات المخصصة للوسم بالدمثيلة الثقيلة. أضف 8 µL من سيانوبوروهيدريد الصوديوم بتركيز 24 mM إلى العينات الموسومة بالدمثيلة الخفيفة.

أضف ثمانية ميكرولتر من سيانوبوروهيدريد الصوديوم بتركيز 24 millimolar إلى العينات المحددة بالديمثيلة الثقيلة. قم برج العينات باستخدام جهاز Vortex، ثم رجها بلطف على هزاز أنابيب لمدة 10 دقائق تقريبًا في درجة حرارة الغرفة. أوقف التفاعلات بإضافة 16 ميكرولتر من الأمونيا بتركيز 1% لمدة خمس دقائق.

أعد تحميض مخاليط التفاعل بإضافة 8 µL من حمض الفورميك بتركيز 5%. ادمج الببتيدات ذات المجموعات الميثيلية الخفيفة والثقيلة لإنتاج ست عينات إجمالاً. قم بإزالة الأملاح من العينات كما هو موضح في البروتوكول النصي.

ثم يتم تجفيف العينات عن طريق الطرد المركزي الفراغي. لبدء عملية الوسم متساوي الكتلة (isobaric tagging) للعينات المدمجلة (dimethylated)، يتم أولاً إعادة تشكيل 100 micrograms من الببتيدات المدمجلة في محلول بيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم، أو منظم TEAB. بعد ذلك، يتم تحضير الكواشف متساوية الكتلة وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة أدوات الوسم متساوي الكتلة.

أضف الحجم المناسب، وفي هذه الحالة 41 µL من كاشف الوسم متساوي الكتلة المذاب إلى كل عينة من الببتيدات، ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا. رج العينات على هزاز أنابيب الطرد المركزي الدقيق لمدة ساعة واحدة تقريبًا في درجة حرارة الغرفة. ولإيقاف التفاعلات، أضف 8 µL من الهيدروكسيلامين إلى كل عينة.

ثم تُحضن العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تُجمع العينات الست المحددة في خليط واحد وتتم إزالة الأملاح منها. تُجهز الببتيدات للكروماتوغرافيا السائلة عن طريق إعادة تكوين الببتيدات في ماء بدرجة نقاء مطيافية الكتلة مع 0.1% formic acid.

أضف الببتيدات المعاد تشكيلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على مرشح 0.65 micrometer. ثم قم بالطرد المركزي عند 12,000 ×g لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المرشح والتخلص منه.

انقل الببتيدات المُرشحة إلى قارورة جهاز أخذ العينات التلقائي. قم بحقن 6 µL من كل عينة من أجزاء التبادل الكاتيوني القوي في عمود حبس. قم بتعبئة العمود حتى طول 2 cm بمادة carbon 18.

قم بتشغيل طرق الفصل التحليلي وطرق استحصال البيانات الخاصة بمطياف الكتلة. تم إجراء تحليل cPilot بـ 12 ضيغمة (12-plex) لأنسجة الدماغ والقلب والكبد من نموذج فأر مصاب بمرض الزهايمر ومجموعات ضابطة من النوع البري. وأظهرت بيانات السلائف ببتيدات مدمجلة ثنائي الميثيل خفيفة وثقيلة ممثلة بالقمم عند m/z 643.854 و647.875.

تم اختيار هذه الببتيدات وعزلها بشكل مستقل وتجزئتها باستخدام التفكك المستحث بالتصادم لتوليد هذه الأطياف. وأشارت نتائج البحث إلى أن القمم تعود لببتيد من بروتين phosphoglycerate kinase one. تم عزل هذه القمم بشكل أكبر لإجراء مطيافية الكتلة الترادفية بالتفكك التصادمي عالي الطاقة، ولوحظت الأيونات المراسلة كما هو موضح.

تعد كلتا المجموعتين من أطياف مطيافية الكتلة ثلاثية المراحل ضروريتين للحصول على معلومات حول العينات الـ 12. في هذا المثال، تتشابه نسب الأيونات بين مرض الزهايمر ومجموعة التحكم من النوع البري عبر المكررات البيولوجية الاثنين لأنسجة الدماغ والكبد والقلب. وتشير قيم التغير المضاعف لكل مقارنة إلى أن مستويات phosphoglyerate kinase one في الدماغ والقلب أعلى في فئران مرض الزهايمر ولكنها أقل في الكبد.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمس ساعات تقريباً إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي الحذر عند التعامل مع العينات. ويمكن دمج طرق فصل في هذا الإجراء، مثل التبادل الكاتيوني القوي أو التجزئة عند أس هيدروجيني (pH) مرتفع، وذلك لزيادة عمق وتغطية التحليل اليومي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحسين تعدد إرسال العينات باستخدام C-Pilot.