حقن النظامية من الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الفئران مع EAE المزمن

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توصيل الخلايا السلفية الجذعية العصبية إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن في الوريد في الفئران المصابة بالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وهو نموذج مرضي يحاكي التصلب المتعدد. يتم تحقيق ذلك عن طريق اشتقاق الخلايا السلفية الجذعية العصبية أولا ، أو الشخصيات غير القابلة للعب من المنطقة تحت البطينية في الدماغ من الفئران البالغة. الخطوة الثانية هي وضع علامات وراثية على الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام تقنية النواقل الفيروسية لتحديد الخلايا في الجسم الحي وتتبعها.

بعد ذلك ، يتم فصل المجالات العصبية المتكاثرة في معلق خلية واحدة ، ويتم تعليقها بالكثافة المطلوبة وحقنها في وريد الذيل لفئران EAE في ذروة المرض. في النهاية ، يتم إجراء أمراض الأعضاء والأنسجة بعد الوفاة والكيمياء المناعية لتحديد وتوصيف توزيع البقاء على قيد الحياة وتكامل الخلايا الجذعية المحقونة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة طفيفة التوغل وآمنة وفعالة لزرع الخلايا الجذعية والسلفية في الجهاز العصبي الالتهابي.

تساعد هذه الطريقة في الإجابة على ثلاثة أسئلة رئيسية تتعلق بسلامة وفعالية الخلايا الجذعية المحقونة جهازيا في نماذج الأمراض الالتهابية للجهاز العصبي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا بشكل خاص للعلماء الشباب لأنه يساعد في فهم الخطوات التجريبية الحاسمة من عزل الخلايا الجذعية للدماغ إلى التحضير للحقن الجهازي في نموذج فأر للتصلب المتعدد ، والخطوة الأولى هي جمع جميع الحلول اللازمة للتشريح. باستخدام تقنية معقمة مناسبة.

ضع دماغا معزولا حديثا على مصفوفة تقطيع الدماغ. استخدم شفرات حلاقة لإنتاج أقسام إكليلية ، على بعد ملليمترين من القطب الأمامي للدماغ ، باستثناء المسارات البصرية وثلاثة ملليمترات خلف القطع السابق. ضع شرائح الدماغ على طبق بتري نظيف واعمل تحت مجهر تشريح لعزل أنسجة المنطقة تحت البطينية.

بعد فرم الأنسجة ، أضفها إلى 30 مل من محلول الهضم المحضر والمفلتر مسبقا. يرج برفق ويحتضن لمدة 30 دقيقة مع رج كل 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من النمو الكامل.

متوسط أو CGM عن طريق سحب العينات. أولا باستخدام P 1000 ، ثم باستخدام ماصة P 200. بمجرد الوصول إلى تعليق خلية واحدة ، قم بإحضاره حتى خمسة ملليلتر باستخدام CGM ونقله إلى قارورة جديدة.

ضع الخلايا في حاضنة واسمح للمناطق العصبية بالتشكل لمدة خمسة إلى سبعة أيام. عندما تصبح جاهزا ، اجمع التعليق في أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحنك في 200 ميكرولتر من المراقبة المستمرة للجلوكوز

افصل المجالات العصبية ميكانيكيا عن طريق تمريرها عبر طرف ماصة P 200 من 100 إلى 150 مرة. ارفع التعليق إلى ملليلتر واحد مع CGM. بعد ذلك ، قم بتخفيف التعليق بدقة.

امزج الحجم المناسب مع بقعة حيوية واملأ مقياس الخلوي الدموي لتحديد عدد الخلايا. أعد تعليق الخلايا بالتركيز الصحيح وانقلها إلى قارورة جديدة. كرر هذه الخطوات كل أربعة إلى خمسة أيام للمساعدة في تحديد الخلايا المزروعة في الجسم الحي.

يتم تحويل الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام ناقلات فيروسية مشفرة لجينات المراسل بعد 72 ساعة من نقل NPC. يمكن التحقق من التعبير عن جينات مراسل الفلورسنت إما عن طريق التألق المناعي أو قياس التدفق الخلوي. عندما تصبح جاهزا ، قم بحصاد GFP الذي يعبر عن المجالات العصبية عن طريق الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تفكك الخلايا الإجمالية واحتضنه لمدة 10 دقائق. استرجع الخلايا وأعد تعليقها برفق للحصول على معلق خلية واحدة. الحرص على تجنب فقاعات الهواء.

بعد عد الخلايا وتخفيفها ، احتفظ بتعليق الخلية على الجليد حتى يصبح جاهزا للاستخدام. بمجرد أن تصبح المجالات العصبية جاهزة ، استرجع الفئران التي تم إعدادها مسبقا لتكون بمثابة نموذج فأر للجهاز العصبي المركزي. يجب أن يحدث علاج الضرر في ذروة التعبير عن المرض.

ابدأ بوضع الفئران في صندوق تسخين لمدة 10 دقائق تقريبا للسماح لوريد الذيل بالتمدد. عندما تصبح جاهزا ، انقل فأرا واحدا من صندوق التسخين إلى مصفاة الماوس. أغلق التقييد لتقييد الحركة وعزل الذيل.

تعقيم منطقة الحقن على الذيل بمحلول موضعي مناسب. املأ حقنة الأنسولين سعة مليلتر واحد ب 150 ميكرولتر من تعليق الخلية وتأكد من إزالة جميع الفقاعات. حدد موقع الوريد على السطح الظهري للذيل وضع الإبرة موازية للوريد في الجزء السفلي الأوسط من الذيل.

هنا الوريد أقرب إلى سطح الجلد. وبالتالي تسهيل الإجراء. أدخل الإبرة برفق في الوريد لضمان موضعها الصحيح عن طريق سحب بضعة ميكرولترات من الدم.

ثم حقن المحلول ببطء في وريد الذيل بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة والضغط لبضع ثوان لإبطاء النزيف. ضع الماوس في قفص جديد وراقبه حتى يتعافى. كرر نفس الإجراء لجميع الفئران في نقاط زمنية تجريبية محددة مسبقا.

يتم جمع العينات من المعالجة والمراقبة وتحليلها لتحديد تسلل وتكامل الشخصيات غير القابلة للعب في الجهاز العصبي المركزي والأنسجة الأخرى عند التكاثر كمجالات عصبية تعبر الشخصيات غير القابلة للعب عن علامات النشاط الانقسامي مثل phospho hisone H ثلاثة كما هو موضح باللون الأخضر والخلايا العصبية غير المتمايزة مثل العش الموضح باللون الأحمر عند طلاءها في ظل ظروف التمايز المناسبة ، تعبر الشخصيات غير القابلة للعب عن علامات نموذجية للسلالات العصبية الثلاثة مثل علامة astroglia ، و GFAP ، والعلامة العصبية ، والبروتين الأنبوبي الصغير المرتبط بالثاني ، وعلامات oligo dyl الدبقية O four ونواة البروتين الأساسية المايلين ملطخة ب DPI غير المتمايزة MPCs التي يجب أن تكون فعالة علاجيا بعد الزرع يجب أن تعبر عن جزيئات التصاق سطح الخلية التي تشمل CD 44 والوحدة الفرعية ألفا الأربعة من المستضد الرابع المتأخر جدا. توضح هذه الأمثلة أن الشخصيات غير القابلة للعب المحولة تعبر عن GFP ، سواء كمجالات عصبية متكاثرة أو عند التمايز في المختبر عند انسحاب عامل النمو. تم العثور على الشخصيات غير القابلة للعب الزاوية، التي يتم حقنها بشكل منهجي في فئران EAE بشكل حصري تقريبا في المناطق المحيطة بالأوعية الدموية من تلف الجهاز العصبي المركزي المشار إليها بواسطة الأسهم في كل من الدماغ والحبل الشوكي حتى 45 يوما بعد الزرع.

الخطوة الرئيسية في هذا الإجراء هي تفكك الخلايا. في الواقع ، يعد تحضير تعليق الخلية المفردة أمرا أساسيا لتجنب المشابك أو الركام التي قد تؤدي إلى انسداد الأوعية الدموية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في الطب التجديدي الذين كانوا يستكشفون بروتوكولات طفيفة التوغل للتوصيل الفعال للخلايا الجذعية غير الدورية إلى دماغ المختبر الصغيرة ، ومن منظور قريب البشر المصابين بالأمراض العصبية الالتهابية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن يكون لديك فهم واضح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها المتعلقة بالعزل والتحضير والحقن الجهازي لمواقف الأنسجة المحددة في المختبر المصابة بأمراض الدماغ.